紅花myb12基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬生物工程領(lǐng)域，具體涉及紅花的MYB12基因及其在培育高黃酮含量的轉(zhuǎn) 基因植物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] mCarthamustinctoriush.、%一年生草本植物，為菊科、紅花屬植物。紅花 黃色素（safflor yellow)作為其主要有效成分，是從其干燥管狀花中分離的水溶性查爾酮 的混合物，具有活血化瘀，通脈止痛等功效，被廣泛應(yīng)用在冠心病、高血壓、腦梗塞、抗腫瘤、 糖尿病并發(fā)癥、慢性腎病等疾病上?？梢?，紅花黃色素是一種極具潛力的天然藥物。雖然紅 花的種植面積在我國不斷擴大，但仍未能解決紅花黃色素資源匱乏問題。提高紅花自身黃 色素含量，培育高產(chǎn)黃色素的紅花新品系，具有重要經(jīng)濟意義。
[0003] 紅花黃色素屬于植物次生代謝產(chǎn)物黃酮類化合物。在植物次生代謝中，黃酮類的 生物合成是目前研宄最為深入的次生代謝途徑。植物黃酮類生物合成途徑主要由兩類基因 控制：結(jié)構(gòu)基因和調(diào)芐基因。其中，結(jié)構(gòu)基因直接編碼與黃酮類次生代謝生物合成有關(guān)的 各種酶類，而調(diào)芐基因則是控制結(jié)構(gòu)基因表達強度和表達方式的一類基因，包括MYB、NAC、 WARY等。目前，與黃酮類生物合成的主要結(jié)構(gòu)基因和調(diào)芐基因在多種植物中被克隆。盡管 已有學(xué)者利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將控制黃酮類次生代謝的關(guān)鍵酶基因或其反義序列導(dǎo)入植物， 通過促進或抑制該基因的表達，改變了黃酮類次生代謝途徑，然而植物類黃酮生物合成途 徑是非常復(fù)雜的，涉及到的酶種類繁多，有時并不是一兩個關(guān)鍵酶所能控制。這種方法不能 誘導(dǎo)整個代謝通路表達，只可以獲得某一產(chǎn)物表達量的增高，但這遠遠達不到實際應(yīng)用的 需求，而通過轉(zhuǎn)錄因子作用，可以直接激活整個代謝通路，有可能激活類黃酮次生代謝途徑 中多個結(jié)構(gòu)基因的表達，達到的效果將比導(dǎo)入某個結(jié)構(gòu)基因的作用更明顯。
[0004] MYB蛋白作為調(diào)控因子，參與黃酮類化合物生物合成并發(fā)揮重要的作用，是目前植 物黃酮類化合物代謝分子生物學(xué)領(lǐng)域研宄的熱點之一。其中的R2R3類MYB蛋白在植物花 色形成以及類黃酮代謝的調(diào)控起到重要的作用。Sitakanta Pattanaik等在煙草中分離到 了一個R2R3類的MYB基因NtAN2,它是在花瓣中特異表達的。NtAN2基因在煙草和擬南芥 中表達后，類黃酮代謝途徑中的上下游相關(guān)基因都上調(diào)表達，而在煙草中用RNAi技術(shù)抑制 NtAN2的表達后，得到的是開白花的煙草，類黃酮代謝途徑中下游基因的表達都受到了抑 制。然而，有關(guān)調(diào)控黃酮代謝的紅花MYB的研宄還未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是為提高植物中黃酮化合物含量，而提供一種紅花MYB基因。
[0006] 紅花MYB基因，其堿基序列如核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 紅花MYB基因，它是將塔城紅花花瓣中的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，用 引物： CtMYB12-l ：ATGAAGGAGCGTCAACG CtMYB12-2 ：TTAACTCAACCCATGATGATG 進行PCR擴增獲得。
[0008] -種表達載體，它是在植物表達載體中插入了如序列表SEQ ID NO. 1所示的基 因； 所述的植物表達載體為pBASTA。
[0009] 紅花MYB基因在培育高黃酮含量的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用； 所述的植物為紅花或擬南芥。
[0010] 本發(fā)明提供了一個紅花MYB基因，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因表達特性，通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)黃 酮代謝相關(guān)基因的表達，能夠提高紅花中總黃酮的含量，為培育高黃酮含量新品系奠定了 堅實的基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0011] 圖1通過RT-PCR擴增出798bp的含有起始密碼子的片段（圖1A)，回收后的片段連 接到pEASY-Tl上，進一步通過菌液PCR (圖1B)和沉況1和班III酶切鑒定（圖1C); 圖 2 為 3' RACE ; 圖3紅花MYB全長基因電泳圖； 圖4 pBASTA載體圖譜； 圖5 MYB12基因的原核表達電泳圖； 圖 6 pBASTA-MYB12 菌液 PCR 驗證； 圖7 pBASTA-MYB12重組子酶切驗證； 圖8轉(zhuǎn)基因擬南芥中黃酮含量測定。
【具體實施方式】
[0012] 實施例1紅花（toritts L )花辦RNA提取及cDNA合成 用TRIZOL Plus提取塔城紅花花瓣RNA，取1 y g總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA模板。
[0013] 實施例2 MYB基因的序列片段的驗證 根據(jù)本實驗室紅花454測序結(jié)果中挑選的候選基因，設(shè)計特異性引物(表1)，驗證基因 片段。根據(jù)驗證的MYB的基因片段，設(shè)計引物(表1)進行基因片段克隆。根據(jù)紅花454測序 結(jié)果拼接比對，獲得了 MYB基因的序列片段，通過RT-PCR擴增出798bp的含有起始密碼子 的片段（圖1A)，RT-PCR反應(yīng)體系見表2?；厥蘸蟮钠芜B接到pEASY-Tl(北京全式金生 物技術(shù)有限公司）上，進一步通過菌液PCR (圖1B)和沉況I和"i/?d III酶切鑒定（圖1C)， 測序結(jié)果正確。
[0014]
【主權(quán)項】
1.紅花MYB基因，其堿基序列如核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示。
2.紅花MYB基因，它是將塔城紅花花瓣中的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，用 引物： CtMYB12-1 ：ATGAAGGAGCGTCAACG CtMYB12-2 ：TTAACTCAACCCATGATGATG 進行PCR擴增獲得。
3. -種表達載體，它是在植物表達載體中插入了如序列表SEQ ID NO. 1所示的基因。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種表達載體，所述的植物表達載體為pBASTA。
5.紅花MYB基因在培育高黃酮含量的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
6. 權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的植物為紅花或擬南芥。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一個紅花MYB基因，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因表達特性，通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)黃酮代謝相關(guān)基因的表達，能夠提高紅花中總黃酮的含量，為培育高黃酮含量新品系奠定了堅實的基礎(chǔ)。
【IPC分類】A01H5-00, C12N15-29, C12N15-82
【公開號】CN104845978
【申請?zhí)枴緾N201510255199
【發(fā)明人】官麗莉, 李海燕, 李校堃, 楊晶, 杜林娜, 王法微, 董園園
【申請人】吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年5月19日