基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及基因及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國(guó)蜜蜂飼養(yǎng)歷史悠久，蜜蜂種質(zhì)資源豐富，但是長(zhǎng)久以來(lái)，我國(guó)境內(nèi)僅發(fā)現(xiàn)存在 東方蜜蜂，并無(wú)原生的西方蜜蜂。東方蜜蜂采集能力稍次于西方蜜蜂，伴隨著西方蜜蜂的引 進(jìn)，我國(guó)養(yǎng)蜂者越累越多的開(kāi)始飼養(yǎng)西方蜜蜂，我國(guó)原生蜂種質(zhì)資源受到威脅。引進(jìn)的資源 對(duì)我國(guó)本地群體造成了威脅；同時(shí)引進(jìn)資源也存在一定程度的不適應(yīng)本地環(huán)境的問(wèn)題。如 果能夠在我國(guó)境內(nèi)找到原生的西方蜜蜂對(duì)我國(guó)蜜蜂種質(zhì)資源有著重要意義。中國(guó)蜜蜂種質(zhì) 資源委員會(huì)主任石巍老師與新疆自治區(qū)蜂業(yè)管理站工作人員一直從事加強(qiáng)對(duì)新疆原有伊 犁黑蜂保護(hù)的工作，經(jīng)過(guò)多年的努力，首次在中國(guó)新疆伊犁境內(nèi)發(fā)現(xiàn)歐洲黑蜂自然種群，并 且與目前國(guó)際上已知的西方蜜蜂亞種至少存在9萬(wàn)年的分化，證明中國(guó)也是西方蜜蜂的原 產(chǎn)地，結(jié)束了我國(guó)沒(méi)有西方蜜蜂自然種群分布的歷史，這在畜禽資源研究方面具有很大的 突破性意義。中國(guó)的西域黑蜂個(gè)體較大、越冬性能好、抗逆性強(qiáng)、抗病能力十分突出，而且蜂 王產(chǎn)卵力強(qiáng)，能維持強(qiáng)群和蜂群極大的采集能力，既可作為推廣普及的新品種，也可以作為 育種素材，作進(jìn)一步的深入育種研究，具有很好的發(fā)展前景。
[0003] 中國(guó)發(fā)現(xiàn)原生的西方蜜蜂，在國(guó)內(nèi)外產(chǎn)生了較大的影響，但西域適應(yīng)黑蜂本地環(huán) 境的重要基因尚沒(méi)有記錄。為了更加深入的保護(hù)西域黑蜂，有效的利用西域黑蜂為我國(guó)蜜 蜂育種工作服務(wù)，提供西域黑蜂特有的基因具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明提供了西域黑蜂的基因及其應(yīng)用。本發(fā)明采用全基因組測(cè)序?qū)?西域黑蜂大量個(gè)體進(jìn)行全基因組重測(cè)序，獲得了西域黑蜂特有的基因。
[0005 ]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明提供了基因，具有：
[0007] (I)如SEQ ID No. l(Foxo基因）或SEQ ID No.2(Ebony基因）所示的核苷酸序列；或 [0008] (Π )如SEQ ID No. 1或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的互補(bǔ)序列；或
[0009] (ΙΠ )與（I)或（Π )的核苷酸序列編碼相同蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而與（I) 或（Π )的核苷酸序列不同的序列;或
[0010] (IV)具有SEQ ID NO: 1或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè) 或多個(gè)核苷酸序列獲得的核苷酸序列，且與SEQ ID NO: 1或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列 功能相同或相似的核苷酸序列。
[0011]
[0012]在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述多個(gè)核苷酸序列為2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、 7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)或13個(gè)。作為優(yōu)選，如SEQ ID No. l(Foxo基因）中所述多個(gè)核 苷酸序列為2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)或7個(gè);SEQ ID No.2(Ebony基因）所示的核苷酸序列中所 述多個(gè)核苷酸序列為2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)或13個(gè)。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種含有所述基因（Foxo基因或Ebony基因）的重組DNA。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種表達(dá)載體，插入所述重組DNA，并以微生物、動(dòng)物細(xì)胞或植物 細(xì)胞作為宿主細(xì)胞。
[0015 ]本發(fā)明還提供了一種由所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子。
[0016]本發(fā)明還提供了所述基因（Foxo基因或Ebony基因）在物種鑒定中的應(yīng)用；所述物 種包括西域黑蜂。
[0017]此外，本發(fā)明還提供了所述基因（Foxo基因或Ebony基因）在物種資源遺傳多樣性 中的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明還提供了所述基因(Foxo基因或Ebony基因）在抗寒中的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明還提供了一種鑒定西域黑蜂的引物組，包括能夠擴(kuò)增所述基因（Foxo基因 或Ebony基因）的引物。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種鑒定西域黑蜂的試劑盒，包括所述引物組。
[0021] 本發(fā)明還提供了一種鑒定西域黑蜂的方法，包括如下步驟：
[0022]步驟1:獲得待測(cè)品種的DNA;
[0023] 步驟2:通過(guò)基因比對(duì)，如果含有所述基因（Foxo基因或Ebony基因），則所述待測(cè)品 種為西域黑蜂;反之，如果不含有所述基因（Foxo基因或Ebony基因），則所述待測(cè)品種不為 西域黑蜂。
[0024] 本發(fā)明提供了西域黑蜂特有的基因序列。全基因組測(cè)序，即對(duì)一種生物的基因組 中的全部基因進(jìn)彳丁測(cè)序，測(cè)定其DNA的喊基序列。全基因組測(cè)序覆蓋面廣，能檢測(cè)個(gè)體基因 組中的全部遺傳信息，準(zhǔn)確性高。每個(gè)個(gè)體從受精卵開(kāi)始就繼承了父母的DNA遺傳信息，并 且攜帶一生，不易改變。全基因組測(cè)序就是通過(guò)運(yùn)用新一代高通量DNA測(cè)序儀，進(jìn)行10-20倍 覆蓋率的個(gè)體全基因組測(cè)序，然后與該物種基因組精確圖譜比較，得到完整的個(gè)體全基因 組序列，破譯個(gè)體全部的遺傳信息的過(guò)程。全基因組重測(cè)序的個(gè)體，通過(guò)序列比對(duì)，可以找 到特定物種（品種)特有的大量的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)。本發(fā)明首次鑒定出了西域黑 蜂適應(yīng)寒冷氣候的關(guān)鍵基因。包括2個(gè)基因：F 〇X〇、Eb〇ny。這些基因在西域黑蜂與其它地區(qū) 蜜蜂的分化及西域黑蜂對(duì)本地環(huán)境的適應(yīng)性進(jìn)化具有重要作用。
[0025] 本發(fā)明提供的Foxo基因或Ebony基因能夠用于鑒定西域黑蜂與其他物種；也能夠 用于研究蜂的物種資源遺傳多樣性;還能夠用于研究抗寒基因。這將填補(bǔ)我國(guó)科研人員在 西域黑蜂領(lǐng)域的研究空白。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。
[0027] 圖1示2個(gè)基因在西域黑蜂和其它代表性群體(歐洲黑蜂、非洲蜜蜂）中的基因樹(shù)； [0028]圖2示基因組DNA提取結(jié)果圖；所有樣品均獲得高質(zhì)量的大片段DNA，所有樣品中未 出現(xiàn)明顯降解；圖中"標(biāo)"為標(biāo)準(zhǔn)品上樣5ul(10ng/ul);M_l為T(mén)rans 2k plus DNA分子量標(biāo) 準(zhǔn)，上樣2ul;M-2為T(mén)rans 15k plus DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，上樣2ul;其余為樣品DNA;
[0029]圖3以)示利用？^3&」4111&'8〇和011幾個(gè)統(tǒng)計(jì)量對(duì)兩個(gè)基因進(jìn)行掃描，均檢測(cè)出明 顯的受選擇信號(hào)，表示該基因在西域黑蜂中受到了特定的自然選擇；圖3(B)顯示了兩個(gè)基 因具有特殊的DNA序列;基因區(qū)的SNP位點(diǎn)；與其它亞種相比有明顯基因型差異。
【具體實(shí)施方式】
[0030]本發(fā)明公開(kāi)了西域黑蜂的基因及其應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適 當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類(lèi)似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō) 是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn) 行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用 進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0031 ]本發(fā)明提供的基因的獲得與檢測(cè)方法如下：
[0032] 1.樣品采集。采集活體蜜蜂樣品，并盡快放入90%酒精中保存。在本發(fā)明的另一些 具體實(shí)施方案中，樣品保存，除了90%酒精保存，也可以用純度更高的酒精，或者液氮、干冰 等低溫保存方式。
[0033] 2.提取樣品高質(zhì)量DNA(脫氧核糖核酸）。
[0034] 3.將DNA樣品進(jìn)行I Ilumina高通量測(cè)序，獲得DNA序列原始數(shù)據(jù)。DNA高通量測(cè)序可 采用任何高通量測(cè)序平臺(tái)，除上述IIlumina平臺(tái)外，還可以選用SOLiD平臺(tái)，454測(cè)序等二 代、三代測(cè)序平臺(tái)。
[0035] 4.過(guò)濾掉低質(zhì)量序列。過(guò)濾規(guī)則包括：1)末端"N"的個(gè)數(shù)應(yīng)小于等于序列長(zhǎng)度的 10% ;2)測(cè)序質(zhì)量低于5的堿基數(shù)應(yīng)不超過(guò)序列長(zhǎng)度的50%。
[0036] 5.以西方蜜蜂（Apismellifera)在NCBI公共數(shù)據(jù)庫(kù)上的基因組為參考基因組 (apiMel4.5)，利用BWA軟件進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)參數(shù)為"_t_k 32-M-R"。參考基因組最新版 本為apiMel4.5,更新版的參考基因組發(fā)布后，可采用新版參考基因組。
[0037] 6.利用SAMtools'mpileup程序獲得群體的SNP基因型，將獲得的基因型進(jìn)行過(guò)濾， 獲得最后的結(jié)果。過(guò)濾的規(guī)則有：1)質(zhì)量值應(yīng)不小于20; 2)在序列間隔處5個(gè)堿基以?xún)?nèi)的SNP 應(yīng)過(guò)濾掉;3)測(cè)序深度應(yīng)當(dāng)大于等于4,小于等于1000;獲得SNP基因型的程序可以