一種抗前列腺癌貽貝糖蛋白及其制備和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種貽貝糖蛋白及其制備方法和用途，本發(fā)明所述貽貝糖蛋白是貽貝軟組織通過(guò)組織勻漿、緩沖液提取、離子交換柱層析、凝膠柱層析和蛋白快速純化系統(tǒng)純化、濃縮、再經(jīng)冷凍干燥步驟得到。本發(fā)明的貽貝糖蛋白的分子量約為16.9kDa，糖和蛋白含量分別為23.54%和76.46%，含有O-糖苷鍵和N-糖苷鍵，單糖的組成包括D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-果糖和D-甘露糖，相應(yīng)比例為1.00：2.01：6.93：7.27：4.05。蛋白質(zhì)由15中氨基酸組成。該貽貝糖蛋白活性顯著，臨床上可以作為一種新生血管抑制劑使用，可用于前列腺癌等腫瘤疾病的治療。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種抗前列腺癌貽貝糖蛋白及其制備和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于化學(xué)工程【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種抗前列腺癌貽貝糖蛋白及其制備和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]貽貝是雙殼類(lèi)軟體動(dòng)物，也是我國(guó)重要的養(yǎng)殖貝類(lèi)。在我國(guó)北方貽貝俗稱(chēng)海紅，在南方俗稱(chēng)青口，其干制品俗稱(chēng)淡菜，是藥食兩用的著名海產(chǎn)之一。中國(guó)出產(chǎn)的貽貝有紫貽貝、厚殼貽貝、翡翠貽貝等幾種。近年來(lái)，部分研究人員對(duì)貽貝活性物質(zhì)進(jìn)行了研究，如利用貽貝制備功能肽、活性多糖，利用貽貝脂溶性成分制備抗炎藥物等，為貽貝的高值化利用提供了理論和技術(shù)支持。近年來(lái)，糖蛋白類(lèi)成分顯著的生物活性受到持續(xù)關(guān)注，同時(shí)該類(lèi)物質(zhì)也顯示出在創(chuàng)新藥物及保健食品開(kāi)發(fā)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0003] 申請(qǐng)人:在檢索過(guò)程發(fā)現(xiàn)以貽貝為原料，利用水提、離子交換樹(shù)脂柱層析、凝膠柱層析和蛋白快速純化系統(tǒng)制備糖蛋白的研究處于空白階段，對(duì)于其在抗前列腺癌領(lǐng)域的應(yīng)用也尚未見(jiàn)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的在于公開(kāi)一種貽貝糖蛋白，本發(fā)明的目的還在于公開(kāi)該貽貝糖蛋白的制備方法，本發(fā)明的目的還在于公開(kāi)該貽貝糖蛋白在制備抑制血管生成、防治前列腺癌的藥物中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為:一種抗前列腺癌貽貝糖蛋白及其制備方法和應(yīng)用，其特征在于包括以下步驟:
(I)勻衆(zhòng):新鮮貽貝洗凈、去殼，軟組織勻衆(zhòng)2~4 min,按lg: 10~15mL比例加入Tris-HCl 緩沖液(pH6.8，0.05 mol/L)，O ~4°C攪拌提取 36 ~48 h，于 10000 ~12000 r/min、0~4°C離心10~20 min,收集上清液、濃縮,蒸懼水透析48 h,冷凍干燥,得粗糖蛋白。
[0006](2)陰離子交換層析:粗糖蛋白用Tris-HCl緩沖液(ρΗ6.8,0.05 mol/L)配成濃度30~50mg/mL溶液,經(jīng)0.45 μ m微孔濾膜過(guò)濾,加入到陰離子交換樹(shù)脂柱(1.6 cmX 80 cm),依次用含0、0.3和0.5 mol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液洗脫，用考馬斯亮蘭法和苯酚-硫酸法示蹤檢測(cè)蛋白質(zhì)含量和糖含量，根據(jù)洗脫曲線收集糖蛋白組分，將洗脫液濃縮，用15~20倍蒸餾水透析36~48 h (蒸餾水每12 h更換一次)，冷凍干燥，檢測(cè)其前列腺癌細(xì)胞增值抑制活性，活性最強(qiáng)組分為離子交換糖蛋白。
[0007](3)凝膠柱層析:將離子交換糖蛋白用Tris-HCl緩沖液(ρΗ6.8,0.05 mol/L)配成濃度20~30mg/mL溶液，經(jīng)0.45 μ m微孔濾膜過(guò)濾,加入到凝膠柱(1.0 cmX 50 cm),用Tris-HCl緩沖液(pH6.8,0.05 mol/L)洗脫，考馬斯亮蘭法和苯酚-硫酸法示蹤檢測(cè)蛋白質(zhì)含量和糖含量，根據(jù)洗脫曲線收集糖蛋白組分，將洗脫液濃縮，用15~20倍蒸餾水透析36~48 h (蒸餾水每12 h更換一次)，冷凍干燥，檢測(cè)其前列腺癌細(xì)胞增值抑制活性，活性最強(qiáng)組分為凝膠層析糖蛋白。
[0008](4)精制:將凝膠層析糖蛋白用Tris-HCl緩沖液(ρΗ6.8,0.05 mol/L)配成濃度10~15mg/mL溶液，經(jīng)0.45 μ m微孔濾膜過(guò)濾，利用蛋白快速純化系統(tǒng)(AKTA purifier 100)制備，收集洗脫峰，冷凍干燥得糖蛋白。
[0009]作為優(yōu)選，所述的步驟(1)中的貽貝為厚殼貽貝iMytiIus coruscus )。
[0010]作為優(yōu)選，所述的步驟(2)中的陰離子交換樹(shù)脂為DEAE Sepharose F F。
[0011]作為優(yōu)選,所述的步驟(3)中的凝膠為Sepharose 4B。
[0012]作為優(yōu)選,所述的步驟(4)中的蛋白快速純化系統(tǒng)的條件:色譜柱為SuperdexTM75制備柱(瑞典安瑪西亞公司)，洗脫劑為雙蒸水，進(jìn)樣量20 μ L，流速0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng) 280 nm。
[0013]本發(fā)明所得的貽貝糖蛋白的糖和蛋白含量分別為23.54%和76.46% ;經(jīng)GC/MS測(cè)定，糖蛋白中單糖的組成包括D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-果糖和D-甘露糖，相應(yīng)比例為1.00:2.01:6.93:7.27:4.05 ;經(jīng)氨基酸分析儀分析，糖蛋白中的蛋白由15中氨基酸組成；SDS-PAGE電泳分析分子量為16.9 kDa ;經(jīng)堿處理、PNGase F酶解、β -降解反應(yīng)和紅外光譜分析該貽貝糖蛋白含有O-糖苷鍵和N-糖苷鍵；HPLC分析其半數(shù)降解溫度為63.5 ° C。
[0014]本發(fā)明所得的貽貝糖蛋白在I μ g/只、10 μ g/只、和100 Ug/只的濃度下，對(duì)雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成的抑制率分別為52.8%,75.6%和94.1% ;對(duì)前列腺癌細(xì)胞DU-145和PC-3細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC5tl)分別為0.12 mg/mL和0.08 mg/mL，該貽貝糖蛋白活性顯著，可用于制備抗前列腺癌藥物。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1粗糖蛋白提取物在DEAE Sepharose F F層析柱上的洗脫曲線；
圖2離子交換層析活性組分在S^harose 4B層析柱上的洗脫曲線；
圖3凝膠層析活性組分在蛋白快速純化系統(tǒng)(AKTA purifier 100)上的洗脫曲線；
圖4貽貝糖蛋白的SDS-PAGE圖。

【具體實(shí)施方式】
[0016]下述實(shí)驗(yàn)例和實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明但不限于本發(fā)明。
[0017]實(shí)施例1:
本發(fā)明所用的儀器設(shè)備:
AKTA purifier 100 (瑞典安瑪西亞公司)；
Agilent 1200高效液相色譜(美國(guó)Agilent公司)；
Mill1-Q system (美國(guó) Millipore 公司)；
DEAE Sepharose F.F 和 Sepharose 4B 柱層析設(shè)備(瑞典 Pharmacia 公司)；
FDU-1200小型冷凍干燥機(jī)(日本EYELA公司)；
DS-21高速組織搗碎機(jī)(上海標(biāo)本模型廠)；
UV-22000型紫外分光光度計(jì)(尤尼柯儀器(上海)有限公司)；
DYY-22C電泳儀(北京六一儀器廠)；
He1-VAP旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(德國(guó)Heidolph公司)；BSZ-1OO型自動(dòng)部分收集器(上海琪特分析儀器有限公司)
LXB型離心機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器廠)；
SuperdexTM 75制備柱(瑞典安瑪西亞公司)
本發(fā)明所使用的試劑及原料:
PNGase F (美國(guó) Sigma 公司)；
蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品(上海源聚生物技術(shù)有限公司)；
牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)(上海源聚生物技術(shù)有限公司)；
其它試劑均為分析純，均由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。
[0018]一種貽貝糖蛋白及其制備方法和應(yīng)用，制備工藝流程如下:貽貝一軟組織一組織勻漿一緩沖液提取一陰離子交換層析一葡聚糖凝膠層析一蛋白快速純化系統(tǒng)精制一理化性質(zhì)、活性分析。
[0019]具體步驟為:
(I)勻衆(zhòng):新鮮厚殼貽貝diiAas Corw1SCU1S)洗凈、去殼,軟組織勻衆(zhòng)3 min,按Ig:15mL 比例加入 Tris-HCl 緩沖液(pH6.8，0.05 mol/L)，4°C攪拌提取 48 h，于 12000 r/min、4°C離心10 min，收集上清液、濃縮，于15倍蒸餾水透析48 h (蒸餾水每12 h更換一次)，冷凍干燥，得粗糖蛋白。
[0020](2)陰離子交換層析:粗糖蛋白用Tris-HCl緩沖液(pH6.8,0.05 mol/L)配成濃度30 mg/mL溶液,經(jīng)0.45 μ m微孔濾膜過(guò)濾,加入到DEAE Sepharose F F柱(1.6 cm X 80cm)，依次用含0,0.3和0.5 mol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液洗脫，用考馬斯亮蘭法和苯酚-硫酸法示蹤檢測(cè)蛋白質(zhì)含量和糖含量，根據(jù)洗脫曲線收糖蛋白組分，將洗脫液濃縮，于15倍蒸餾水透析48 h (蒸餾水每12 h更換一次)，冷凍干燥，檢測(cè)其前列腺癌細(xì)胞增值抑制活性，活性最強(qiáng)組分(MGP-1II)為離子交換糖蛋白(圖1)。
[0021](3)凝膠柱層析:將離子交換糖蛋白(MGP-1II)用Tris-HCl緩沖液(ρΗ6.8,0.05mol/L)配成濃度25 mg/mL溶液,經(jīng)0.45 μ m微孔濾膜過(guò)濾,加入到Sepharose 4B (1.0cmX 50 cm)，用Tris-HCl緩沖液(pH 6.8,0.05 mol/L)洗脫，考馬斯亮蘭法和苯酚-硫酸法示蹤檢測(cè)蛋白質(zhì)含量和糖含量，根據(jù)洗脫曲線收集糖蛋白組分，將洗脫液濃縮，于15倍蒸餾水透析48 h (蒸餾水每12 h更換一次)，冷凍干燥，檢測(cè)其前列腺癌細(xì)胞增值抑制活性，活性最強(qiáng)組分(MGP-1I1-B)為凝膠層析糖蛋白(圖2)。
[0022](4)精制:將凝膠層析糖蛋白(MGP-1I1-B)用 Tris-HCl 緩沖液(pH 6.8,0.05 mol/L)配成濃度為10 mg/mL溶液，經(jīng)0.45μπι微孔濾膜過(guò)濾，利用蛋白快速純化系統(tǒng)(AKTApurifier 100)制備(色譜柱SuperdexTM 75制備柱，洗脫劑為雙蒸水，進(jìn)樣量20 yL，流速
0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm)，收集洗脫峰，冷凍干燥，檢測(cè)其前列腺癌細(xì)胞增值抑制活性，活性最強(qiáng)組分(MGP-1I1-B-2)為貽貝糖蛋白(圖3和圖4)。
[0023]本發(fā)明所得的貽貝糖蛋白(MGP-1I1-B-2)是指在280 nm處有蛋白質(zhì)特征吸收值，同時(shí)用苯酚-硫酸法檢測(cè)時(shí)，在490 nm又有糖特征吸光值的組分；
本發(fā)明所得的貽貝糖蛋白(MGP-1I1-B-2)經(jīng)堿處理、PNGase F酶解、β -降解反應(yīng)和紅外光譜分析，該貽貝糖蛋白含有O-糖苷鍵和N-糖苷鍵；
本發(fā)明所得的貽貝糖蛋白(MGP-1I1-B-2M5SDS-PAGE電泳分析分子量約為16.9 kDa ； 本發(fā)明所得的貽貝糖蛋白(MGP-1I1-B-2)經(jīng)HPLC分析其半數(shù)降解溫度為63.5 ° C。
[0024]本發(fā)明所得的貽貝糖蛋白(MGP-1I1-B-2)中糖和蛋白含量分別為23.54%和76.46% ;經(jīng)GC/MS測(cè)定，糖蛋白中單糖的組成包括D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-果糖和D-甘露糖，相應(yīng)比例為1.00:2.01:6.93:7.27:4.05。
[0025]本發(fā)明所得的貽貝糖蛋白(MGP-1I1-B-2)經(jīng)氨基酸分析儀分析，糖蛋白中蛋白由15種氨基酸組成,詳見(jiàn)表1。
[0026]表1.貽貝糖蛋白(MGP-1I1-B-2)中氨基酸組成及含量

【權(quán)利要求】
1.一種貽貝糖蛋白其特征在于該貽貝糖蛋白的分子量約為16.9 kDa;所述的貽貝糖蛋白含有O-糖苷鍵和N-糖苷鍵；所述的貽貝糖蛋白組分在280 nm處有蛋白質(zhì)特征吸收值，用苯酚-硫酸法檢測(cè)時(shí)，在490 nm又有多糖特征吸光值。
2.如權(quán)利要求1所述的一種貽貝糖蛋白，其特征在于所述的貽貝糖蛋白中糖和蛋白含量分別為23.54%和76.46%ο
3.如權(quán)利要求1所述的一種貽貝糖蛋白，其特征在于該貽貝糖蛋白組分的半數(shù)降解溫度為63.5 ° C。
4.如權(quán)利要求1所述的一種貽貝糖蛋白，其特征在于該貽貝糖蛋白組分經(jīng)GC/MS測(cè)定，糖蛋白中單糖的組成包括D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-果糖和D-甘露糖，相應(yīng)比例為 1.00:2.01:6.93:7.27:4.05。
5.如權(quán)利要求1所述的一種貽貝糖蛋白，其特征在于該貽貝糖蛋白組分經(jīng)氨基酸分析儀分析，糖蛋白中的蛋白由15中氨基酸組成，其中每1000個(gè)氨基酸殘基中，丙氨酸113殘基/1000殘基、精氨酸65殘基/1000殘基、天冬氨酸87殘基/1000殘基、谷氨酸91殘基/1000殘基、甘氨酸165殘基/1000殘基、組氨酸4殘基/1000殘基、異亮氨酸11殘基/1000殘基、亮氨酸31殘基/1000殘基、賴(lài)氨酸20殘基/1000殘基、蛋氨酸11殘基/1000殘基、苯丙氨酸27殘基/1000殘基、脯氨酸101殘基/1000殘基、絲氨酸143殘基/1000殘基、蘇氨酸78殘基/1000殘基、纈氨酸53殘基/1000殘基。
6.如權(quán)利要求1至5任一所述的貽貝糖蛋白，其特征在于該糖蛋白由如下方法制備而得到: (1)勻衆(zhòng):新鮮貽貝洗凈、去殼，軟組織勻衆(zhòng)2~4min,按lg: 10~15mL比例加入Tris-HCl 緩沖液(pH 6.8,0.05 mol/L)，O ~4°C攪拌提取 36 ~48 h，于 10000 ~12000 r/min、0~4°C離心10~20 min,收集上清液、濃縮,用15~20倍蒸懼水透析36~48 h(蒸餾水每12 h更換一次)，冷凍干燥，得粗糖蛋白； (2)陰離子交換層析:粗糖蛋白用Tris-HCl緩沖液(pH6.8，0.05 mol/L)配成濃度30~50mg/mL溶液,經(jīng)0.45 μ m微孔濾膜過(guò)濾,加入到陰離子交換樹(shù)脂柱(1.6 cmX 80 cm),依次用含0、0.3和0.5 mol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液洗脫，用考馬斯亮蘭法和苯酚-硫酸法示蹤檢測(cè)蛋白質(zhì)含量和糖含量，根據(jù)洗脫曲線收集糖蛋白組分，將洗脫液濃縮，用15~20倍蒸餾水透析36~48 h (蒸餾水每12 h更換一次)，冷凍干燥，檢測(cè)其細(xì)胞毒活性，活性最強(qiáng)組分為離子交換糖蛋白； (3)凝膠柱層析:將離子交換糖蛋白用Tris-HCl緩沖液(pH6.8,0.05 mol/L)配成濃度20~30mg/mL溶液,經(jīng)0.45 μ m微孔濾膜過(guò)濾,加入到凝膠色譜柱(1.0 cm X 30 cm),用Tris-HCl緩沖液(pH 6.8,0.05 mol/L)洗脫，考馬斯亮蘭法和苯酚-硫酸法示蹤檢測(cè)蛋白質(zhì)含量和糖含量，根據(jù)洗脫曲線收糖蛋白組分，將洗脫液濃縮，用15~20倍蒸餾水透析36~48 h (蒸餾水每12 h更換一次)，冷凍干燥，檢測(cè)其細(xì)胞毒活性，活性最強(qiáng)組分為凝膠層析糖蛋白； (4)精制:將凝膠層析糖蛋白用Tris-HCl緩沖液(pH6.8,0.05 mol/L)配成濃度10~15mg/mL溶液，經(jīng)0.45 μ m微孔濾膜過(guò)濾，利用蛋白快速純化系統(tǒng)(AKTA purifier 100)制備，收集洗脫峰，冷凍干燥得糖蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于步驟(1)中的貽貝為厚殼貽貝iMytilus Cora1SCW1S);所述的步驟(2)中的陰離子交換樹(shù)脂為DEAE Sepharose F F ;所述的步驟(3)中的凝膠為Sepharose 4B ;所述的步驟(4)中的蛋白快速純化系統(tǒng)(AKTA purifier100)的條件為:色譜柱SuperdexTM 75制備柱，洗脫劑為雙蒸水，進(jìn)樣量20 μ L，流速0.5mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng) 280 nm。
8.如權(quán)利要求1至5任一所述的貽貝糖蛋白在抗腫瘤藥物，特別是在制備抗前列腺癌藥物中的應(yīng) 用。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK104177484SQ201410233476
【公開(kāi)日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2014年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月29日
【發(fā)明者】遲長(zhǎng)鳳, 王斌, 陳蔭, 李濤 申請(qǐng)人:浙江海洋學(xué)院