小細胞肺癌標志物胃泌素釋放肽前體多肽片段的dna核酸適體的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及化學生物學技術領域，更具體地說是涉及小細胞肺癌標志物胃泌素釋 放肽前體多肽片段的DNA核酸適體的序列篩選。
【背景技術】
[0002] 核酸適體（Aptamers)是從大容量的隨機寡核苷酸序列庫中針對非核酸靶分 子選擇得到的能與該靶分子高親合度高特異性結合的單鏈DNA或RNA分子，是通過 體外重復的吸附、恢復、再放大過程，從而實現對與靶分子相結合的寡核苷酸序列的 指數富集而得到的。這種選擇核酸適體的方法叫SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment，通過指數富集對配體的系統(tǒng)進化），在1990年 分別由 Tuerk and Gold(文獻：C. Tuerk, L. Gold, Systematic evolution of ligands by exponential enrichment:RNA ligands to bacteriophage T4DNA polymerase, S cience，1990, 249:505-510)以及 Ellington and Szostak(文獻：A.D. Ellington，J. W. Szostak, In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands, Nature 1990,346:818-822)兩個研究小組獨立報導。核酸適體除了具有與抗體相似的對靶分 子的高親合度和高特異性結合外，還具有如下抗體所不具備的優(yōu)點：i)容易生產，生產 周期短；2)靶分子適應范圍寬：核酸適體的靶分子包括各種蛋白質（酶、膜蛋白、病毒蛋 白、細胞因子和生長因子、免疫球蛋白等）、氨基酸、藥物、金屬離子、其他生物/無機/有 機小分子、以及整個細胞，而抗體只能被用于免疫源性化合物；3)生產成本低；4)易于 修飾；5)化學穩(wěn)定性以及熱穩(wěn)定性強，儲存壽命長。核酸適體自出現以后，就得到了各 個領域的廣泛關注，特別是近年來在生物傳感器、新藥開發(fā)等領域的應用取得了一定的 成果。最近，小細胞肺癌標志物胃泌素釋放肽前體（pro-gastrin-releasing peptide， Pro-GRP (1 - 98a. a.))的 DNA 核酸適體被報道（M. Mie, T. Kai 1，T. Le, A. E. G. Cass, E. Kobatake，Selection of DNA aptamers with affinity for pr〇-gastrin-releasing peptide (proGRP)，a tumor marker for small cell lung cancer, Applied Biochemistry and Biotechnology，2013, 169:250-255)。Pro-GRP 是一種小細胞肺癌腫瘤標志物D 研 究表明，Pro-GRP的活性位點位于其31-98a. a，因而，Pro-GRP的31-98a. a.多肽片段 (Pr〇-GRP31_98)是一種新的、敏感、特異、可靠的小細胞肺癌腫瘤標志物。目前未見篩選 Pr〇-GRP 31_9j^ DNA核酸適體序列的相關報道。

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明目的在于提供針對Pro-GRP^gj^ DNA核酸適體序列，為后期生物傳感器、 臨床診斷試劑研發(fā)提供方便。
[0004] 為實現本目的，本發(fā)明通過基于親和磁珠分離法的SELEX篩選方法，從單鏈 DNA (ssDNA)文庫中篩選出Pr〇-GRP31_9i^ DNA核酸適體文庫，然后對篩選出的DNA適體文庫 經聚合酶鏈式反應（PCR)擴增后，以大腸桿菌為受體細胞通過基因克隆技術對DNA適體文 庫中的DNA核酸適體進行分離，通過測序技術確定各條DNA核酸適體的序列，最后通過電化 學發(fā)光（ECL)法，以[Ru (bpy) 2dppz]2+為DNA分子開關和ECL試劑，對各條DNA核酸適體針 對Pr〇-GRP 31_9i^結合特異性和結合力進行分析檢測，確定針對Pro-GRP 31_98的高親和力、特 異性DNA核酸適體序列。
[0005] 原理及具體技術方案如下：
[0006] SELEX篩選過程由構建DNA文庫、孵育、分離和PCR擴增四個步驟組成。其中孵育、 分離和PCR擴增步驟交替重復12次。構建的DNA文庫序列為：5' -CTTCTGCCCGCCTCCTTCC-(48nt)-GGAGACGAGATAGGCGGACACT-3, 。
[0007] DNA文庫序列委托生物技術公司化學合成。然后將Pr〇-GRP31_98通過酰胺鍵固定在 羧基修飾的磁珠上，與合成的隨機DNA文庫孵育。經磁力吸附將孵育后的磁珠與溶液分離。 然后以結合寡核苷酸的磁珠為PCR擴增的模板，用熒光修飾的正向引物和生物素修飾的反 向引物進行PCR擴增。該PCR擴增過程在DNA文庫中引入熒光標記，并同時在DNA文庫的 互補鏈上引入生物素。PCR擴增后得到的熒光/生物素修飾的雙鏈DNA與鏈霉親和素修飾 的磁珠通過形成鏈霉親和素-生物素復合物進行結合。然后通過堿變性和磁力吸附分離得 到熒光ssDNA文庫。分離得到的熒光ssDNA文庫進入下一輪的孵育、分離和PCR擴增程序。 在篩選過程中，與熒光ssDNA文庫孵育后的Pr〇-GRP 31_98包被磁珠在分離后進行熒光檢測以 實時監(jiān)測篩選的進程。
[0008] 上述篩選過程進行6輪后每隔1-3輪將上輪得到的熒光ssDNA文庫與固定了牛血 清白蛋白的磁珠以及固定了牛胰島素的磁珠分別孵育，進行反篩，以提高DNA適體文庫對 酶切的結合特異性。經磁力吸附將孵育后的磁珠與溶液分離，然后將得到的溶液作為熒光 ssDNA文庫進入下一輪的孵育、分離和PCR擴增程序。
[0009] 最后，經12輪篩選后得到的DNA適體文庫經PCR擴增后，利用TA克隆，克隆到T 載體中，轉化Trans5 a感受態(tài)大腸桿菌受體細胞，在含有Amp (Amp終濃度為100 μg/ml)， IPTG和X-gal的LB固體培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)過夜，通過藍白斑篩選陽性克隆。然后從過夜 培養(yǎng)的平板上挑取白色菌落，用通用引物做菌落PCR驗證克隆的陽性。挑選陽性重組子接 種于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中37°C振蕩過夜，提取質粒進行酶切，對酶切產物進行瓊脂 糖凝膠，進一步鑒定克隆的陽性。對陽性克隆進行測序，得到Pr〇-GRP 31_98的核酸適體序列。
[0010] 經過序列同源性比對和OligoAnalyzer 3. 1在線工具模擬二級結構分析，選擇其 中某些代表序列，并對其序列進行部分修改，對？1~〇-61^ 31_98進行親和力和結合特異性的檢 測及鑒定。
[0011] 親和力的檢測及鑒定方法如下：
[0012] 委托生物技術公司化學合成DNA核酸適體。將合成的DNA核酸適體用Binding Buffer(含 100mM NaCl，20mM Tris-HCl，2mM MgCl2,5mM KCl，lmM CaCl2，和 0.02% Tween 20，pH = 7.6)溶解。DNA溶液的標準濃度通過測定溶液在紫外可見光譜260nm波長處的吸 光度，由Lambrt-Beer定律A = | *c*L計算得到。式中A為吸光度、|為摩爾消光系數、c 為溶液濃度、L為液層厚度。
[0013]然后，將10yL lOOyM 的 DNA核酸適體的 TE(10mM Tris-HCl，lmM EDTA，pH = 8. 0)溶液經熱變性處理后與lmL 20 yM的[Ru(bpy)2dppz]2+(bpy:聯卩比啶；dppz:二卩比啶 并吩嗪）的5mM草酸溶液室溫混合，用玻碳電極和電化學發(fā)光分析儀實時檢測記錄該溶液 的電化學發(fā)光信號。待信號穩(wěn)定后（ECU)，在溶液中梯度批量加入Pr〇-GRP31_98溶液，并檢 測記錄不同Pr〇-GRP 31_98濃度（C)下的穩(wěn)定電化學發(fā)光信號（ECLD。由藥學公式AECL = AECLmaxCV(Kd+C)，推導出 1/ AECL = K/( AECLmaxC) +1/ AECLmax。其中 Kd為 DNA 核酸適體 與Pr〇-GRP31_98的解離常數，A ECL = ECL 。由1/ A ECL與1/C的線性關系直線，根據 直線斜率與截距的比值計算得到DNA核酸適體與Pr〇-GRP31_ 98之間的K d值。
[0014] 結合特異性的檢測及鑒定方法如下：
[0015] 將10yL lOOyM的DNA核酸適體的TE溶液經熱變性處理后與lmL 20yM的 [Ru (bpy) 2dppz]2+的5mM草酸溶液室溫混合混合，用玻碳電極和電化學發(fā)光分析儀實時檢 測記錄該溶液的電化學發(fā)光信號（ECU)。待信號穩(wěn)定后，分別在溶液中加入50yL 1.2mg/ ml的不同的蛋白質或多肽，包括Pr〇-GRP31_98、牛胰島素（Insulin)、牛血清白蛋白（BSA)、和 伴刀豆球蛋白（ConA)。在一次實驗的溶液中只加入一種蛋白質或多肽。加入蛋白質或多肽 后檢測記錄對應的穩(wěn)定電化學發(fā)光信號（ECLJ。將不同蛋白質或多肽的（ECU-ECL^/ECU 值做柱方分析圖。
[0016] 本發(fā)明創(chuàng)新點在于：
[0017] 1)通過SELEX技術，得到了 1條與Pr〇-GRP31_9^親和力、特異性結合的DNA核酸 適體：Aptamer-18。其DNA見序列表。
[0018] 2)對DNA核酸適體Aptamer-18的序列進行修改，得到另外2條針對Pr〇-GRP31_ 98 的高親和力、特異性DNA核酸適體：Aptamer-18 ^和Aptamer-18〃。其DNA見序列表。
[0019] 3)將上述三條DNA核酸適體針對？1~〇-61^31_ 98進行親和力和結合特異性檢測實驗， 確定其是Pr〇-GRP31_98的高親合度、高特異性DNA核酸適體。
[0020] 4)通過對上述三條DNA核酸適體的二級結構進行比對，推斷該三條DNA核酸適體 與 Pr〇-GRP31_9i^主要結合位點為序列 Aptamer_18B :5' -ccagatagtc cctgg-3'。
[0021] 本發(fā)明所述Pr〇-GRP31_9^ DNA核酸適體DNA序列見序列表中N01，N02, N03。N01為 Pro-GRP^-gJS酸適體 Aptamer-18 的 DNA 序列；N02 為 Pro-GRP 31_98核酸適體 Aptamer-18 ' 的 DNA 序列；N03 為 Pr〇-GRP31_9JS酸適體 Aptamer-18〃 的 DNA 序列。N01，N02, N03 序列長 度為 10nt 到 150nt。
【附圖說明】
[0022] 圖1為通過藍白斑篩選DNA適體文庫陽性克隆實驗后得到的部分白色菌落的PCR 擴增產物的1. 5%瓊脂糖凝膠電泳圖。圖中從左到右的泳道依次為1-24號菌落和Marker。 Marker 的分子大小由上到下依次是 5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp 和100bp。結果表明大部分白色菌落為陽性菌落，目的片段插入到了載體中，并且片段大小 正確，為345bp。陽性菌落