專利名稱：一種抗睪丸hTSC29蛋白的抗體或抗體片段及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一種用于男性不育癥檢測(cè)的抗體或抗體片段及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在全世界范圍內(nèi)，大約15%的夫婦受到不育癥的影響，其中男性不育癥已經(jīng)成為一個(gè)主要的生殖健康問題。隨著社會(huì)工業(yè)化程度的提高和生活節(jié)奏的加快，加上環(huán)境污染和不良生活習(xí)慣等因素，男性精液質(zhì)量日趨下降，男性不育人數(shù)呈逐年上升趨勢(shì)，男性生殖健康的問題越來越受到全社會(huì)的關(guān)注。精子發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過程，它分為精原細(xì)胞有絲分裂、精母細(xì)胞減數(shù)分裂和精子形成三個(gè)階段。體內(nèi)這一獨(dú)特的生命現(xiàn)象，需要一系列睪丸特異性表達(dá)基因的參與，各自發(fā)揮著特定的功能。目前已知一些基因與精子發(fā)生密切相關(guān)，例如CREM， Ddrl， TESP-1等皆被證明為睪丸特異性表達(dá)基因并在精子發(fā)生過程中起重要作用，這些基因的缺失或突變將導(dǎo)致嚴(yán)重少精子癥或無精子癥，從而造成不育。因此，篩選和鑒定生精相關(guān)基因有助于進(jìn)一步了解人類精子形成的分子機(jī)制和部分男性不育的原因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種能夠用于男性不育癥檢測(cè)的抗睪丸hTSC29蛋白的抗體或抗體片段及其應(yīng)用。 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種分離的雜交瘤細(xì)胞株，其保藏號(hào)為CCTCCNO :C200952。 —種由雜交瘤細(xì)胞株hTSC29分泌的抗體或抗體片段。 進(jìn)一步的，抗體或抗體片段為特異性結(jié)合抗睪丸hTSC29蛋白的抗體或抗體片段。該雜交瘤細(xì)胞株hTSC29也可以分泌出能夠特異性結(jié)合其它蛋白的抗體或抗體片段。
進(jìn)一步的，抗體為特異性結(jié)合hTSC29蛋白的多克隆抗體或單克隆抗體。[OOOS] 進(jìn)一步的，單克隆抗體為IgG，亞類為IgG2b ( k )。 —種抗睪丸hTSC29蛋白的抗體或抗體片段的應(yīng)用，所述抗體或抗體片段與耦聯(lián)物耦聯(lián)，所述耦聯(lián)物為酶、熒光標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物或藥物。 —種抗睪丸hTSC29蛋白的抗體或抗體片段復(fù)合物，包括抗睪丸hTSC29蛋白的抗體或抗體及與其耦聯(lián)的耦聯(lián)物，所述耦聯(lián)物選自標(biāo)記物、藥物。
所述標(biāo)記物為酶、熒光標(biāo)記物或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物。 —種藥物組合物，包括藥學(xué)上有效量的抗睪丸hTSC29蛋白的抗體或抗體片段及藥學(xué)上可接受的載體。 —種抗睪丸hTSC29蛋白的抗體或抗體片段在男性不育檢測(cè)上的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果是，申請(qǐng)人篩選出一個(gè)人睪丸特異性基因hTSC29，根據(jù)同源性、抗原性、親水性等參數(shù)預(yù)測(cè)的結(jié)果進(jìn)行綜合考慮，最后選取hTSC29的224-241位氨基酸序列進(jìn)行合成。經(jīng)小鼠免疫、細(xì)胞融合、篩選及克隆化，獲得了能穩(wěn)定分泌抗hTSC29 mAb的雜交瘤細(xì)胞株，Western blot鑒定表明，該mAb在人正常睪丸蛋白中相對(duì)分子質(zhì)量(M》約為
360kDa處檢測(cè)到特異條帶；免疫組織化學(xué)顯示hTSC29蛋白主要在正常人睪丸的精母細(xì)胞及 圓形精子細(xì)胞中表達(dá)，此抗體效價(jià)高、特異性強(qiáng)，為進(jìn)一步研究與hTSC29基因表達(dá)相關(guān)的 男性不育癥提供了特異的檢測(cè)工具。


圖1是Western blot檢測(cè)hTSC29 mAb的特異性圖，其中，字符1代表人子宮內(nèi)膜 細(xì)胞，2代表白血病細(xì)胞，3代表人睪丸組織，GAPDH作為內(nèi)參； 圖2是hTSC29的免疫組化定位圖，箭頭所指是hTSC29蛋白質(zhì)，免疫組化結(jié)果顯 示，hTSC29 mAb所識(shí)別的分子主要定位在正常人睪丸組織的精母細(xì)胞及精子細(xì)胞，A為陰性 對(duì)照； 圖3是免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)hTSC29蛋白在睪丸組織中的表達(dá)圖，其中，A為陰 性對(duì)照，B為hTSC29蛋白在人睪丸組織中的定位(箭頭所指)。
具體實(shí)施例方式
本申請(qǐng)的申請(qǐng)人采用Affyymetrix公司的成人睪丸基因組表達(dá)譜芯片，成功篩選 出一個(gè)人睪丸特異性新基因，并將其命名為hTSC29(GenBank登陸號(hào)BC032957)，為了更深 入的研究該基因的表達(dá)特征及其在精子發(fā)生過程中的生物功能，申請(qǐng)人制備了鼠抗hTSC29 合成肽的單克隆抗體；申請(qǐng)人對(duì)hTSC29全長(zhǎng)蛋白序列與其他睪丸特異性表達(dá)的蛋白進(jìn)行 同源性分析，選取同源性低的片段，再用DNAstar軟件對(duì)蛋白質(zhì)的抗原表位及親水性進(jìn)行 了分析，根據(jù)同源性、抗原性、親水性等參數(shù)預(yù)測(cè)的結(jié)果進(jìn)行綜合考慮，最后選取hTSC29的 224-241位氨基酸序列進(jìn)行合成。經(jīng)小鼠免疫、細(xì)胞融合、篩選及克隆化，獲得了能穩(wěn)定分泌 抗hTSC29 mAb的雜交瘤細(xì)胞株hTSC29，該細(xì)胞株的保藏號(hào)為CCTCC NO :C200952，分泌的抗 體為IgG2b(K)亞型，效價(jià)達(dá)到1 : 10、Western blot鑒定表明，該mAb在人正常睪丸蛋 白中相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)約為60kDa處檢測(cè)到特異條帶；免疫組織化學(xué)顯示hTSC29蛋白主 要在正常人睪丸的精母細(xì)胞及圓形精子細(xì)胞中表達(dá)，此抗體效價(jià)高、特異性強(qiáng)，為進(jìn)一步研 究與hTSC29基因表達(dá)相關(guān)的男性不育癥提供了特異的檢測(cè)工具。 本發(fā)明采用生物信息學(xué)方法對(duì)hTSC29的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，依據(jù)同
源性、抗原性、親水性等理化性質(zhì)設(shè)計(jì)出一段由19個(gè)氨基酸組成的多肽(多肽序列為
SPENTCPREATKKSRHGLD)，將其與載體蛋白鑰孔戚血藍(lán)素(keyhole limpet hemocyanin，
KLH)偶聯(lián)后腹腔注射免疫BALB/c小鼠，應(yīng)用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備抗hTSC29單克隆抗
體，運(yùn)用這種新抗體，通過ELISA法、Western blot、免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色等方法檢
測(cè)人體hTSC29蛋白質(zhì)的存在及其表達(dá)特征。 雜交瘤細(xì)胞株hTSC29的保藏信息如下 培養(yǎng)物名稱雜交瘤細(xì)胞株hTSC29 保藏日期2009年8月27日 保藏單位中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC) 保藏編號(hào)CCTCC NO :C200952 抗hTSC29蛋白的抗體或抗體片段的制備方法如下
1.材料
小鼠骨髓瘤細(xì)胞株Sp2/0購(gòu)自ATCC ;高糖DMEM和胎牛血清購(gòu)自Gibco ;完全福氏 佐齊U、不完全福氏佐齊U、HAT、HT和PEG (1450)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；HRP-羊抗小鼠IgG購(gòu)自 KPL公司；FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗購(gòu)自Sigma公司；3， 3， 5， 5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)購(gòu)自科 華生物公司；牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自Merck公司；小鼠亞類(型)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自HBT公 司；ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自PIERCE公司；硝酸纖維素膜(PVDF)購(gòu)自Millipore公司；其他試 劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。電泳槽、電泳儀(Mini-protean Teta cell型)、酶標(biāo)儀(680型)和熒 光影像掃描儀均為BIO-RAD產(chǎn)品；半干轉(zhuǎn)膜裝置為Wealtec corp產(chǎn)品；BALB/c小鼠(7 8周齡、雌性、清潔級(jí))由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；正常人睪丸組織由北京大學(xué)深圳醫(yī) 院病理科提供；多肽合成以及其與KLH、BSA的偶聯(lián)由西安華辰生物科技有限公司完成。
2.hTSC29抗原的獲取及動(dòng)物免疫 利用DNAstar軟件包對(duì)不同種屬的hTSC29氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)以及 hTSC29的親疏水性、抗原性及表面暴露性預(yù)測(cè)，選取hTSC29蛋白中的一段氨基酸序列委托 西安華辰生物科技有限公司合成，經(jīng)質(zhì)譜分析表明合成的多肽片段與理論的Mr —致，反相 HPLC檢測(cè)純度在95%以上；多肽與KLH和BSA的交聯(lián)采用戊二醛連接法，將5mg合成多肽 分別加入7mg KLH和BSA中，邊振蕩邊緩慢加入新鮮配制的3g/L的戊二醛溶液(lmL)，室溫 作用2h。以pH8.5硼酸緩沖液透析過夜。交聯(lián)形成多肽-KLH、多肽-BSA偶聯(lián)物。取50 y g 多肽-KLH偶聯(lián)物加200 y L滅菌PBS與等體積的完全福氏佐劑混合進(jìn)行充分乳化，腹腔注 射免疫BALB/c小鼠。首次免疫后每隔2周加強(qiáng)免疫1次，劑量同前，用不完全福氏佐劑充 分乳化后，注射小鼠腹腔。第3次加強(qiáng)免疫后斷尾取血，分離血清，測(cè)定血清效價(jià)。選擇血 清效價(jià)高的小鼠，用不加佐劑的多肽-KLH再加強(qiáng)免疫1次，3天后取小鼠脾細(xì)胞融合。
3.雜交瘤細(xì)胞株的建立 (1)細(xì)胞融合無菌條件下，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的Sp2/0細(xì)胞，1000r/min離心8min，棄上 清，用DMEM不完全培養(yǎng)基混懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，取所需的細(xì)胞數(shù)。制備免疫小鼠脾細(xì)胞懸液，將 Sp2/0細(xì)胞與脾細(xì)胞按1 : 5的比例混合，37t:水浴500mL/L PEG作用下進(jìn)行融合，融合后 1200r/min離心15min，棄上清，用HAT選擇培養(yǎng)液輕輕混懸，接種在預(yù)先培養(yǎng)了飼養(yǎng)細(xì)胞的 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置37t:、50mL/L C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第10天換HT選擇培養(yǎng)液，第14 天換含100mL/L胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液。 (2)篩選及克隆化2 3周后當(dāng)雜交瘤細(xì)胞長(zhǎng)至孔底面積1/10以上時(shí)， 以5mg/L的多肽-BSA偶聯(lián)物包被聚苯乙烯微孔板，加入雜交瘤上清，37t:孵育lh后， PBST (PBS+0. 5mL/L Tween-20)洗滌，加入HRP-羊抗小鼠IgG抗體，以TMB顯色后，用酶標(biāo) 儀測(cè)定A45。/63。值。以正常BALB/c小鼠血清作為陰性對(duì)照，已免疫BALB/c小鼠血清作為陽 性對(duì)照，以P/N > 2為陽性，采用有限稀釋法對(duì)選取陽性孔細(xì)胞連續(xù)克隆2 3次，直到克 隆生長(zhǎng)孔的mAb陽性率達(dá)100%，建立單克隆細(xì)胞株，該單克隆細(xì)胞株即為保藏號(hào)為CCTCC NO :C200952的細(xì)胞株。將陽性雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)后，進(jìn)行細(xì)胞凍存和腹水制備。單克 隆細(xì)胞株經(jīng)凍存、復(fù)蘇后仍保持穩(wěn)定分泌mAb的能力。
4.mAb腹水的制備及其效價(jià)測(cè)定 每只BALB/c小鼠腹腔內(nèi)注射0. 5mL滅菌液體石蠟，7天后將建株的雜交瘤細(xì)胞以 1 X 106個(gè)細(xì)胞接種于小鼠腹腔中，按常規(guī)法收集、制備mAb腹水。采用上述ELISA法檢測(cè) mAb腹水效價(jià)。
5. mAb的IgG亞類鑒定 按照HBT公司的小鼠mAb亞類檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行。在分別放有不同類及 亞類檢測(cè)試紙條的玻璃管中，相繼加入緩沖液、待檢mAb及其相應(yīng)類及亞類的檢測(cè)抗體， 輕輕振蕩試管，直至檢測(cè)試紙條上出現(xiàn)斑點(diǎn)。結(jié)果顯示雜交瘤細(xì)胞株分泌的mAb，亞類為 IgG2b(K )，效價(jià)達(dá)到1 : 104。
6. mAb特異性檢測(cè) (1) Western blot分析取正常人睪丸組織，剪成細(xì)小碎片，細(xì)胞漂洗液漂洗1遍， 加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑1 : 100，混勻組織，勻漿樣品，冰上孵育30min后，12000g 離心20min，獲得正常人睪丸組織裂解液。待子宮內(nèi)膜細(xì)胞和白血病K-562細(xì)胞的密度達(dá) 到約2X107L時(shí)，用上述方法獲得細(xì)胞裂解液。上述3種蛋白按比例加入5XSDS Loading buffer, IO(TC加熱15min，進(jìn)行常規(guī)SDS-PAGE電泳后，半干法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用lOg/L BSA 4。C封閉過夜。次日加入l : 1000稀釋的mAb，室溫下孵育4h，TBST(TBS+0. 5mL/L Tween-20) 緩沖液洗膜3次，10min/次，加入1 : 2000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體，室溫下孵育 lh， TBST徹底洗滌后，ECL試劑處理后，置熒光影像掃描儀上曝光，計(jì)算機(jī)自動(dòng)將每隔20s鐘 檢測(cè)到的信號(hào)保存。 (2)免疫組織化學(xué)分析人睪丸組織取材后多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片。切 片經(jīng)過二甲苯脫蠟、梯度酒精水化。滴加30mL/L H202-甲醇，室溫避光孵育20min，以消除 內(nèi)源性過氧化氫酶的作用。1Ommol/L的擰檬酸鹽緩沖液微波加熱(92°C 98°C， 15min)進(jìn) 行抗原修復(fù)，正常山羊血清室溫下封閉30min，然后依次滴加雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清，4t:孵 育過夜。PBS充分洗滌后加入羊抗小鼠生物素化二抗，室溫孵育lh， PBS洗滌3次，再加入 HRP-鏈酶親和素，室溫孵育lh。 PBS洗片后進(jìn)行DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，返藍(lán) 后封片，顯微鏡下觀察、拍照。陰性對(duì)照采用正常小鼠血清代替雜交瘤上清。
(3)免疫熒光分析正常人睪丸組織石蠟包埋切片用二甲苯常規(guī)脫蠟、入水、抗原 修復(fù)。PBS洗滌5次，滴加30mL/L H202-甲醇，室溫孵育20min，以消除內(nèi)源性過氧化氫酶 的作用。PBS洗滌后滴加正常山羊血清室溫下封閉10min，然后依次滴加雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng) 上清，濕盒內(nèi)孵育2h。 PBS洗滌2次，加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗，避光孵育30 40min。 PBS洗滌3次，甘油封片，熒光顯微鏡觀察，拍照。陰性對(duì)照采用正常小鼠血清代替雜交瘤上 清。 7.抗體應(yīng)用效果實(shí)驗(yàn) (1).抗hTSC29 mAb雜交瘤細(xì)胞株的建立 經(jīng)小鼠免疫、細(xì)胞融合、篩選及克隆化，獲得抗hTSC29的陽性克隆，進(jìn)行3次克隆 化后得到可以穩(wěn)定分泌特異性抗hTSC29 mAb的雜交瘤細(xì)胞株，其亞克隆分別命名為4F9、 2F7和4F2。經(jīng)凍存、復(fù)蘇后仍保持穩(wěn)定分泌mAb的能力。
(2)mAb的IgG亞類鑒定 用HBT公司提供的小鼠IgG亞類檢測(cè)試劑盒鑒定雜交瘤分泌的mAb，亞類均為 IgG2b(K )，效價(jià)達(dá)到1 : 104。
(3)mAb的特性鑒定
(3. l)Western blot分析 Western blot結(jié)果顯示，本發(fā)明雜交瘤細(xì)胞株hTSC29分泌的mAb均可特異性地識(shí)
6別人睪丸組織中Mr約為60 000的蛋白，而與子宮內(nèi)膜細(xì)胞蛋白和白血病K-562細(xì)胞蛋白 之間沒有結(jié)合。GAPDH作為內(nèi)參，在三種蛋白的Mr為36 000處都可檢測(cè)到特異條帶，如圖 l所示。 (3. 2)mAb的免疫組化鑒定 免疫組化結(jié)果顯示，hTSC29 mAb所識(shí)別的分子主要定位在正常人睪丸組織的精母 細(xì)胞及精子細(xì)胞，說明了 hTSC29蛋白在睪丸中有表達(dá)，如圖2所示。
(3. 3) mAb的免疫熒光鑒定 在正常人睪丸組織中精母細(xì)胞及精子細(xì)胞中有明顯的綠色熒光，呈環(huán)狀著色，表 明hTSC29 mAb可與睪丸中的hTSC29蛋白結(jié)合，如圖3所示。 本發(fā)明抗睪丸hTSC29蛋白的抗體或抗體片段能特異性與包含有人睪丸hTSC29多 肽的蛋白質(zhì)結(jié)合；抗體或抗體片段可以與一定的標(biāo)記物如酶、熒光標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物 結(jié)合，該抗體或抗體片段可以應(yīng)用于Westernblot、ELISA、免疫組織化學(xué)或免疫熒光染色檢 測(cè)。對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員，很容易得知該抗體或抗體片段還可以與藥物耦聯(lián)，用于耙向治療。 以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定 本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在 不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種雜交瘤細(xì)胞株hTSC29，其保藏號(hào)為CCTCC NOC200952。
2. —種由權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株hTSC29分泌的抗體或抗體片段。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗體或抗體片段，其特征在于所述抗體或抗體片段為特異性結(jié)合抗睪丸hTSC29蛋白的抗體或抗體片段。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗體或抗體片段，其特征在于所述抗體為特異性結(jié)合抗睪丸hTSC29蛋白的多克隆抗體或單克隆抗體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗體或抗體片段，其特征在于所述單克隆抗體為IgG，亞類為IgG2b(K)。
6. —種抗睪丸hTSC29蛋白的抗體或抗體片段的應(yīng)用，其特征在于所述抗體或抗體片段與耦聯(lián)物耦聯(lián)，所述耦聯(lián)物為酶、熒光標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物或藥物。
7. —種抗睪丸hTSC29蛋白的抗體或抗體片段復(fù)合物，其特征在于包括抗睪丸hTSC29蛋白的抗體或抗體及與其耦聯(lián)的耦聯(lián)物，所述耦聯(lián)物選自標(biāo)記物、藥物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗體或抗體片段復(fù)合物，其特征在于所述標(biāo)記物為酶、熒光標(biāo)記物或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物。
9. 一種藥物組合物，其特征在于包括藥學(xué)上有效量的權(quán)利要求3-5中任意一項(xiàng)所述的抗睪丸hTSC29蛋白的抗體或抗體片段及藥學(xué)上可接受的載體。
10. —種抗睪丸hTSC29蛋白的抗體或抗體片段在男性不育檢測(cè)上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗睪丸hTSC29蛋白的抗體或抗體片段及其應(yīng)用，該抗體或抗體片段由保藏號(hào)為CCTCC NOC200952的雜交瘤細(xì)胞株hTSC29分泌。通過該抗體或抗體片段能夠了解人類精子形成的分子機(jī)制和能夠?qū)Σ糠帜行圆挥Y提供特異性的檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/577GK101775371SQ200910188640
公開日2010年7月14日 申請(qǐng)日期2009年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月2日
發(fā)明者唐愛發(fā), 桂耀庭, 蔡志明, 顏秋霞 申請(qǐng)人:唐愛發(fā);顏秋霞;桂耀庭;蔡志明