將用于下一步的質(zhì)粒提取、酶切及測序。大于500bp的片段可能 是由載體自連造成的。
[0023] 圖2是由陽性克隆提取的質(zhì)粒DNA用EcoR I酶切后得到的產(chǎn)物的1. 5%瓊脂糖凝 膠電泳圖。圖中從左到右的泳道依次為Marker和12個不同質(zhì)粒酶切后的產(chǎn)物。Marker的 分子大小由上到下依次是 5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp 和 100bp。 酶切實驗結(jié)果與理論上得到126bp和3004bp兩條片段相符，進一步證明所選白色菌落為陽 性菌落。
[0024] 圖3為本發(fā)明DNA核酸適體與其靶物質(zhì)或干擾蛋白質(zhì)結(jié)合前后的電化學(xué)發(fā)光強 度一電壓曲線，及反映結(jié)合前后電化學(xué)發(fā)光強度變化的柱方圖。其中A，B展示了草酸體系 (5mM，pH= 5.5)中 DNA 核酸適體 Aptamer-18(liiM)與[Ru(bpy)2dppz]2+(20tiM)結(jié)合后的 ECL。-電壓曲線（a)，及其進一步與60 y g ml/1的（A)Pro-GRP 31_98或⑶干擾蛋白質(zhì)BSA結(jié) 合后的ECL「電壓曲線（b)。曲線c為草酸溶液中只存在[R U(bpy)2dppz]2+時的電化學(xué)發(fā) 光強度一電壓曲線?？梢钥闯?，Aptamer-18結(jié)合Pro-GRP^iJg ECL值明顯降低（降低了 47% )，而與干擾蛋白質(zhì)BSA孵育后ECL值沒有明顯改變。C為Aptamer-18，Aptamer-W 和Aptamer-18"在[Ru(bpy) 2dppz]2+存在下與60yg rnL"不同蛋白質(zhì)（或多肽）結(jié)合前后 ECL峰值的相對變化值：（ECU-ECI^/ECL。的柱方圖。結(jié)果顯示，Aptamer-18，Aptamer-lV 和Aptamer-18〃三條DNA核酸適體與Pr〇-GRP 31_98結(jié)合后，其與[Ru (bpy) 2dppz]2+結(jié)合而產(chǎn) 生的ECL信號明顯降低，降低比例分別為47%，44%和81% ;而與所檢測干擾蛋白質(zhì)（或 多肽）孵育后ECL信號或沒有明顯變化，或變化值大大小于與Pr〇-GRP31_ 98結(jié)合的ECL信 號變化值。該結(jié)果說明這三條DNA序列均是針對Pr〇-GRP31_ 98的高特異性DNA適體，能與 Pr〇-GRP31_98特異性結(jié)合，與所檢測干擾蛋白質(zhì)（或多肽）沒有明顯的結(jié)合。
[0025] 圖 4 為草酸體系（5mM, pH = 5. 5)中 DNA 核酸適體 Aptamer-18 (1 y M)與 [Ru(bpy)2dppz]2+(20iiM)結(jié)合后，在梯度批量加入不同濃度的Pr〇-GRP 3H8時，Pr〇-GRP3h98 的濃度（C)的倒數(shù)1/C ( y M_〇與ECL變化值的倒數(shù)1/ A ECL的線性回歸關(guān)系曲線：1/ A ECL =2. 3X 10_3/C+3. 7X 10_4。由該直線得出 Aptamer-18 與 Pr〇-GRP31_982間的解離常數(shù) KA 6. 2 yM。采用同樣的方法，得出Aptamer-18 ^和Aptamer-18"與Pr〇-GRP31_98之間的解離 常數(shù)分別為8. 6和8. 1 yM。該結(jié)果說明Aptamer-18、Aptamer-18 ^和Aptamer-18"均可 以與？1~〇-61^31_98高親和力結(jié)合。
[0026] 圖 5 為米用 Integrated DNA Technologies 公司 OligoAnalyzer 3. 1 在線工具 對 Aptamer-18，Aptamer-18 '和 Aptamer-18"模擬的二級結(jié)構(gòu)。Aptamer-18 '是本發(fā)明 對Aptamer-18序列在不改變二級結(jié)構(gòu)的條件下減少核苷酸數(shù)目得到的序列。Aptamer-18， Aptamer-18^均含有兩個小的、主要以G-C配對形成的頸環(huán)結(jié)構(gòu)。Aptamer-18"含有四個 小的主要以G-C配對形成的頸環(huán)結(jié)構(gòu)。Aptamer-18，Aptamer_18 '和Aptamer-18"均含有 由5' -CCAGATAGTCCCTGG-3'序列形成的具有4個堿基對頸的頸環(huán)結(jié)構(gòu)（如圖5中箭頭指示 的圓圈區(qū)域），推測其為與Pr〇-GRP 31_98結(jié)合的主要結(jié)合位點，其應(yīng)為Pro-GRP 31_98的DNA核 酸適體序列。
[0027] 圖 6 為草酸體系（5mM, pH = 5. 5)中 Aptamer-18 (1 y M)在 [Ru(bpy)2dppz]2+(20 yM)存在下對（a)0,（b)0. 48,（c) 1. 44,（d) 1. 92,（e)2. 40,（f)2. 88 和 (g) 3. 36 y M Pr〇-GRP^_98響應(yīng)的ECL信號-電壓曲線。插圖為加入Pro-GRP 3卜98后ECL峰信 號強度的變化值（A ECL)與對應(yīng)Pr〇-GRP31_98&度的關(guān)系曲線。采用該ECL法對Pro-GRP 31_98 的最低檢測極限達到了 IX 1(T8M(信噪比=3)。在所測的Pr〇-GRP31_98&度范圍（0. 48 yM- 3. 36 yM)內(nèi)，ECL峰信號的變化值與Pr〇-GRP31_98的濃度成線性正相關(guān)，線性相關(guān)系數(shù)為 0.9969。
【具體實施方式】
[0028] 為對本發(fā)明進行更好的說明，對磁珠上偶聯(lián)蛋白及上述SELEX篩選過程的具體操 作步驟及方法描述如下：
[0029] 實施例：
[0030] (1)為了在羧基修飾的微米磁珠上偶聯(lián)蛋白，首先對磁珠上的羧基用1-乙 基-3-(3-二甲基氨丙基）-碳化二亞胺（EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺（Sulfo-NHS)進 行活化；活化后的磁珠用〇. 01M MES緩沖液（2. 13g/L嗎啉-乙磺酸*H20,0. 31g/L硼酸，pH =9. 0)洗滌后，與需要偶聯(lián)的蛋白質(zhì)或多肽在MES(0. 01M，pH = 9. 0)溶液中在分子雜交儀 上30°C振蕩反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后，磁珠經(jīng)磁回收，然后重懸于0.05M磷酸鹽緩沖液（PBS) (pH = 7. 4)中，形成lmg/mL的磁珠溶液。
[0031] (2) SELEX篩選過程中DNA孵育及PCR擴增的操作步驟：
[0032] 首先取30 y L濃度為lmg/mL的Pr〇-GRP31_98包被磁珠，用Binding Buffer充分 洗滌，然后將其重懸于300 yL Binding Buffer中備用。將溶解于Binding Buffer中 的ssDNA文庫分裝到四個500 y L的離心管中，95°C熱變性lOmin后立即置于冰浴中冷 卻lOmin。然后將經(jīng)過變性處理的ssDNA立即加入到上述靶蛋白磁珠溶液中，在分子雜交 儀上37°C振蕩孵育2h。最后，用強磁力收集并用無菌水洗滌磁珠，以該磁珠作為PCR的 模板，分裝到10個25yL PCR管中，每管中加入lyL濃度為10yM的正向引物F-FAM: 5' -FAM-CTTCTGCCCGCCTCCTTCC-3'，1 y L 濃度為 10 y M 的反向引物 R-Biotin :5' -Biotin-AGTGTCCGCCTATCTCGTCTCC-3'，2 y L 濃度為 2. 5mM 的脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP)，0. 25 y L TransTaq-T DNA 聚合酶（5units/yL)，2. 5 yL 10XTransTaq-T Buffer，18.25 yL 高純水， 進行PCR擴增。PCR擴增反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，58°C退火30s，72°C 延伸30s，擴增15-30輪，最后72°C再延伸10min。磁分離收集PCR擴增產(chǎn)物（即上清液）， 以進行DNA單鏈分離。
[0033] (3) SELEX篩選過程中DNA單鏈分離的操作步驟：
[0034] PCR擴增產(chǎn)物為雙鏈DNA，然后采用鏈霉親和素包被磁珠法將其分離生成ssDNA : 將2mL lmg/mL的鏈霉親和素包被磁珠溶液經(jīng)TE-NaCl溶液（10mM Tris-HCl，lmM EDTA， 2M NaCl，pH = 8. 0)充分洗滌后，溶于200 y L TE-NaCl溶液中，然后在該溶液中加入PCR 擴增后的上清液，孵育30min ;孵育結(jié)束后，將磁珠用強磁性分離并洗滌，然后在磁珠中加 入100 y L的0? 15M NaOH溶液，孵育10min ;然后在磁分離得到的上清液中加入50 y L左右 的0. 3M HC1，中和反應(yīng)體系中的NaOH，最后加入50yL Binding Buffer，渦旋混勾，得到約 200 y L的ssDNA溶液，作為下一輪篩選的ssDNA文庫。
[0035] 應(yīng)用例：
[0036] 本發(fā)明得到了三條能與？1~〇-61^31_98高親和力、高特異性結(jié)合的DNA核酸適體， 并將本發(fā)明得到的DNA核酸適體成功應(yīng)用于在草酸體系中以及[Ru (bpy) 2dppz]2+存在下 對卩1'〇-61^:>31_ 98進行靈敏、特異的 ECL 檢測。Primer-18Aptamer_18 '和 Aptamer-18"對 Pr〇-GRP31_98的最低檢測極限均達到了 10_8M。在所測的Pr〇-GRP31_9^度范圍（0.48yM- 3. 36yM)內(nèi)，ECL峰信號的變化值（AECL)與Pr〇-GRP31_98的濃度成線性正相關(guān)，線性相關(guān) 系數(shù)為0.9969。
[0037] 本發(fā)明所述的胃泌素釋放肽前體，其概念等同于胃泌素釋放前體肽。
【主權(quán)項】
1. 胃泌素釋放肽前體Pro-GRP 31-98 a. a.多肽片段的DNA核酸適體，其特征在于，其 DNA序列為NOl。
2. 胃泌素釋放肽前體Pro-GRP 31-98 a. a.多肽片段的DNA核酸適體，其特征在于，其 DNA序列為N02。
3. 胃泌素釋放肽前體Pro-GRP 31-98 a. a.多肽片段的DNA核酸適體，其特征在于，其 DNA序列為N03。
4. 如權(quán)利要求1一 3其中之一所述的DNA核酸適體，其特征在于，序列長度為10 nt到 150 nt〇
5. 胃泌素釋放肽前體Pro-GRP 31-98 a. a.多肽片段的DNA核酸適體，其特征在于，含 有如下DNA序列： ccagatagtc cctgg〇
【專利摘要】本發(fā)明公開了小細胞肺癌標(biāo)志物胃泌素釋放肽前體多肽片段Pro-GRP31-98的DNA核酸適體序列，涉及化學(xué)生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。該DNA核酸適體序列是通過基于親和磁珠分離法的SELEX（Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment，通過指數(shù)富集對配體的系統(tǒng)進化）篩選方法，從單鏈DNA文庫中篩選出來；然后對篩選出的DNA適體文庫經(jīng)PCR擴增后，以大腸桿菌為受體細胞通過基因克隆技術(shù)對DNA適體文庫中的DNA核酸適體進行分離；最后通過測序技術(shù)對各條DNA核酸適體進行測序得到的。結(jié)合實驗結(jié)果表明：本發(fā)明得到的DNA核酸適體序列與胃泌素釋放肽前體片段高親和度高特異性結(jié)合。
【IPC分類】C12N15-115
【公開號】CN104845975
【申請?zhí)枴緾N201510287204
【發(fā)明人】崔惠芳, 李亞軍, 王佳, 栗曉佳
【申請人】鄭州大學(xué)
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年5月29日