新型細(xì)菌rna提取試劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種RNA提取試劑及其制備方法，具體涉及一種新型細(xì)菌RNA提取試劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]RNA是存在于生物細(xì)胞內(nèi)將遺傳信息從DNA上轉(zhuǎn)移到功能蛋白上的信使或稱模板。近年來，隨著細(xì)菌基因組工程進(jìn)展，我們迎來了細(xì)菌的后基因組時(shí)代，通過研宄基因表達(dá)譜分析來闡釋基因的功能和基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制已成為目前研宄的熱點(diǎn)。RNA提取技術(shù)不僅是分子生物學(xué)技術(shù)的重要組成部分，也是功能基因組學(xué)科研技術(shù)的重要基礎(chǔ)。隨著細(xì)菌的后基因組時(shí)代的到來，尋求一種有效的提取細(xì)菌RNA的試劑和方法成為迫切需要解決的冋題。
[0003]CN102796727A (公開日為2012年11月28日)公開了.一種革蘭氏陽性細(xì)菌RNA的提取試劑，由破除革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁的試劑、結(jié)合液和洗滌液組成；破除革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁的試劑由提取液A和提取液B組成；所述提取液A按照如下方法制備:將 Tris、EDTA, SDS、Tween 80、Triton X-100、Brij 58、3_[ (3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、十二烷基肌氨酸鈉、β -巰基乙醇和水混合，得到提取液A ;所述提取液B按照如下方法制備:將水飽和酚、乙醇和吡咯烷酮混合，得到提取液B。所述結(jié)合液為濃度為4.6Μ的異硫氰酸胍水溶液；所述洗滌液為70% (體積百分含量)乙醇水溶液。
[0004]雖然上述現(xiàn)有技術(shù)公開了一些細(xì)菌RNA的提取試劑，能夠滿足一定的需要，但這些細(xì)菌RNA提取試劑仍存在一定的缺陷:利用上述方法提取的基因組DNA和總RNA中，基因組DNA和總RNA的量大約各占一半，總RNA的含量偏低，說明上述提取試劑在革蘭氏陽性菌總RNA提取的效率偏低，影響使用。
[0005]因此，對于革蘭氏陽性菌RNA的提取試劑存在進(jìn)一步的改進(jìn)和優(yōu)化需求，這也是該技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)的研宄熱點(diǎn)和重點(diǎn)之一，更是本發(fā)明得以完成的動(dòng)力和出發(fā)點(diǎn)所在。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的提取試劑在革蘭氏陽性菌總RNA提取效率偏低的技術(shù)問題，本發(fā)明人在進(jìn)行了大量的深入研宄之后，從而完成了本發(fā)明。
[0007]本發(fā)明涉及兩個(gè)方面，具體而言，涉及一種新型細(xì)菌RNA提取試劑及其制備方法。
[0008]第一方面，本發(fā)明涉及一種新型細(xì)菌RNA提取試劑，由細(xì)菌細(xì)胞壁破除試劑、結(jié)合液和洗滌液組成；所述細(xì)菌細(xì)胞壁破除試劑由提取液A和提取液B組成；所述提取液A由Tris, EDTA, SDS、Tween 80、Triton X-100、甘氨酸、十二烷基肌氨酸鈉、β-巰基乙醇和水組成；所述提取液B由水飽和酚、乙醇和吡咯烷酮組成；所述結(jié)合液為異硫氰酸胍水溶液；所述洗滌液為乙醇水溶液。
[0009]優(yōu)選的，所述甘氨酸在所述提取液A中的濃度為95mmol/L。
[0010]優(yōu)選的，所述Tris在所述提取液A中的濃度為10mmol/L ;所述EDTA在所述提取液A中的濃度為lOmmol/L ;所述SDS、Tween 80、Triton X-100、十二燒基肌氨酸鈉在所述提取液A中的質(zhì)量體積百分比濃度均為0.1% ;所述β-巰基乙醇在所述提取液A中的體積百分比濃度為0.2% ;所述水飽和酚、所述乙醇和所述吡咯烷酮的體積比為98:1:1。
[0011]第二方面，本發(fā)明涉及一種上述新型細(xì)菌RNA提取試劑的制備方法，包括如下步驟:
[0012]步驟一，將所述Tris、EDTA、SDS、Tween 80、Triton X-100、甘氨酸、十二烷基肌氨酸鈉、β -巰基乙醇和水進(jìn)行混合，得到提取液A ;將所述水飽和酚、乙醇和吡咯烷酮進(jìn)行混合，得到提取液B ；
[0013]步驟二，配置所述結(jié)合液和洗滌液；
[0014]步驟三，將所述提取液Α、提取液B、結(jié)合液和洗滌液組成試劑盒，即可。
[0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下:本發(fā)明提供的新型細(xì)菌RNA提取試劑在提取革蘭氏陽性菌總RNA時(shí)，最終獲得的基因組DNA和總RNA中，總RNA的量占到74.6 %，與現(xiàn)有技術(shù)CN102796727A中的約50%相比，本發(fā)明獲得的總RNA的含量明顯提高，提高了總RNA的提取效率，有利于廣泛應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0017]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0018]本發(fā)明提供的新型細(xì)菌RNA提取試劑，由細(xì)菌細(xì)胞壁破除試劑、結(jié)合液和洗滌液組成；細(xì)菌細(xì)胞壁破除試劑由提取液A和提取液B組成；提取液A由Tris、EDTA, SDS、Tween80,Triton X-100、甘氨酸、十二烷基肌氨酸鈉、β -巰基乙醇和水混合組成；提取液B由水飽和酚、乙醇和吡咯烷酮混合組成；結(jié)合液為4.6Μ的異硫氰酸胍水溶液；洗滌液為體積百分含量70%的乙醇水溶液，甘氨酸在提取液A中的濃度為95mmol/L，Tris在提取液A中的濃度為 10mmol/L ;EDTA 在提取液 A 中的濃度 10mmol/L ；SDS,Tween 80,Triton X-100、十二烷基肌氨酸鈉在提取液A中的質(zhì)量體積百分比濃度均為0.1 %; β -巰基乙醇在提取液A中的體積百分比濃度為0.2% ;水飽和酚、乙醇和吡咯烷酮的體積比為98: I: I ;提取液A的pH值具體為7.5 ;提取液B的pH值具體為7.5。
[0019]分枝桿菌是一類典型的革蘭氏陽性菌，其中包含多種高危害的致病菌，例如結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌等，該類細(xì)菌的核酸提取在病原體分子診斷中具有重要意義。選取危險(xiǎn)度較低的恥垢分枝桿菌作為模型，驗(yàn)證本發(fā)明提供的RNA提取試劑在革蘭氏陽性菌恥垢分枝桿菌中的RNA提取效果。
[0020]菌株:恥垢分枝桿菌(^iTSMycobacterium smegmatis、菌株購自美國ATCC，菌株號19420);試劑:提取液A，提取液B，氯仿，無水乙醇，75%乙醇，RNase A (7000u/ml)，結(jié)合柱(購自MN公司，產(chǎn)品目錄號740903)，結(jié)合液(濃度為4.6M的異硫氰酸胍水溶液)，洗滌液(70% (體積百分含量)乙醇水溶液)，pH5.2的3M醋酸鈉溶液，DEPC水，滅菌水，甲醛，溴酸藍(lán)，MOPs (出售公司 Amresco，產(chǎn)品目錄號 Amresco M215), TBE buffer (配方 0.09mol/LTris-硼酸 0.002mol/L EDTA)，培養(yǎng)基:LB 培養(yǎng)基。
[0021]1、提取核酸
[0022]I)恥垢分枝桿菌的培養(yǎng)與保存:
[0023]在超凈工作臺內(nèi)將恥垢分枝桿菌劃線接種于LB(Luria-Bertani Agar Medium)培養(yǎng)基平板以進(jìn)行復(fù)蘇，將平板在培養(yǎng)箱中倒置，37°C孵育過夜(12h)。待長出單菌落后，挑取單菌落接種于3ml LB液體培養(yǎng)基中，37°C孵育過夜，將菌液按ImL/管進(jìn)行分裝，-20°C凍存?zhèn)溆肙
[0024]2)去除革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁
[0025]A、裂解
[0026]取Iml的凍存菌液，融化后裝入1.5ml的離心管中，在室溫25°C條件下12000rpm
離心2分鐘，用移液槍將上清液吸走。
[0027]在5mg離心沉淀物(菌體濕重)中加入400ul的提取液A，用移液槍將沉淀物重懸，使微生物充分混合在提取液A中。然后再混合物中加入400ul的提取液B，在渦旋器上劇烈震蕩2分鐘，在震蕩過程中按緊離心管的蓋子，防止菌液混合物漏出。
[0028]劇烈震蕩結(jié)束后，將離心管放置于65°C的震蕩儀中，溫育I個(gè)小時(shí)，在此期間每間隔30秒劇烈震蕩5秒鐘。將裝有裂解液離心管在冰上進(jìn)行冰浴5分鐘((TC )，然后將離心管在4°C的條件下，12000rpm進(jìn)行離心5分鐘。離心結(jié)束后，離心管中溶液自然分層，小心將上層水相用移液槍吸出轉(zhuǎn)移至新的1.5ml的離心管中，盡量避免吸入中間的蛋白層和下層有機(jī)相溶劑。
[0029]B、氯仿抽提:
[0030]在吸出的裝有水相離心管中加入400ul的氯仿(所述上層水相與所述氯仿的體積比具體為1:1)，將其在渦旋震蕩儀上劇烈震蕩，使水相與氯仿充分混勻。將裝有混合物的離心管在在4°C的條件下，12000r