一種癌細胞或細菌的捕獲方法及其試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種癌細胞或細菌的捕獲方法及其試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，癌細胞和病原細菌是兩類非常重要的生物靶標(biāo)。對二者的高靈 敏度分析檢測對于相關(guān)疾?。ò┌Y和病原細菌引起的感染疾?。┑脑缙谠\斷來說，具有極 為重要的意義。然而，大多數(shù)情況下待測樣品中癌細胞及病原細菌的濃度比較低（痕量級 別），實現(xiàn)對其的直接生化分析和基因分型鑒定具有較大難度。因此在癌細胞和病原細菌的 實際檢測過程中，需經(jīng)過一個"捕獲_釋放"的過程，首先對待測靶標(biāo)進行有效捕獲，實現(xiàn)對 其的分離富集，然后再將富集的靶標(biāo)釋放并對其進行最終的生化分析和基因分型鑒定。因 此，為實現(xiàn)對癌細胞和病原細菌的高靈敏度分析檢測，發(fā)展一種有效的生物捕獲及可控釋 放通用策略至關(guān)重要。
[0003]目前，針對癌細胞和病原細菌的捕獲及可控釋放技術(shù)主要有DNA適配體法、溫控 法和微流控法。DNA適配體法是基于DNA適配體對相應(yīng)靶標(biāo)高特異性的親和能力來實現(xiàn)癌 細胞和病原細菌的特異捕獲，并利用DNA酶裂解適配體來實現(xiàn)捕獲靶標(biāo)的可控釋放。溫控 法是基于熱敏型聚合物在不同溫度下其親疏水性質(zhì)的變化來實現(xiàn)癌細胞和病原細菌的溫 控捕獲和釋放。微流控法主要依據(jù)待測靶標(biāo)尺寸的大小來構(gòu)建相應(yīng)的微流控捕獲芯片，并 通過控制微流剪切力的方向和大小來實現(xiàn)癌細胞和病原細菌的可控釋放。
[0004] 但是，DNA適配體法、溫控法和微流控法都存在著各自的缺點。DNA適配體法無 法實現(xiàn)可逆的靶標(biāo)捕獲和可控釋放，只能滿足單次癌細胞和病原細菌特異捕獲和釋放的要 求。溫控法涉及復(fù)雜的溫敏聚合物合成步驟，其中使用的有機分子對生物靶標(biāo)的活性有一 定影響，從而降低了最終癌細胞和病原細菌的檢測準(zhǔn)確性和靈敏度。微流控法需根據(jù)不同 靶標(biāo)尺寸的大小精確控制微流控捕獲芯片的結(jié)構(gòu)，制備過程復(fù)雜，而且基于微流剪切力的 靶標(biāo)釋放過程會降低癌細胞和病原細菌的活性。
[0005] 因此，進一步建立一種針對癌細胞和病原細菌的生物捕獲及可控釋放通用策略十 分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種癌細胞或細菌的捕獲方法及其 試劑盒。該方法特異性強、靈敏度高，能夠簡便、快速、可逆地實現(xiàn)癌細胞或細菌的捕獲及釋 放，且對癌細胞或細菌的生物活性影響較小。
[0007] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明提供了一種癌細胞或細菌的捕獲方法，該方法將NTA功能化載體與含有靶 標(biāo)結(jié)合蛋白和Ni2+的樣品共同孵育；靶標(biāo)結(jié)合蛋白中包括組氨酸標(biāo)簽和能夠與癌細胞或細 菌特異性結(jié)合的蛋白或抗體。
[0009] NTA為次氮基三乙酸，組氨酸標(biāo)簽（His-tag)為多個成串組氨酸的肽段。研究表 明，NTA在Ni2+存在條件下會與含有組氨酸（His)的分子通過螯合作用非共價結(jié)合到一起， 且此非共價結(jié)合作用在有螯合劑（如乙二胺四乙酸?DTA))存在的情況下可被打破。本 發(fā)明利用該原理，構(gòu)建了NTA功能化載體，使其在Ni2+存在的條件下，與靶標(biāo)蛋白（攜帶有 His-tag的能夠與癌細胞或細菌特異性結(jié)合的蛋白或抗體）相結(jié)合，進而實現(xiàn)對癌細胞或 細菌的捕獲。由于靶標(biāo)結(jié)合蛋白與細胞或細菌的結(jié)合為特異性結(jié)合，所以所捕獲的癌細胞 或細菌皆可具有良好的純度。經(jīng)實驗證實，采用本發(fā)明提供的方法對癌細胞的捕獲率可達 95% ;對細菌的捕獲率可達96%。當(dāng)需要將癌細胞或細菌釋放時，以含有金屬離子螯合劑 的溶液作為釋放劑，便可實現(xiàn)癌細胞或細菌的釋放。實驗表明，使用本發(fā)明提供的方法在捕 獲后，對癌細胞的釋放率可達87 %，對細菌的釋放率可達85 %，且對癌細胞或細菌的生物 活性影響較小。
[0010] 在本發(fā)明的實施例中，因轉(zhuǎn)鐵蛋白（TRF)對癌細胞具有特異性結(jié)合的能力。而伴 刀豆蛋白（ConA)對細菌具有特異性結(jié)合能力。因而本發(fā)明選用了His-tag轉(zhuǎn)鐵蛋白作為 捕獲癌細胞的革巴標(biāo)結(jié)合蛋白，而選擇His-tag伴刀豆蛋白作為捕獲細菌的革巴標(biāo)結(jié)合蛋白。
[0011] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，His-tag-轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為30yg/mL。
[0012] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，His-tag-伴刀豆蛋白的濃度為30yg/mL。
[0013] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，His-tag中組氨酸的個數(shù)為6個。
[0014] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，采用His-tag轉(zhuǎn)鐵蛋白捕獲宮頸癌細胞；采用 His-tag-伴刀豆蛋白捕獲大腸桿菌。
[0015] 本發(fā)明對結(jié)合劑中的陰離子不做限定，在一些實施例中，Ni2+由硝酸鎳或硫酸鎳提 供。
[0016] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，Ni2+的濃度為100ymol/L~200ymol/L〇
[0017] 作為優(yōu)選，Ni2+的濃度為100ymol/Lo
[0018] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，捕獲過程中樣品與結(jié)合劑Ni2+共同孵育的溫度為 25°C~37°C，時間為 30min~120min。
[0019] 作為優(yōu)選，捕獲過程中樣品與結(jié)合劑Ni2+共同孵育的溫度為25°C，時間為60min。
[0020] 本發(fā)明提供的方法只需將癌細胞或細菌樣品與NTA功能化載體、靶標(biāo)結(jié)合蛋白及 Ni2+共同孵育，便可實現(xiàn)癌細胞或細菌的高效捕獲。另外，為更好滿足后續(xù)癌細胞或細菌生 化分析和基因分型鑒定的需要，將捕獲有癌細胞或細菌的NTA功能化載體與金屬離子螯合 劑共同孵育，還可輕松實現(xiàn)癌細胞或細菌的可控釋放。
[0021] 為了實現(xiàn)癌細胞或細菌的可控釋放，在本發(fā)明的實施例中，共同孵育后還包括釋 放步驟，具體為捕獲有癌細胞或細菌的NTA功能化載體與金屬離子螯合劑孵育。
[0022] 作為優(yōu)選，金屬離子螯合劑的濃度為100ymol/L~200ymol/Lo
[0023] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，金屬離子螯合劑為EDTA。
[0024] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，金屬螯合劑的濃度為100ymol/L
[0025] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，在癌細胞或細菌釋放過程中，NTA功能化載體與金 屬螯合劑孵育的溫度為25°C~37°C，時間為10min~30min。
[0026] 作為優(yōu)選，在癌細胞或細菌釋放過程中，NTA功能化載體與金屬螯合劑孵育的溫度 為25°C，時間為20min。
[0027]在本發(fā)明的實施例中，樣品為細胞懸液、血液或組織勻漿。
[0028] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，樣品中癌細胞濃度為102個/mL~10 6個/mL;
[0029] 作為優(yōu)選，樣品中細胞的密度為2X104個/mL。
[0030] 在本發(fā)明中，樣品為菌液、血液或組織勻漿。
[0031] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，樣品中細菌的濃度為103CFU/mL~107CFU/mL。
[0032] 作為優(yōu)選，菌液中細菌的密度為106CFU/mL。
[0033] 本發(fā)明中所述的NTA功能化載體可為自行制備也可參照本發(fā)明提供的方法制得。 經(jīng)修飾后的載體可單次使用，也可反復(fù)使用，或可在使用前重新制備。本發(fā)明對此不做限 定，其實施皆在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0034] 在本發(fā)明中，NTA功能化載體的制備方法包括：將羥基化的載體依次與3-氨丙基 三乙氧基硅烷、N，N' -琥珀酰亞胺基碳酸酯、N-(5-氨基-1-羧基戊基）亞胺基乙酰乙酸孵 育后制得NTA功能化載體。
[0035] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，載體為玻片或硅片。
[0036] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，載體羥基化的方法為等離子處理。
[0037] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，載體與3-氨丙基三乙氧基硅烷孵育的溶劑為乙 醇；其中3-氨丙基三乙氧基硅烷的體積分?jǐn)?shù)為4% ;孵育的溫度為25°C;孵育的時間為lh。
[0038] 作為優(yōu)選，載體與3-氨丙基三乙氧基硅烷孵育后以乙醇沖洗、干燥。
[0039] 在一些實施例中，載體與N，N' -琥珀酰亞胺基碳酸酯孵育的溶劑為乙腈；其中 N，N' -琥珀酰亞胺基碳酸酯的濃度為10mM;孵育的溫度為25°C;孵育的時間為lOmin。
[0040] 作為優(yōu)選，載體與N，N' -琥珀酰亞胺基碳酸酯孵育后分別用乙腈及水沖洗、干燥。
[0041] 在一些實施例中，載體與N-(5_氨基-1-羧