抗發(fā)炎蛋白與制備及使用其的方法
【專利摘要】本案的揭示是關(guān)于抗發(fā)炎蛋白、其用途、制備方法及其偵測方法。特定而言，本發(fā)明是關(guān)于來自麥盧卡蜂蜜的經(jīng)甲基乙二醛修飾的主要蜂王漿蛋白及其片段。
【專利說明】抗發(fā)炎蛋白與制備及使用其的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明是關(guān)于抗發(fā)炎蛋白、其用途及其偵測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蜂蜜因其多種健康益處而已在世界各地藉由培養(yǎng)使用數(shù)個世紀。蜂蜜的兩個最重要的健康益處為其抗細菌及抗發(fā)炎性質(zhì)。由蜜蜂自松紅梅(Leptospermum scoparium)(—種新西蘭及南澳大利亞原生的植物)收集花蜜產(chǎn)生的麥盧卡蜂蜜(Manuka honey)已被識別為一種尤其展現(xiàn)有效抗細菌及抗發(fā)炎性質(zhì)的蜂蜜品種。
[0003]最近，已發(fā)現(xiàn)化學物質(zhì)甲基乙二醛(MG0/2-氧代丙醛)為麥盧卡蜂蜜的抗細菌活性的主要組分。含有較高濃度的MGO的麥盧卡蜂蜜樣本相較于MGO濃度較低的蜂蜜樣本具有較高水平的抗細菌活性。咸信MGO賦予蜂蜜以抗細菌性質(zhì)，這是因為MGO為具高度化學反應性的化合物，且MGO可容易地與細胞分子反應。MGO與細菌中的細胞分子的化學反應損傷對于細菌活力而言重要的分子，且從而MGO充當抗細菌劑。
[0004]蜂蜜中存在高含量的MGO為區(qū)分麥盧卡蜂蜜與其他品種的蜂蜜的特征。大部分蜂蜜品種展現(xiàn)某種程度的抗細菌活性，大部分蜂蜜品種的抗細菌活性主要為蜂蜜中存在過氧化氫的結(jié)果。相較而言，麥盧卡蜂蜜主要因蜂蜜中存在MGO而展現(xiàn)抗細菌活性。
[0005]在2004年Kohno等人在細胞激素層面上研究蜂王漿的抗發(fā)炎效應或作用。研究結(jié)果表明蜂王漿具有抗發(fā)炎作用，該抗發(fā)炎作用由抑制活化的巨噬細胞產(chǎn)生促發(fā)炎細胞激素(諸如TNF-a、IL-6及IL-1)所致。該研究進一步表明蜂王漿中的活性部分或組分的分子量介于5kDa與30kDa之間。此研究大概闡明大部分蜂蜜具有弱抗發(fā)炎效應是因為在蜂蜜中存在蜂王漿蛋白。
`[0006]雖然已了解麥盧卡蜂蜜的抗細菌活性的多重作用機制，但麥盧卡蜂蜜充當抗發(fā)炎劑的機制仍然未知。需要研發(fā)基于蜂蜜的抗發(fā)炎劑，這是因為許多當前可用的抗發(fā)炎劑在其使用方面具有較多缺點。舉例而言，C0X-2抑制劑(一種非類固醇抗發(fā)炎藥(NSAID)形式)會提高患者的心臟病發(fā)作及中風的風險，且阿司匹林(aspirin)可能提高胃腸出血的風險。另外，皮質(zhì)類固醇經(jīng)報導會抑制上皮細胞生長且NSAID經(jīng)報導具細胞毒性，因此此兩個類別的抗發(fā)炎劑不適用于傷口護理。源自蜂蜜的抗發(fā)炎劑相較于當前可用的藥物在一或多個領(lǐng)域中可具有較少毒性副作用，且相較于當前可用的抗發(fā)炎藥物亦可提供可能的不同用途。
[0007]除需要研發(fā)基于蜂蜜的抗發(fā)炎藥物之外，亦需要研發(fā)一種測試蜂蜜樣本的抗發(fā)炎特性的簡便方法。本發(fā)明旨在滿足該兩種需要及其他未滿足的需要。
[0008]本發(fā)明人已識別出來自麥盧卡蜂蜜的約55kDa至75kDa的經(jīng)修飾王衆(zhòng)主蛋白(apalbumin)，其是得自麥盧卡蜂蜜中發(fā)現(xiàn)的高含量的甲基乙二醛。本發(fā)明人已認識到，經(jīng)修飾的王漿主蛋白相較于未經(jīng)修飾的王漿主蛋白具有顯著較強的抗發(fā)炎性質(zhì)。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0009]本文描述一種經(jīng)甲基乙二醛(MGO)化學修飾且在蜂蜜中識別出的王漿主蛋白蛋白質(zhì)，其展現(xiàn)顯著提高的抗發(fā)炎效應。在一個方式中，提供一種分離的王漿主蛋白蛋白質(zhì)或其片段，其已經(jīng)甲基乙二醛(MGO)化學修飾。在另一具體實施例中，該蛋白為經(jīng)修飾的王漿主蛋白I (Apal/MRJP)蛋白或其片段。在另一具體實施例中，經(jīng)修飾的王漿主蛋白蛋白質(zhì)或其片段是自麥盧卡蜂蜜中分離。
[0010]在另一具體實施例中，蛋白或其片段具有至少17個經(jīng)MGO修飾的氨基酸殘基，或17至32個經(jīng)MGO修飾的氨基酸殘基或約32個經(jīng)MGO修飾的氨基酸殘基。在另一具體實施例中，經(jīng)修飾的氨基酸殘基為一或多個賴氨酸或精氨酸殘基。
[0011]在另一方式中，提供一種組成物，其包含分離的經(jīng)MGO修飾的王漿主蛋白蛋白質(zhì)或其片段。
[0012]在另一方式中，提供一種分離的經(jīng)MGO修飾的王漿主蛋白蛋白質(zhì)或其片段，其具有「抗發(fā)炎能力」且包含與SEQ ID NOl中所述的氨基酸序列具有至少75%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的氨基酸序列。在一個具體實施例中，分離的經(jīng)MGO修飾的王漿主蛋白蛋白質(zhì)或其片段是自麥盧卡蜂蜜中分離。
[0013]在另一方式中，提供一種減輕蜂巢組織中的炎癥的方法，其包含使包括如上文所定義的分離的經(jīng)MGO修飾的王漿主蛋白蛋白質(zhì)的組成物與蜂巢組織接觸的步驟。
[0014]在另一方式中，提供一種(i)降低免疫系統(tǒng)細胞的吞噬率的方法，或(ii)抑制免疫系統(tǒng)細胞上的用于吞噬的受體的方法，其包含投予免疫系統(tǒng)細胞含如上文所定義的分離的經(jīng)MGO修飾的王漿主蛋白蛋白質(zhì)的組成物的步驟。
[0015]在另一具體實施例中，提供一種藉由修飾蜂王衆(zhòng)產(chǎn)生抗發(fā)炎分子的方法,該方法包括使蜂王漿與至少0.01%MG0或0.5%MG0或1.0%MG0反應的步驟。該方法可進一步包括自蜂王漿產(chǎn)物中分離經(jīng)MGO修飾的王漿主蛋白(MRJPl)蛋白質(zhì)的步驟。
[0016]在另一方式中，提供一種識別蜂蜜樣本的(i )抗發(fā)炎能力或(i i )經(jīng)MGO修飾的王漿主蛋白濃度的方法，其包含以下步驟:
[0017]a)分析蜂蜜樣本的熒光，及
[0018]b)藉由將一蜂蜜樣本的熒光量測值以及一或多種蜂蜜樣本的抗發(fā)炎能力與先前已經(jīng)量測的抑制吞噬作用能力比較，來使蜂蜜樣本的熒光量測值與蜂蜜樣本的抗發(fā)炎能力具相關(guān)性。
[0019]在一個具體實施例中，經(jīng)MGO修飾的王漿主蛋白為經(jīng)修飾的王漿主蛋白I蛋白質(zhì)。
[0020]在一個具體實施例中，該方法用于使得養(yǎng)蜂人能夠確定自蜂房收集蜂蜜以獲得含有所需抗發(fā)炎能力或經(jīng)MGO修飾的王漿主蛋白含量的蜂蜜樣本的恰當時機。
[0021]在另一具體實施例中，該方法用于使得蜂蜜生產(chǎn)者能夠確定儲存蜂蜜以獲得具有所需抗發(fā)炎能力及經(jīng)MGO修飾的王漿主蛋白含量的蜂蜜樣本的所需持續(xù)時間。
[0022]一種增強一或多種王漿主蛋白/ (MRJP)蛋白質(zhì)的抗發(fā)炎及熒光特性的方法，該方法是藉由用MGO化學處理來達成。
[0023]一種提高蜂蜜樣本的抗發(fā)炎能力及經(jīng)MGO修飾的王漿主蛋白蛋白質(zhì)含量的方法，其包含將MGO或MGO前驅(qū)分子添加至蜂蜜樣本中的步驟。
[0024]在另一具體實施例中，提供一種增強一或多種王漿主蛋白蛋白質(zhì)的抗發(fā)炎能力的方法，其是藉由用MG0、甲醛、乙二醛及/或戊二醛化學處理來達成。[0025]在另一具體實施例中，提供一種增強一或多種王漿主蛋白蛋白質(zhì)的抗發(fā)炎能力的方法，其是藉由用MG0、乙二醛及/或戊二醛化學處理來達成。
[0026]上述概要大致描述本發(fā)明的某些具體實施例的特征及技術(shù)優(yōu)勢。其他技術(shù)優(yōu)勢將在隨后的本發(fā)明的實施方式及實施例中描述。咸信為本發(fā)明特性的新穎特征在連同任何隨附的附圖及實施例一起考慮時將自本發(fā)明的實施方式更透徹地了解。然而，本文提供的附圖及實施例意欲協(xié)助說明本發(fā)明或幫助建立對本發(fā)明的理解，而不意欲限制本發(fā)明的范圍。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1描繪(a) 10%具有高熒光的麥盧卡蜂蜜溶液的熒光發(fā)射光譜，及(b)藉由將10mg/ml牛血清白蛋白水溶液與400 μ g/ml MGO 一起培育所制備的經(jīng)MGO修飾的牛血清白蛋白溶液的熒光發(fā)射 光譜。
[0028]圖2描繪許多蜂蜜樣本的吞噬抑制作用(PIA)對比熒光的圖。
[0029]圖3展示麥盧卡蜂蜜的透析保留物在180ml G_50葡聚糖凝膠管柱上的層析洗提。洗提份量為1ml。
[0030]圖4展示自圖3中所示的G-50葡聚糖凝膠層析獲得的洗提份8、14及23的吞噬作用-抑制活性。結(jié)果展示相較于未經(jīng)處理的對照組得到的吞噬作用降低％。誤差杠展示至少三次分析的平均值±1個SD。洗提份23因其幾乎不含/不含蛋白質(zhì)而納入作為對照物。
[0031]圖5展示來自葡聚糖凝膠G-50層析的洗提份4至10在25ml Superosel2FPLC管柱上層析的洗提特征。洗提份量為lml。
[0032]圖6展示藉由胰蛋白酶消化以SupeiOseU層析管柱分離的洗提份8所獲的肽的質(zhì)譜。
[0033]圖7展示藉由胰蛋白酶消化以SupeiOseU層析管柱分離的洗提份14所獲的肽的質(zhì)譜。
[0034]圖8展示用來自SupeiOseU層析管柱的洗提份進行銀染色的SDS電泳凝膠操作的影像。
[0035]圖9展示未經(jīng)處理的麥盧卡蜂蜜及苜蓿蜜在培育之前的銀染色SDS電泳凝膠(一式兩份)。
[0036]圖10展示蜜場蜂蜜在3個月培育后(泳道I)及在培育之前(泳道2)的銀染色SDS電泳凝膠以及麥盧卡蜂蜜在3個月培育后(泳道3)及在培育之前(泳道4)的銀染色SDS電泳凝膠。
[0037]圖11展示在不同濃度的MGO下MRJPl由MGO修飾所致的質(zhì)量變化(以道爾頓計)。
[0038]圖12展示在不同濃度的MGO下MRJPl由MGO修飾所達成的DFCDA生物分析結(jié)果。
[0039]圖13展示使用10 μ L細胞進行DCFDA分析的動力學分析曲線圖。
[0040]圖14展示藉由使用MG0、果糖、戊二醛及葡萄糖修飾MRJPl所達成的DFCDA生物分
析結(jié)果。
[0041]圖15展示MRJP的Lys C消化的MS。
[0042]圖16展示經(jīng)0.1%MG0修飾的MRJP的Lys C消化的MS。[0043]圖17展示經(jīng)0.5%MG0修飾的MRJP的Lys C消化的MS。
[0044]圖18展示經(jīng)1.0%MG0修飾的MRJP的Lys C消化的MS。
[0045]圖19展示圖15至19中所示的Lys C消化的MS曲線的重迭圖。
[0046]圖20展示識別為源自未經(jīng)MGO修飾的MRJP提取物的MRJPl-胰蛋白酶消化物的峰。
[0047]圖21展示識別為源自經(jīng)0.1%MG0修飾的MRJP提取物的MRJPl-胰蛋白酶消化物的峰。
[0048]圖22展示識別為源自經(jīng)0.5%MG0修飾的MRJP提取物的MRJPl-胰蛋白酶消化物的MS峰。
[0049]圖23展示識別為源自經(jīng)1%MG0修飾的MRJP提取物的MRJPl-胰蛋白酶消化物的MS峰。
【具體實施方式】
[0050]以下描述闡述眾多例示性組態(tài)、參數(shù)及其類似方面。然而，應了解該描述不欲對本發(fā)明范圍進行限制，而實際上提供作為對例示性具體實施例的描述。
[0051]定義
[0052]王漿主蛋白蛋白質(zhì)為糖蛋白。存在許多在蜂蜜及蜂王漿中發(fā)現(xiàn)的王漿主蛋白。蜂蜜中所發(fā)現(xiàn)的主要王漿主蛋白為王漿主蛋白I (Apal)，亦稱為主要蜂王漿蛋白I (MRJP1)。雖然本說明書集中于蜂蜜中所發(fā)現(xiàn)的主要王漿主蛋白，但應了解蜂蜜中所發(fā)現(xiàn)的其他王漿主蛋白亦可展現(xiàn)類似的修 飾潛能及類似的抗發(fā)炎能力，這是因為其皆為具有高度甘露糖型糖基化的糖蛋白，如在2000年由Kimura等人在Biosc1.Biotechnol.Biochem中所報導。存在約9種主要蜂王漿蛋白且主要蜂王漿蛋白I至5的序列展示于下文中。
[0053]如貫穿本說明書中關(guān)于蜂蜜或王漿主蛋白或主要蜂王漿蛋白所用的術(shù)語「熒光(fluorescence)」為當藉由較低波長的光激發(fā)時實質(zhì)上對應于主要處于440nm至560nm范圍內(nèi)的光的最大發(fā)射的波長。
[0054]「蜂王漿(royal jelly)」為蜜蜂分泌物，其分泌自工蜂咽下部的腺體。除了水以夕卜，蛋白質(zhì)是蜂王漿的主要組分。
[0055]「發(fā)炎(inf lamed)」組織被定義為響應于組織損傷或感染而出現(xiàn)免疫反應的組織，且該組織具有以下一或多種癥狀:疼痛、腫脹、發(fā)熱、敏感或發(fā)紅。
[0056]如本文所用的「抗發(fā)炎能力(ant1-1nflammatory capacity)」被定義為臨床上減輕蜂巢組織的炎癥或炎癥癥狀的能力。抗發(fā)炎能力可使用下文詳細描述的吞噬作用抑制分析法(PIA)或下文詳細描述的DCFDA分析法來確定。
[0057]應了解一級氨基酸序列的「修飾(modification)」包括「缺失(deletion)」(即，一或多個氨基酸殘基不存在的多肽)、「添加(addition)」(即，相較于所說明的多肽具有一或多個額外氨基酸殘基的多肽)、「取代(substitution)」(S卩，由置換一或多個氨基酸殘基而產(chǎn)生的多肽)，及「片段(fragment)」(即，由與所說明多肽的一部分一級序列一致的一級氨基酸序列組成的多肽)。
[0058]應了解「經(jīng)修飾的王衆(zhòng)主蛋白(modified apalbumin)」包括已藉由甲基乙二醒于氨基酸上的化學反應或甲基乙二醛于構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基側(cè)鏈上的化學反應而經(jīng)修飾的任何王漿主蛋白蛋白質(zhì)或其片段。甲基乙二醛修飾有可能存在于王漿主蛋白內(nèi)的賴氨酸、精氨酸及/或半胱氨酸氨基酸以及末端氨基酸的自由氨基上且該等MGO修飾可存在于蛋白質(zhì)內(nèi)約I至40個位點上。舉例而言，經(jīng)修飾的王漿主蛋白I意謂在其氨基酸序列上的一或多個位點處經(jīng)修飾以得到經(jīng)MGO修飾的Apal的Apal。
[0059]氨基酸「序列相似性(sequence similarity) J或「序列一致性(sequenceidentity)」是指兩個或兩個以上多肽在適當位置處的氨基酸與氨基酸的比較，其中氨基酸一致或具有相似的化學及/或物理性質(zhì)，諸如電荷或疏水性。隨后可基于該比較測定所比較的多肽序列之間的「一致性百分比(percent identity)」。
[0060]序列的簡要描述
[0061]SEQ ID NO:1:自 http: / / www.uniprot.0rg / uniprot / 018330 獲得的Apal (亦稱為主要蜂王漿蛋白I)的氨基酸序列。
[0062]102030405060
[0063]MTRLFMLVCL GIVCQGTTGN ILRGESLNKS LPILHEffKFF DYDFGSDERR QDAILSGEYD
[0064]708090100110120
[0065]YKNNYPSDID QffHDKIFVTM LRYNGVPSSL NVISKKVGDG GPLLQPYPDff SFAKYDDCSG
[0066]130 I 40 150 160 170 180
[0067]IVSASKLAID KCDRLWVLDS GLVNNTQPMC SPKLLTFDLT TSQLLKQVEI PHDVAVNATT`[0068]190200210220230240`[0069]GKGRLSSLAV QSLDCNTNSD TMVYIADEKG EGLIVYHNSD DSFHRLTSNT FDYDPKFTKM
[0070]250260270280290300
[0071]TIDGESYTAQ DGISGMALSP MTNNLYYSPV ASTSLYYVNT EQFRTSDYQQ NDIHYEGVQN
[0072]310320330340350360
[0073]ILDTQSSAKV VSKSGVLFFG LVGDSALGCff NEHRTLERHN IRTVAQSDET LQMIASMKIK
[0074]370380390400410420
[0075]EALPHVPIFD RYINREYILV LSNKMQKMVN NDFNFDDVNF RIMNANVNEL ILNTRCENPD
[0076]430
[0077]NDRTPFKISI HL
[0078]賴氨酸(K)22個位點及精氨酸(R) 17個位點已經(jīng)突出顯示以識別可能由MGO糖基化的位點，藉以該糖基化產(chǎn)生經(jīng)MGO修飾的王漿主蛋白。
[0079]SEQ ID Ν0:2:自 http://http://www.uniprot.0rg/uniprot/077061 獲得的主要蜂王漿蛋白2的氨基酸序列是展示于序列表中。
[0080]SEQ ID NO: 3:自 http://www.uniprot.0rg/uniprot/Q17060_l 獲得的主要蜂王衆(zhòng)蛋白3的氨基酸序列是展示于序列表中。
[0081]SEQ ID N0:4:自 http://www.uniprot.0rg/uniprot/Q17060_l 獲得的主要蜂王衆(zhòng)蛋白4的氨基酸序列是展示于序列表中。
[0082]SEQ ID N0:5:自 http://www.uniprot.0rg/uniprot/097432獲得的主要蜂王衆(zhòng)蛋白5的氨基酸序列是展示于序列表中。
[0083]經(jīng)MGO修飾的王漿主蛋白I
[0084]王漿主蛋白I (亦稱為Apal或「主要蜂王漿蛋白I」(MRJP1))為以不同濃度見于各種蜜蜂產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)。Apal為由蜜蜂分泌的48.9千道爾頓(kDa)蛋白質(zhì)，且其見于蜂蜜、蜂王漿及其他蜜蜂產(chǎn)物中。所測試的所有蜂蜜品種皆已展示含有Apal (J.Simuth等人，2004)。據(jù)估計Apal構(gòu)成蜂王衆(zhòng)中48%的蛋白質(zhì)(B.Lerrer等人，2007)。
[0085]甲基乙二醛或MGO為具有式C3H4O2的有高度化學反應性的化合物。MGO由活生物體內(nèi)多重代謝路徑形成。麥盧卡蜂蜜的稱為「活性」麥盧卡蜂蜜的某些制劑相較于其他蜂蜜品種含有高得多濃度的MG0?；钚喳湵R卡蜂蜜已經(jīng)測定含有為其他蜂蜜品種中的MGO濃度的高達1000倍的MGO濃度(E.Mavric等人，2008)。
[0086]MGO可參與活生物體內(nèi)的多種化學反應，包括「晚期糖基化終產(chǎn)物」(AGE)的形成過程。糖基化為糖與蛋白質(zhì)或脂質(zhì)在不涉及酶作為反應催化劑的情況下的反應。MGO可藉由與氨基酸精氨酸、賴氨酸及/或半胱氨酸的自由氨基以及末端氨基反應而糖基化蛋白質(zhì)，且從而可化學修飾含有精氨酸及/或賴氨酸的蛋白質(zhì)。如自SEQ ID NO:1可見，Apal含有總共約39個可經(jīng)MGO化學修飾的精氨酸及賴氨酸殘基。
[0087]經(jīng)MGO修飾的Apal可藉由自活性麥盧卡蜂蜜中分離該分子而得到。經(jīng)MGO修飾的Apal可藉由生物化學技術(shù)自蜂蜜中分離出及/或由蜂蜜增濃。此等技術(shù)包括(但不限于)過濾、離心及層析，諸如離子交換層析、親和層析、疏水性相互作用層析、尺寸排阻層析及逆相層析。經(jīng)MGO修飾的Apal亦可自各種來源純化或藉由將MGO添加至蜂王漿中而化學合成。
[0088]亦可藉由以下操作得到經(jīng)MGO修飾的Apal:獲得編碼氨基酸序列SEQ ID NO:1的基因，將該基因選殖至適當載體中，用該載體使細胞系轉(zhuǎn)型，使多肽表現(xiàn)，純化該多肽，將多肽與MGO混合以使MGO與多肽之間進行化學反應，及純化經(jīng)MGO修飾的多肽。
[0089]表現(xiàn)系統(tǒng)可含有控制序列，諸如啟動子、強化子及終止控制子，如此項技術(shù)中關(guān)于多種宿主所知(參見例如 Sambrook 等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2版，Cold Spring Harbor Press (1989),其以全文引用的方式并入本文中)。表現(xiàn)系統(tǒng)亦可含有有助于基因表現(xiàn)及/或蛋白質(zhì)折迭的信號肽及原蛋白序列。
[0090]Apal (SEQ ID NO:1)的氨基酸變異體的經(jīng)MGO修飾形式亦可展現(xiàn)抗發(fā)炎能力。如一般技術(shù)者所了解，對SEQ ID NO:1的一級氨基酸序列的次要修飾會產(chǎn)生抗發(fā)炎活性相較于SEQ ID NO:1實質(zhì)上相等或增強的多肽。當Apal修飾包括一或多處取代時，較佳取代為保守取代，亦即其中殘基經(jīng)另一相同通用類型的殘基置換。在對Apal蛋白進行修飾時，可考慮氨基酸的親水指數(shù)(參見例如Kyte.等人，J.Mol.Biol.157，105-132 (1982)，其以全文引用方式并入本文中)。在此項技術(shù)中已知某些氨基酸可經(jīng)其他具有相似親水指數(shù)或分數(shù)的氨基酸取代且仍產(chǎn)生具有相似生物活性的多肽。
[0091 ] 經(jīng)MGO修飾的Apal變異體較佳與非變異Apal序列展現(xiàn)至少約75%序列一致性，較佳與本文所述的任何野生型或參考序列展現(xiàn)至少約80% —致性，更佳至少約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列一致性。甚至更佳，經(jīng) MGO 修飾的 Apal 變異體展現(xiàn)實質(zhì)上與經(jīng)MGO修飾的非變異Apal相當?shù)目拱l(fā)炎能力。
[0092]可藉由以下操作刺激蜂蜜中經(jīng)MGO修飾的Apal的形成:(i)在環(huán)境溫度下長期儲存，或(ii)在高溫(攝氏30度至40度)下培育蜂蜜，從而增強蜂蜜樣本的抗發(fā)炎能力。將MGO或MGO前驅(qū)體(諸如二羥丙酮(DHA))添加至蜂蜜樣本中，伴以足夠時間及/或加熱以使MGO前驅(qū)體轉(zhuǎn)化成MGO亦可刺激該蜂蜜樣本中經(jīng)MGO修飾的Apal的形成，且亦可藉由在蜂蜜樣本中產(chǎn)生經(jīng)MGO修飾的Apal而增強蜂蜜樣本的抗發(fā)炎能力。
[0093]抗發(fā)炎性質(zhì)增強的Apal亦可在蜂蜜外形成。完全或部分純化的Apal已發(fā)現(xiàn)可用MGO處理以得到經(jīng)MGO修飾的Apal。經(jīng)MGO修飾的Apal在與未經(jīng)修飾的Apal相比較時展現(xiàn)增強的抗發(fā)炎性質(zhì)。
[0094]經(jīng)MGO修飾的Apal及其變異體可以治療有效量納入醫(yī)藥組成物中。本發(fā)明的醫(yī)藥組成物可經(jīng)特定調(diào)配而以固體或液體形式投予，包括適于以下的組成物:(1)經(jīng)口投藥，例如藥液(水性或非水性溶液或懸浮液)；錠劑，例如旨在經(jīng)頰、舌下及全身吸收的錠劑；丸劑；散劑；顆粒；供涂覆于舌頭的糊劑；(2)非經(jīng)腸投藥，例如以例如無菌溶液或懸浮液或持續(xù)釋放調(diào)配物形式藉由皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或硬膜外注射投予；(3)局部施用，例如呈施用于皮膚的乳膏劑、軟膏或控制釋放貼片或噴霧劑形式；(4)陰道內(nèi)或直腸內(nèi)，例如呈子宮托、乳膏劑或泡沫劑形式；(5)舌下；(6)眼部；(7)經(jīng)皮；(8)經(jīng)肺；或(9)經(jīng)鼻。當本發(fā)明化合物以藥物形式投予人類及動物時，其本身可給與或以醫(yī)藥組成物形式給與，該醫(yī)藥組成物含有例如約0.1%至99%，或約1%至50%，或約10%至40%，或約10%至30%，或約10%至20%，或約10%至15%的活性成分以及醫(yī)藥學上可接受的載劑。
[0095]濕潤劑、乳化劑及潤滑劑(諸如月桂基硫酸鈉及硬脂酸鎂)以及著色劑、脫模劑、涂布劑、甜味劑、調(diào)味劑及香化劑、防腐劑及抗氧化劑亦可存在于本文所述的醫(yī)藥組成物中。此等組成物亦可含有佐劑，諸如防腐劑、濕潤劑、乳化劑及分散劑?？山逵砂ǜ鞣N抗細菌劑及抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸及其類似物)來確保防止微生物對本發(fā)明化合物的作用。在組成物中亦可能需要包括等張劑，諸如糖、氯化鈉及其類似物。另外，可藉由包括延遲吸收劑(諸如單硬脂酸鋁及明膠)來使得可注射藥物形式的吸收延長。
[0096]實施例1-自麥盧卡蜂蜜中分離經(jīng)MGO修飾的王漿主蛋白蛋白質(zhì)
[0097]如下將自Honey Research Unit, University of Waikato, NZ 獲得且非過氧化物抗細菌活性等效于12%w/v苯酹(Allen, Molan等人，1991)的麥盧卡蜂蜜樣本份化:
[0098]1.1去除蜂蜜的低分子量組分
[0099]將25公克麥盧卡蜂蜜懸浮于25ml蒸餾水中且在4°C下針對I公升自來水透析(Cellu Sep Tl 管，Membrane Filtration Products 公司，Seguin, TX ;EEUU,分子質(zhì)量截留3500Da)48小時，在此期間更換I公升水四次。凍干透析保留物且接著儲存于_20°C下直至分析為止。用0.3mol/l乙酸銨緩沖液將凍干樣本復原至2ml。
[0100]1.2葡聚糖凝膠G-50層析分離
[0101]接著將復原的透析保留物(2ml)加載至葡聚糖凝膠G-50管柱(180ml)上且將物質(zhì)于Iml洗提份中(流速:0.5毫升/分鐘，在280nm下監(jiān)測)洗提。凍干自圖3中所示的2個峰獲得的洗提份且用純水復原至100 μ I以在吞噬作用分析法中進行初步評定。此分析法顯示抑制活性在于首先洗提的峰中。進行進一步層析分離以產(chǎn)生較大量的蛋白質(zhì)。重復葡聚糖凝膠G-50管柱層析三次且將來自各次操作的洗提跡在線的第一峰的洗提份匯集于一起，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至200 μ I且接著在Superosel2管柱上分離。
[0102]1.3蛋白質(zhì)經(jīng)Superosel2的快速蛋白質(zhì)液相層析(FPLC)分離
[0103]為進一步份化葡聚糖凝膠G-50洗提跡在線的第一峰，將100 μ I量的復原樣本注射至Superosel2FPLC管柱(25ml)上且用磷酸鹽緩沖鹽水(pH7.11)(流速:0.5毫升/分鐘,0.5cm/ml,在280nm下監(jiān)測)洗提成Iml洗提份。此等洗提份冷凍于_20°C下直至進一步使用為止。在吞噬作用分析法中分析所得兩個明顯分離的主峰(洗提份8及14)的抑制活性。使此等洗提份在10%SDS-PAGE凝膠上進行電泳且處理用于MALD1-TOF質(zhì)譜識別。
[0104]1.4活性洗提份的逆相
[0105]在逆相管柱上對來自SUpeix)Se12層析的發(fā)現(xiàn)具有吞噬作用抑制活性的洗提份(洗提份8)進行層析以進一步純化蛋白質(zhì)以供MALDI質(zhì)譜識別之用。使用FPLC系統(tǒng)(Pharmacia-LKB, Uppsala, Sweden)上的管柱進行層析。將500 μ I量的洗提份8樣本注射于管柱上且用移動相以100%水至100%乙腈的梯度(流速為I毫升/分鐘，在260nm下監(jiān)測)洗提。將所得包含兩個主峰的洗提份(洗提份23及26)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至50μ1。將洗提份(5μ I)加載至10%SDS小型凝膠上以使其顯現(xiàn)且處理用于如下文所述的MALD1-T0F質(zhì)譜法。
[0106]實施例2:使用THP-1細胞的吞噬作用抑制分析法(PIA)
[0107]吞噬作用為吞沒固體粒子的細胞反應或過程且在免疫系統(tǒng)中，其為用于移除病原體及細胞碎片的主要機制。細菌、死組織細胞及小礦物質(zhì)粒子皆為可能由細胞吞噬或吞沒的目標的實施例。吞噬作用在白血球發(fā)炎反應開始時出現(xiàn)以引發(fā)炎癥。當細胞中吞噬作用激活時由細胞產(chǎn)生的反應性氧物質(zhì)及細胞激素募集且使更多吞噬細胞活化作為為皆以吞噬開始的發(fā)炎反應的細胞事件的級聯(lián)的一部分。因此，任何吞噬作用抑制劑可恰好在級聯(lián)開始時有效地阻止發(fā)炎反應。
[0108]量測廣泛類型的新西蘭蜂蜜的吞噬作用抑制活性。發(fā)現(xiàn)麥盧卡蜂蜜總體上比其他類型具有高得多的活性，如下表I所示，其展示不同類型的蜂蜜(0.5%)對LPS活化的THP-1細胞中乳膠粒子的吞噬作用的影響。在添加乳膠粒子后4小時進行分析。藉由用無菌RPMI1640完全培養(yǎng)基稀釋蜂蜜達成麥盧卡蜂蜜及人工蜂蜜的濃度。麥盧卡蜂蜜是自HoneyResearch Unit, University of Waikato, NZ獲得且具有等效于12%w/v苯酌.的非過氧化物抗細菌活性(Alien，Molan等人，1991)。藉由稱取1.37g蜂蜜(每毫升蜂蜜密度)且在臨用于無菌RPMI1640中之前用19ml MilliQ水稀釋此蜂蜜(5%V/V濃度)并過濾(50 μ m、8 μ m及3 μ m,Minisart Sart orius過濾器，Millipore公司)以移除花粉、蜜蜂組織等來稀釋蜂蜜。在深色容器中將未稀釋的蜂蜜保持于4°C下以防止酶變性及降解。人工蜂蜜是用于提供蜂蜜中所見的天然糖的滲透效應的對照物。此人工蜂蜜的組成是如所公開(White 1975)。
[0109]熟知新西蘭生產(chǎn)的一些類型的蜂蜜可能已具有一些麥盧卡花蜜，該麥盧卡花蜜亦包括于其中而由蜜蜂產(chǎn)生，這是因為麥盧卡在整個新西蘭廣泛地生長且為蜜蜂的有利花蜜來源。
[0110]表I
[0111]
蜂蜜類型I吞噬作用之降低百分比
蜜場蜂蜜(Pasture honey)13%±4%
苜蓿蜜6% ±4%
卡努卡蜂蜜(Kanuka honey) 15%±3%
【權(quán)利要求】
1.一種分離的王漿主蛋白(apalbumin)蛋白質(zhì)或其片段，其已經(jīng)甲基乙二醛(MGO)化學修飾。
2.如權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，其為經(jīng)修飾的王漿主蛋白I(Apal)蛋白質(zhì)或其片段。
3.如權(quán)利要求1或2的蛋白質(zhì),其是自麥盧卡蜂蜜(manukahoney)分離。
4.如權(quán)利要求2或3的蛋白質(zhì)，其具有至少17個經(jīng)MGO修飾的氨基酸殘基。
5.如權(quán)利要求2至4中任一項的蛋白質(zhì)，其具有17個至32個經(jīng)MGO修飾的氨基酸殘基。
6.如權(quán)利要求2至5中任一項的蛋白質(zhì)，其具有約32個經(jīng)MGO修飾的氨基酸殘基。
7.如權(quán)利要求2至6中任一項的蛋白質(zhì)，其中該等經(jīng)修飾的氨基酸殘基為賴氨酸或精氨酸。
8.如權(quán)利要求2至7中任一項的蛋白質(zhì)，其中該等經(jīng)修飾的氨基酸殘基為賴氨酸。
9.一種組成物，其包含權(quán)利要求1至8中任一項的分離的蛋白質(zhì)。
10.一種分離的經(jīng)MGO修飾的王漿主蛋白蛋白質(zhì)或其片段，其具有抗發(fā)炎能力，其包含與SEQ ID NOl中所述的氨基酸序列具有至少75%序列一致性的氨基酸序列。
11.一種分離的經(jīng)MGO修飾的王漿主蛋白蛋白質(zhì)或其片段，其具有抗發(fā)炎能力，其包含與SEQ ID NOl中所述的氨基酸序列具有至少85%序列一致性的氨基酸序列。
12.—種分離的經(jīng) MGO修飾的王漿主蛋白蛋白質(zhì)或其片段，其具有抗發(fā)炎能力，其包含與 SEQ ID NOl 中所述的氨基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的氨基酸序列。
13.如權(quán)利要求10至12中任一項的分離的經(jīng)MGO修飾的王漿主蛋白蛋白質(zhì)或其片段，其是自麥盧卡蜂蜜分離。
14.一種組成物，其包含權(quán)利要求10至12中任一項的蛋白質(zhì)。
15.—種藉由修飾蜂王衆(zhòng)產(chǎn)生抗發(fā)炎分子的方法，該方法包括使蜂王衆(zhòng)與至少0.1%MG0反應的步驟。
16.如權(quán)利要求15的方法，其包括使該蜂王漿與至少0.5%MG0反應的步驟。
17.如權(quán)利要求16的方法，其包括使蜂王漿與至少1.0%MG0反應的步驟。
18.如權(quán)利要求15至17中任一項的方法，其中該方法進一步包括自該蜂王漿產(chǎn)物分離經(jīng)MGO修飾的王漿主蛋白(MRJPI)蛋白質(zhì)的步驟。
19.一種減輕蜂巢組織中的炎癥的方法，其包含使權(quán)利要求8或14的組成物與該蜂巢組織接觸的步驟。
20.一種降低免疫系統(tǒng)細胞的吞噬率的方法，其包含投予免疫系統(tǒng)細胞權(quán)利要求8或14的組成物的步驟。
21.—種抑制免疫系統(tǒng)細胞上用于吞噬的受體的方法，其包含投予免疫系統(tǒng)細胞權(quán)利要求8或14的組成物的步驟。
22.—種減少發(fā)炎細胞的呼吸爆發(fā)及活性氧物質(zhì)釋放的方法，其包含投予該等發(fā)炎細胞權(quán)利要求8或14的組成物的步驟。
23.—種識別蜂蜜樣本的(i )抗發(fā)炎能力或(ii )經(jīng)MGO修飾的王漿主蛋白濃度的方法，其包含以下步驟: a)分析該蜂蜜樣本的熒光，及b)藉由將一蜂蜜樣本的熒光量測值以及一或多種蜂蜜樣本的抗發(fā)炎能力與先前已經(jīng)量測的抑制吞噬作用能力比較，來使該蜂蜜樣本的熒光量測值與該蜂蜜樣本的抗發(fā)炎能力具相關(guān)性。
24.如權(quán)利要求23的方法，其中該經(jīng)MGO修飾的王漿主蛋白為經(jīng)修飾的王漿主蛋白I蛋白質(zhì)(經(jīng)修飾的MRJPl)。
25.如權(quán)利要求23的方法，其中該方法是用于使得養(yǎng)蜂人能夠確定自蜂房收集蜂蜜以獲得含有所需抗發(fā)炎能力或經(jīng)MGO修飾的王漿主蛋白含量的蜂蜜樣本的恰當時機。
26.如權(quán)利要求23的方法，其中該方法是用于使得蜂蜜生產(chǎn)者能夠確定儲存蜂蜜以獲得具有所需抗發(fā)炎能力及經(jīng)MGO修飾的王漿主蛋白含量的蜂蜜樣本的所需持續(xù)時間。
27.一種增強一或多種王漿主蛋白蛋白質(zhì)的抗發(fā)炎能力的方法，其是藉由用MG0、甲醛、乙二醛及/或戊二醛化學處理來達成。
28.一種提高蜂蜜樣本的抗發(fā)炎能力及經(jīng)MGO修飾的王漿主蛋白蛋白質(zhì)含量的方法，其包含將MGO或MGO前驅(qū)分子添加至蜂蜜樣本中的步驟。
29.如權(quán)利要求27或29的方法，其中該王漿主蛋白蛋白質(zhì)為經(jīng)修飾的王漿主蛋白I蛋白質(zhì)。·
【文檔編號】G01N33/533GK103429614SQ201180062599
【公開日】2013年12月4日 申請日期:2011年12月22日 優(yōu)先權(quán)日:2010年12月22日
【發(fā)明者】阿嫚達·比恩, 彼得·莫藍, 雷·庫森斯 申請人:曼努卡米德有限公司