一種鴨甲肝病毒vp1蛋白抗原域的重組蛋白的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種鴨甲肝病毒VP1蛋白抗原域的重組蛋白的制備方法及其應(yīng)用，制備方法包括下列步驟：（1）鴨甲肝病毒VP1蛋白抗原域的特異性引物設(shè)計(jì)與合成；（2）RT-PCR擴(kuò)增和重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建；（3）重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的鑒定；（4）表達(dá)產(chǎn)物的純化和Westernblot活性檢測(cè)。本發(fā)明制備的重組蛋白具備良好的抗原性，可以用于檢測(cè)鴨甲肝病毒，也可以用來(lái)制備鴨甲肝病毒抗體上的應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】—種鴨甲肝病毒VP1蛋白抗原域的重組蛋白的制備方法及其應(yīng)用
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】:
本發(fā)明涉及一種鴨甲肝病毒VPl蛋白抗原域的重組蛋白及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物基因工程領(lǐng)域。
[0002]【背景技術(shù)】:
鴨病毒性肝炎(Duck viral hepatitis, DVH)是由鴨甲肝病毒(Duck hepatitis Avirus, DHAV )和/或鴨星狀病毒(Duck astrovirus, DAstV)引起的一種傳播迅速和高度致死性雛鴨傳染病。該病以肝臟腫大和出血為主要病理特征，主要侵害3周齡以內(nèi)的雛鴨，I周齡以內(nèi)雛鴨致死率高達(dá)90%以上，嚴(yán)重制約了現(xiàn)代化養(yǎng)鴨產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。該病最早于1945年發(fā)現(xiàn)于美國(guó)，隨后在世界許多國(guó)家相繼報(bào)道，呈現(xiàn)世界性分布。國(guó)內(nèi)，黃均建于1963年首次報(bào)道了 DVH的發(fā)生和流行。為防止境外DVH傳入中國(guó)，農(nóng)業(yè)部和國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局把該病列入了最新版《中華人民共和國(guó)進(jìn)境動(dòng)物檢疫疫病名錄》。
[0003]與DAstV比較而言，DHAV是DVH的主要病原，相關(guān)的研究資料也更為詳實(shí)。DHAV主要包括血清1、2和3型，分別對(duì)應(yīng)DHAV 3個(gè)不同基因型:A、B和C型。血清I型DHAV，也即傳統(tǒng)的血清I型鴨肝炎病毒，在中國(guó)乃至世界上仍為最主要的流行血清型。血清I型DHAV基因組僅包含I個(gè)6750bp的開(kāi)放閱讀框(Open reading frame, ORF),編碼一條2249aa的多聚蛋白前體，并最終經(jīng)過(guò)蛋白酶水解加工形成3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(VP0/VP3/VP1 )和9個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(2A1/2A2/2A3/2B/2C/3A/3B/3C/3D)。其中，VPl 基因全長(zhǎng) 714bp，編碼 238 個(gè) aa的多肽。在小RNA病毒中，VPl蛋白是主要的宿主保護(hù)蛋白，其編碼的蛋白包含了主要的抗原位點(diǎn)并具有主要的型特異性中和位點(diǎn)，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性的中和抗體。因此，VPl蛋白成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。根據(jù)已有文獻(xiàn)資料顯示，完整的VPl蛋白在大腸桿菌表達(dá)量普遍偏低，有的毒株甚至不表達(dá)。表達(dá)菌篩選、表達(dá)條件的優(yōu)化以及密碼子改造等在提高目的蛋白的表達(dá)量上具有一定的作用。此外，大量研究證明通過(guò)選取蛋白主要主要抗原域進(jìn)行原核表達(dá)，蛋白表達(dá)量會(huì)顯著提高，抗原性保留較好而成本明顯降低。
[0004]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種鴨甲肝病毒VPl蛋白抗原域的重組蛋白的制備方法。在制備重組蛋白之前，需要進(jìn)行DHAV VPl蛋白主要抗原域的預(yù)測(cè)，具體步驟如下:首先將DHAV A66株VPl基因的序列翻譯成氨基酸序列，然后應(yīng)用DNAStar Protean軟件模塊進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)和抗原域預(yù)測(cè)，分別用Chou-Fasman法和Garnier-Robson法分析VPl蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)(α螺旋、β折疊、轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲),并結(jié)合Karplus-Schultz法預(yù)測(cè)VPl蛋白骨架區(qū)的柔韌性；采用Kyte-Doolittle法預(yù)測(cè)VPl蛋白的親水區(qū)和疏水區(qū)；用Emini原則預(yù)測(cè)特定區(qū)域位于蛋白質(zhì)表面的可能性；綜合應(yīng)用二級(jí)結(jié)構(gòu)、柔韌性、親水性和表面可能性4種參數(shù)并結(jié)合Jameson-wolf法預(yù)測(cè)的VPl蛋白的抗原指數(shù)來(lái)確定主要的抗原域(Main antigenic domain, MAD),并命名為 VP1M。
[0005]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
一種鴨甲肝病毒VPl蛋白抗原域的重組蛋白的制備方法，包括下列步驟: (I)鴨甲肝病毒VPl蛋白抗原域的特異性引物設(shè)計(jì)與合成
根據(jù)GenBank中登錄的DHAV A66株全基因序列(GenBank登錄號(hào):DQ886445)以及預(yù)測(cè)的主要抗原域VP1M，本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物序列如下:
上游引物 VPIM-F: 5’ - CG6W7TACACCACTCAGGCCAACTC _ 3，；
下游引物 VP1M-R: 5’ - CCGCTtK^TTCAATTTCCAGATCGAGTTC - 3’，下劃線部分分別為添加的I和沿ο I酶切位點(diǎn)。
[0006](2) RT-PCR擴(kuò)增和重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
根據(jù)Trizol試劑的使用說(shuō)明提取200 μ L DHAV鴨胚尿囊毒中的總RNA。以提取的總RNA和隨機(jī)引物Ν6或特異性引物VPlM-R進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA作為PCR模板。反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)?42°C反應(yīng)60min，95°C反應(yīng)5min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。PCR反應(yīng)采用50 μ I反應(yīng)體系:cDNA模板 4 μ L，上下游引物(VPIiH^PVPlM-R)各 2.5 μ L，2XPfu PCR MasterMix 25 μ L, ddH2016 μ L。反應(yīng)條件:95°C 5min ；94°C 30s, 52°C 30s, 72°C 30s，35 個(gè)循環(huán)；72°C 1min0 反應(yīng)結(jié)束后取6 μ I PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。分析正確后，其剩余PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收。
[0007]將回收的PCR產(chǎn)物與載體pGEX-4T-l分別用I和XAo I雙酶切，回收純化，用T4 DNA連接酶于16°C連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化斤aas DH5 α感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定正確后測(cè)序進(jìn)一步確證，獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為 pGEX-4T-VPlM。
[0008](3)重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的鑒定
將PGEX-4T-VP1M質(zhì)粒和pGEX_4T_l空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞。挑取單個(gè)克隆接入4mL含有100 μ g/mL氨芐青霉素(Amp)的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，于37°C220 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。然后將培養(yǎng)物以1:100的比例接種到新鮮Amp (100 μ g/mL) LB液體培養(yǎng)基中，于37°C振蕩培養(yǎng)至菌液D6tltlnm值達(dá)到0.Γ0.8。采用不同誘導(dǎo)時(shí)間、不同溫度和不同IPTG誘導(dǎo)濃度進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)設(shè)置空載體誘導(dǎo)對(duì)照和重組質(zhì)粒未誘導(dǎo)對(duì)照。不同誘導(dǎo)條件下各取Iml誘導(dǎo)產(chǎn)物，12000g離心后Imin收集的菌體沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間、溫度和IPTG濃度。以最佳條件誘導(dǎo)表達(dá)后，超聲破碎細(xì)胞，12000g離心15min，分別收集上清及沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析，鑒定目的蛋白的表達(dá)形式(包涵體或可溶性蛋白)。
[0009](4)表達(dá)產(chǎn)物的純化和Western blot活性檢測(cè)
經(jīng)過(guò)鑒定，目的蛋白以包涵體形式存在于沉淀中，包涵體蛋白的純化參照分子克隆第三版使用包涵體蛋白的分離方法進(jìn)行，純化的目的蛋白濃度用BCA法測(cè)定。取純化的目的蛋白與PGEX-4T-1空載體誘導(dǎo)表達(dá)菌經(jīng)變性處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂乳4°C封閉過(guò)夜后與兔抗DHAV高免血清37 V反應(yīng)2h，PBST (Phosphate-buffered saline containing 0.05% Tween )洗漆后加入 HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 37°C作用2h，洗滌后，在3’ - 二氨基聯(lián)苯胺緩沖液(DAB)中進(jìn)行顯色。
[0010]本發(fā)明的所述的鴨甲肝病毒VPl蛋白抗原域的重組蛋白可以用于檢測(cè)鴨甲肝病毒，也可以用來(lái)制備鴨甲肝病毒抗體上的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明制備的重組蛋白具備良好的抗原性，可與鴨甲肝病毒抗血清直接反應(yīng)，可為建立ELISA方法、免疫熒光、免疫組化以及單克隆抗體的制備等提供原材料。
[0012]【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】:
圖1為DHAV-1 A66毒株VPl蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、柔韌性、親水性、表面可能性和抗原指數(shù)。
[0013]圖2為VPlM基因的RT-PCR和重組表達(dá)質(zhì)粒PGEX-4T_VP1M的酶切鑒定結(jié)果；M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 =VPlM基因片段的RT-PCR產(chǎn)物；2:重組表達(dá)質(zhì)粒PGEX-4T_VP1M ；3:重組表達(dá)質(zhì)粒PGEX-4T-VP1M酶切產(chǎn)物
圖3為重組蛋白的SDS-PAGE(A)和Western blot (B)分析；A:重組蛋白的SDS-PAGE分析(Μ:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:空pGEX-4T-l未誘導(dǎo)菌；2:空pGEX_4T_l誘導(dǎo)菌；3:重組質(zhì)粒PGEX-4T-VP1M未誘導(dǎo)菌；4:重組質(zhì)粒pGEX-4T_VPlM誘導(dǎo)菌；5:重組質(zhì)粒pGEX-4T_VPlM誘導(dǎo)菌裂解液上清；6:純化的重組蛋白；7:重組質(zhì)粒PGEX-4T-VP1M誘導(dǎo)菌裂解液沉淀)；B:重組蛋白的Western blot分析(Μ:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:純化的重組蛋白；2:空pGEX_4T_l誘導(dǎo)菌)
【具體實(shí)施方式】:
下面通過(guò)具體實(shí)施例并結(jié)合附圖進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0014]實(shí)施例1: DHAV VPl蛋白主要抗原域的預(yù)測(cè)，具體步驟如下:
首先將DHAV A66株VPl基因的序列翻譯成氨基酸序列，然后應(yīng)用DNAStar Protean軟件模塊進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)和抗原域預(yù)測(cè)，分別用Chou-Fasman法和Garnier-Robson法分析VPl蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)(α螺旋、β折疊、轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲),并結(jié)合Karplus-Schultz法預(yù)測(cè)VPl蛋白骨架區(qū)的柔韌性；采用Kyte-Doolittle法預(yù)測(cè)VPl蛋白的親水區(qū)和疏水區(qū)；用Emini原則預(yù)測(cè)特定區(qū)域位于蛋白質(zhì)表面的可能性；綜合應(yīng)用二級(jí)結(jié)構(gòu)、柔韌性、親水性和表面可能性4種參數(shù)并結(jié)合Jameson-wolf法預(yù)測(cè)的VPl蛋白的抗原指數(shù)來(lái)確定主要的抗原域(Main antigenic domain, MAD),并命名為 VP1M。
[0015]DNAStar Protean軟件模塊預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)和抗原域的結(jié)果如圖1所示。在綜合分析VPl蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、柔韌性、親水性和表面可能性4種參數(shù)以及抗原指數(shù)基礎(chǔ)上，確定了DHAV-1 VPl蛋白主要抗原域在C端的130-238aa，對(duì)應(yīng)的VPlM編碼基因長(zhǎng)度為327bp。
[0016]實(shí)施例2 VPlM基因的RT-PCR和重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定
利用特異性引物對(duì)DHAV-1 A66毒株的VPlM基因進(jìn)行RT-PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳顯示，獲得了大小為327bp的條帶，與預(yù)期的大小一致(圖2)。重組表達(dá)質(zhì)粒PGEX-4T-VP1M經(jīng)&oR I和通ο I雙酶切鑒定，結(jié)果得到約4900bp和327bp的2個(gè)片段，與預(yù)期的結(jié)果相符(圖2)，進(jìn)一步的測(cè)序結(jié)果也表明插入目的片段的大小和閱讀框正確。
[0017]實(shí)施例3重組蛋白的表達(dá)、純化和活性鑒定
經(jīng)SDS-PAGE電泳確定重組蛋白所表達(dá)的最佳誘導(dǎo)溫度為37°C、IPTG最佳誘導(dǎo)濃度為1.0mmol/L、最佳誘導(dǎo)時(shí)間為4h,所表達(dá)的分子量約為38 kDa,與預(yù)期的大小相符。以最佳條件表達(dá)的重組蛋白是以包涵體的形式表達(dá)，對(duì)重組蛋白使用包涵體的分離純化方法進(jìn)行純化，對(duì)純化前后的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果顯示目的蛋白得到了純化(圖3A)。BCA法測(cè)定的重組蛋白的濃度為0.802 mg/mLo Western blot活性檢測(cè)的結(jié)果顯示,純化的目的蛋白在38 kDa大小附近出現(xiàn)特異性條帶，誘導(dǎo)的空載體未出現(xiàn)目的條帶，表明目的蛋白可以被兔抗DHAV-1多克隆血清所識(shí)別，具備良好的抗原性(圖3B)。
【權(quán)利要求】
1.一種鴨甲肝病毒VPl蛋白抗原域的重組蛋白的制備方法，其特征在于，包括下列步驟: (1)鴨甲肝病毒VPl蛋白抗原域的特異性引物引物設(shè)計(jì)與合成: 上游引物 VPIM-F: 5’ - CG6W7TACACCACTCAGGCCAACTC _ 3，； 下游引物 VP1M-R: 5’ - CCGCTtK^TTCAATTTCCAGATCGAGTTC - 3’，下劃線部分分別為添加的I和沿ο I酶切位點(diǎn)； (2)RT-PCR擴(kuò)增和重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建； (3)重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的鑒定； (4)表達(dá)產(chǎn)物的純化和Westernblot活性檢測(cè)； 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨甲肝病毒VPl蛋白抗原域的重組蛋白的制備方法，其特征在于，RT-PCR擴(kuò)增和重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建的具體步驟為: 根據(jù)Trizol試劑的使用說(shuō)明提取200 μ L DHAV鴨胚尿囊毒中的總RNA ；以提取的總RNA和隨機(jī)引物Ν6或VPlM-R進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA作為PCR模板；反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)?42°C反應(yīng)60min，95°C反應(yīng)5min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶；PCR反應(yīng)采用50 μ L反應(yīng)體系:cDNA模板4yL，上下游引物(VPliH^PVPlM-R)各 2.5μ L，2XPfu PCR MasterMix 25 μ L, ddH20 16yL;反應(yīng)條件:95°C 5min ；94°C 30s, 52°C 30s,72°C 30s，35 個(gè)循環(huán)；72°C 1min ;反應(yīng)結(jié)束后取6uL PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析；分析正確后，其剩余PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收； 將回收的PCR產(chǎn)物與載體pGEX-4T-l分別用I和XAo I雙酶切，回收純化，用T4 DNA連接酶于16°C連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化斤aas DH5 α感受態(tài)細(xì)胞；挑取單菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定正確后測(cè)序進(jìn)一步確證，獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為PGEX-4T-VP1M。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨甲肝病毒VPl蛋白抗原域的重組蛋白的制備方法，其特征在于，重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的鑒定的具體步驟為: 誘導(dǎo)表達(dá):將PGEX-4T-VP1M質(zhì)粒和pGEX-4T-l空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞；挑取單個(gè)克隆接入4mL含有100 μ g/mL氨芐青霉素(Amp)的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，于37°C 220 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；然后將培養(yǎng)物以1:100的比例接種到100 μ g/mL的新鮮Amp LB液體培養(yǎng)基中，于37°C振蕩培養(yǎng)至菌液D6tltol值達(dá)到0.4^0.8 ； 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定:超聲破碎細(xì)胞，12000g離心15min，分別收集上清及沉淀進(jìn)行SDS-PAGE 分析。
3.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鴨甲肝病毒VPl蛋白抗原域的重組蛋白的制備方法，其特征在于誘導(dǎo)表達(dá)的條件為:誘導(dǎo)溫度為37°C，IPTG誘導(dǎo)濃度為1.0 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為4h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨甲肝病毒VPl蛋白抗原域的重組蛋白的制備方法，其特征在于，表達(dá)產(chǎn)物的純化和Western blot活性檢測(cè)的具體步驟為: 包涵體蛋白的純化參照分子克隆第三版使用包涵體蛋白的分離方法進(jìn)行；純化的目的蛋白濃度用BCA法測(cè)定:取純化的目的蛋白與PGEX-4T-1空載體誘導(dǎo)表達(dá)菌經(jīng)變性處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂乳4°C封閉過(guò)夜后與兔抗DHAV高免血清37 °C反應(yīng)2h，PBST洗滌后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔I gG 37 °C作用2h，洗滌后，在3 ’ - 二氨基聯(lián)苯胺緩沖液(DAB)中進(jìn)行顯色。
5.上述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的鴨甲肝病毒VPl蛋白抗原域的重組蛋白在檢測(cè)鴨甲肝病毒上的應(yīng)用。
6.上述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的鴨甲肝病毒VPl蛋白抗原域的重組蛋白在制備鴨甲肝病毒抗體上的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK104357462SQ201410649817
【公開(kāi)日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月14日
【發(fā)明者】孫濤, 李傳峰, 孫明君, 王群, 鄭小龍 申請(qǐng)人:山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心