一種海參組織蛋白酶的原核表達方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領域，尤其涉及一種海參組織蛋白酶的原核表達方法。
【背景技術(shù)】
[0002]原膠蛋白是機體組織的結(jié)構(gòu)蛋白，其諸多生理功能已被系統(tǒng)研宄和廣泛認可。隨著膠原蛋白產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，膠原蛋白酶解工藝中的關鍵生產(chǎn)要素一蛋白酶的需求也不斷增長。目前較為常用的各類酶普遍存在膠原蛋白酶解效率不高的缺點，而運用基因工程技術(shù)開發(fā)新型膠原蛋白酶可以彌補這一致命缺陷，且采用生物工程技術(shù)生產(chǎn)的膠原蛋白酶產(chǎn)品品質(zhì)易控、生產(chǎn)成本低廉。刺參具有極強的自溶能力宄其本質(zhì)即是組織細胞內(nèi)蛋白酶對體壁組織蛋白(主要為膠原蛋白)的高效酶解作用。然而，有關刺參組織蛋白酶基因的篩選、功能研宄及相關蛋白酶產(chǎn)品開發(fā)卻尚未系統(tǒng)開展。本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種海參組織蛋白酶的原核表達方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)提供一種采用大腸桿菌低成本表達海參組織蛋白酶、表達產(chǎn)物品質(zhì)容易控制的一種海參組織蛋白酶的原核表達方法。
[0004]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:一種海參組織蛋白酶的原核表達方法，包括，其中:包括對海參組織蛋白酶基因序列克??；在獲得海參組織蛋白酶基因序列克隆的基礎上構(gòu)建具有海參組織蛋白酶基因序列的融合表達載體，然后將融合表達載體轉(zhuǎn)化到表達宿主菌進行誘導表達目標蛋白；海參組織蛋白酶基因序列含有SEQl序列。
[0005]為優(yōu)化上述技術(shù)方案，采取的措施還包括:表達宿主菌為大腸桿菌。海參組織蛋白酶基因序列克隆所使用的擴增目標蛋白DNA片段的引物為增加EcoRI和NotI識別位點的
引物 1:F:5，-CCGGAATTCATGCCAGACACTGTTGATT-3，；(SEQ3)
引物 2:R:5，-ATAGTTTAGCGGCCGCTTAGACAGTTGGGTAACTG-3，。(SEQ4)
構(gòu)建融合表達載體所使用的限制性內(nèi)切酶為EcoRI和Notl，雙酶切所獲得的DNA序列片段長度約660bp，通過DNA連接酶作用，連接至pET32a，完成表達載體構(gòu)建。宿主菌的誘導表達步驟如下:將構(gòu)建完成的融合表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，利用IPTG進行誘導表達目標蛋白。融合表達載體選自pET32a載體。pET32a載體的構(gòu)建步驟如下:以添加限制性內(nèi)切酶識別位點序列的引物，克隆制備海參組織蛋白酶成熟肽區(qū)域基因序列。使用內(nèi)切酶，對PCR產(chǎn)物以及空載pET32a載體分別進行雙酶切，通過電泳及膠回收純化酶切產(chǎn)物?；旌辖?jīng)過雙酶切處理的組織蛋白酶基因片段及載體片段，使用DNA快速連接酶連接構(gòu)建表達載體。IPTG誘導表達組織蛋白酶的溫度低于30°C，IPTG濃度小于3mM，誘導表達的組織蛋白酶以非包涵體形式表達于大腸桿菌胞內(nèi)。
[0006]本方法步驟如下:
I)預測蛋白結(jié)構(gòu)分析查找確定刺參組織蛋白酶基因全長序列的開放閱讀框，確定編碼序列并推測編碼蛋白的氨基酸序列，采用生物信息學的方法進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能域分析并確定基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)特征，明確結(jié)構(gòu)域位置和所需表達的蛋白序列。
[0007]2) pET32a融合表達載體構(gòu)建
以添加限制性內(nèi)切酶識別位點序列的引物，克隆制備海參組織蛋白酶成熟肽區(qū)域基因序列。使用內(nèi)切酶，對PCR產(chǎn)物以及空載pET32a載體分別進行雙酶切，通過電泳及膠回收純化酶切產(chǎn)物?；旌辖?jīng)過雙酶切處理的組織蛋白酶基因片段及載體片段，使用DNA快速連接酶連接構(gòu)建表達載體。
[0008]3)大腸桿菌原核表達
將構(gòu)建完成的融合表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達宿主菌一BL21 (DE3)大腸桿菌，利用IPTG進行誘導表達目標蛋白。通過誘導表達溫度及時間雙因素分析，優(yōu)化組織蛋白酶原核表達的培養(yǎng)條件及誘導效果。
[0009]所述步驟I)中，使用NCBI網(wǎng)站BLASTX軟件進行基因保守域分析(http://blast,ncb1.nlm.nih.gov/)，使用ClustalW2對預測氨基酸序列進行特征分析(http://www.eb1.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)，利用signalP4.1在線軟件，分析序列蛋白信號肽區(qū)域特征(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，利用 PR0SITE 在線軟件分析活性功能位點及結(jié)構(gòu)域(http://prosite.expasy.0rg/scanprosite/)，采用 F1DBSUM 數(shù)據(jù)庫預測分析蛋白二級結(jié)構(gòu)、二硫鍵、配體結(jié)合位點等結(jié)構(gòu)信息，PROCAT數(shù)據(jù)庫預測分析活性位點三維結(jié)構(gòu)，NRL-3D數(shù)據(jù)庫相似蛋白結(jié)構(gòu)分析。通過軟件分析，明確具有蛋白酶解功能的目標序列，確定擴增序列所使用的引物序列。
[0010]所述步驟I)中，所使用的擴增目標蛋白DNA片段的引物為增加EcoRI和NotI識別位點的
引物 1:F:5’ -CCGGAATTCATGCCAGACACTGTTGATT-3’ ；
引物 2:R: 5’ -ATAGTTTAGCGGCCGCTTAGACAGTTGGGTAACTG-3’。
[0011]所述步驟2)中，所使用的限制性內(nèi)切酶為EcoRI和Notl，雙酶切所獲得的DNA序列片段長度約660bp，通過DNA連接酶作用，連接至pET32a，完成表達載體構(gòu)建。
[0012]所述步驟3)中，IPTG誘導表達組織蛋白酶的溫度低于30°C，所用IPTG濃度小于3mM，誘導表達的組織蛋白酶以非包涵體形式表達于大腸桿菌胞內(nèi)。
[0013]由于本發(fā)明采用了包括對海參組織蛋白酶基因序列克?。辉讷@得海參組織蛋白酶基因序列克隆的基礎上構(gòu)建具有海參組織蛋白酶基因序列的融合表達載體，然后將融合表達載體轉(zhuǎn)化到表達宿主菌進行誘導表達目標蛋白；海參組織蛋白酶基因序列含有SEQl序列。因而本發(fā)明具有采用大腸桿菌低成本表達海參組織蛋白酶、表達產(chǎn)物品質(zhì)容易控制的優(yōu)點。
【具體實施方式】
[0014]以下結(jié)合附實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。
[0015]實施例:一種海參組織蛋白酶的原核表達方法，包括，其中:包括對海參組織蛋白酶基因序列克隆；在獲得海參組織蛋白酶基因序列克隆的基礎上構(gòu)建具有海參組織蛋白酶基因序列的融合表達載體，然后將融合表達載體轉(zhuǎn)化到表達宿主菌進行誘導表達目標蛋白；海參組織蛋白酶基因序列含有SEQl序列。表達宿主囷為大腸桿囷。海參組織蛋白酶基因序列克隆所使用的擴增目標蛋白DNA片段的引物為增加EcoRI和NotI識別位點的引物 1:F:5，-CCGGAATTCATGCCAGACACTGTTGATT-3，；(SEQ3)
引物 2:R:5，-ATAGTTTAGCGGCCGCTTAGACAGTTGGGTAACTG-3，。(SEQ4)
構(gòu)建融合表達載體所使用的限制性內(nèi)切酶為EcoRI和Notl，雙酶切所獲得的DNA序列片段長度約660bp，通過DNA連接酶作用，連接至pET32a，完成表達載體構(gòu)建。宿主菌的誘導表達步驟如下:將構(gòu)建完成的融合表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，利用IPTG進行誘導表達目標蛋白。融合表達載體選自pET32a載體。pET32a載體的構(gòu)建步驟如下:以添加限制性內(nèi)切酶識別位點序列的引物，克隆制備海參組織蛋白酶成熟肽區(qū)域基因序列。使用內(nèi)切酶，對PCR產(chǎn)物以及空載pET32a載體分別進行雙酶切，通過電泳及膠回收純化酶切產(chǎn)物?；旌辖?jīng)過雙酶切處理的組織蛋白酶基因片段及載體片段，使用DNA快速連接酶連接構(gòu)建表達載體。IPTG誘導表達組織蛋白酶的溫度低于30°C，IPTG濃度小于3mM，誘導表達的組織蛋白酶以非包涵體形式表達于大腸桿菌胞內(nèi)。
[0016]本發(fā)明采用的刺參的拉丁命名為japonicus。
[0017]海參組織蛋白酶基因序列為SEQl:CCAGACACTGTTGATTGGAGACCAAAGGGTTACGTCACTGGGGTCAAAGATCAGAAACAATGCGGATCCTGCTGGGCATTCAGCACCACTGGGTCACTTGAAGGTCAGATGTTCAACAAGACTGGTATGCTGGTCAGCTTGAGCGAACAGAATCTCGTCGACTGCTCTCGTAAGGAGGGTAACATGGGTTGCCAAGGGGGGCTTATGGACGACGCCTTTCAATATGTCATTGATAACGGAGGTCTTGACACCGAGGATTGTTACCCGTACAAAGCCGTGCAAGGAACTTGCATGTACAAGTCGAGCTGCA