一種海參組織蛋白酶的原核表達方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物技術領域，尤其涉及一種海參組織蛋白酶的原核表達方法。
【背景技術】
[0002]原膠蛋白是機體組織的結構蛋白，其諸多生理功能已被系統(tǒng)研究和廣泛認可。隨著膠原蛋白產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，膠原蛋白酶解工藝中的關鍵生產(chǎn)要素一蛋白酶的需求也不斷增長。目前較為常用的各類酶普遍存在膠原蛋白酶解效率不高的缺點，而運用基因工程技術開發(fā)新型膠原蛋白酶可以彌補這一致命缺陷，且采用生物工程技術生產(chǎn)的膠原蛋白酶產(chǎn)品品質(zhì)易控、生產(chǎn)成本低廉。刺參具有極強的自溶能力究其本質(zhì)即是組織細胞內(nèi)蛋白酶對體壁組織蛋白(主要為膠原蛋白)的高效酶解作用。然而，有關刺參組織蛋白酶基因的篩選、功能研究及相關蛋白酶產(chǎn)品開發(fā)卻尚未系統(tǒng)開展。本發(fā)明針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種海參組織蛋白酶的原核表達方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術提供一種采用大腸桿菌低成本表達海參組織蛋白酶、表達產(chǎn)物品質(zhì)容易控制的一種海參組織蛋白酶的原核表達方法。
[0004]本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案為:一種海參組織蛋白酶的原核表達方法，包括，其中:包括對海參組織蛋白酶基因序列克隆；在獲得海參組織蛋白酶基因序列克隆的基礎上構建具有海參組織蛋白酶基因序列的融合表達載體，然后將融合表達載體轉(zhuǎn)化到表達宿主菌進行誘導表達目標蛋白；海參組織蛋白酶基因序列含有SEQl序列。
[0005]為優(yōu)化上述技術方案，采取的措施還包括:表達宿主菌為大腸桿菌。海參組織蛋白酶基因序列克隆所使用的擴增目標蛋白DNA片段的引物為增加EcoRI和NotI識別位點的
引物 1:F:5，-CCGGAATTCATGCCAGACACTGTTGATT-3’ ；(SEQ3)
引物 2:R:5，-ATAGTTTAGCGGCCGCTTAGACAGTTGGGTAACTG-3，。(SEQ4)
構建融合表達載體所使用的限制性內(nèi)切酶為EcoRI和Notl，雙酶切所獲得的DNA序列片段長度約660bp，通過DNA連接酶作用，連接至pET32a，完成表達載體構建。宿主菌的誘導表達步驟如下:將構建完成的融合表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，利用IPTG進行誘導表達目標蛋白。融合表達載體選自pET32a載體。pET32a載體的構建步驟如下:以添加限制性內(nèi)切酶識別位點序列的引物，克隆制備海參組織蛋白酶成熟肽區(qū)域基因序列。使用內(nèi)切酶，對PCR產(chǎn)物以及空載pET32a載體分別進行雙酶切，通過電泳及膠回收純化酶切產(chǎn)物?；旌辖?jīng)過雙酶切處理的組織蛋白酶基因片段及載體片段，使用DNA快速連接酶連接構建表達載體。IPTG誘導表達組織蛋白酶的溫度低于30°C，IPTG濃度小于3mM，誘導表達的組織蛋白酶以非包涵體形式表達于大腸桿菌胞內(nèi)。
[0006]本方法步驟如下:
I)預測蛋白結構分析
查找確定刺參組織蛋白酶基因全長序列的開放閱讀框，確定編碼序列并推測編碼蛋白的氨基酸序列，采用生物信息學的方法進行蛋白質(zhì)結構功能域分析并確定基因編碼蛋白結構特征，明確結構域位置和所需表達的蛋白序列。
[0007]2) pET32a融合表達載體構建
以添加限制性內(nèi)切酶識別位點序列的引物，克隆制備海參組織蛋白酶成熟肽區(qū)域基因序列。使用內(nèi)切酶，對PCR產(chǎn)物以及空載pET32a載體分別進行雙酶切，通過電泳及膠回收純化酶切產(chǎn)物?；旌辖?jīng)過雙酶切處理的組織蛋白酶基因片段及載體片段，使用DNA快速連接酶連接構建表達載體。
[0008]3)大腸桿菌原核表達
將構建完成的融合表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達宿主菌一BL21 (DE3)大腸桿菌，利用IPTG進行誘導表達目標蛋白。通過誘導表達溫度及時間雙因素分析，優(yōu)化組織蛋白酶原核表達的培養(yǎng)條件及誘導效果。
[0009]所述步驟I)中，使用NCBI網(wǎng)站BLASTX軟件進行基因保守域分析(http://blast,ncb1.nlm.nih.gov/)，使用ClustalW2對預測氨基酸序列進行特征分析(http://www.eb1.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)，利用signalP4.1在線軟件，分析序列蛋白信號肽區(qū)域特征(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，利用 PR0SITE 在線軟件分析活性功能位點及結構域(http://prosite.expasy.0rg/scanprosite/)，采用 F1DBSUM 數(shù)據(jù)庫預測分析蛋白二級結構、二硫鍵、配體結合位點等結構信息，PROCAT數(shù)據(jù)庫預測分析活性位點三維結構，NRL-3D數(shù)據(jù)庫相似蛋白結構分析。通過軟件分析，明確具有蛋白酶解功能的目標序列，確定擴增序列所使用的引物序列。
[0010]所述步驟I)中，所使用的擴增目標蛋白DNA片段的引物為增加EcoRI和NotI識別位點的
引物 1:F:5’ -CCGGAATTCATGCCAGACACTGTTGATT-3’ ；
引物 2:R: 5’ -ATAGTTTAGCGGCCGCTTAGACAGTTGGGTAACTG-3’。
[0011]所述步驟2)中，所使用的限制性內(nèi)切酶為EcoRI和Notl，雙酶切所獲得的DNA序列片段長度約660bp，通過DNA連接酶作用，連接至pET32a，完成表達載體構建。
[0012]所述步驟3)中，IPTG誘導表達組織蛋白酶的溫度低于30°C，所用IPTG濃度小于3mM，誘導表達的組織蛋白酶以非包涵體形式表達于大腸桿菌胞內(nèi)。
[0013]由于本發(fā)明采用了包括對海參組織蛋白酶基因序列克隆；在獲得海參組織蛋白酶基因序列克隆的基礎上構建具有海參組織蛋白酶基因序列的融合表達載體，然后將融合表達載體轉(zhuǎn)化到表達宿主菌進行誘導表達目標蛋白；海參組織蛋白酶基因序列含有SEQl序列。因而本發(fā)明具有采用大腸桿菌低成本表達海參組織蛋白酶、表達產(chǎn)物品質(zhì)容易控制的優(yōu)點。
【具體實施方式】
[0014]以下結合附實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。
[0015]實施例:一種海參組織蛋白酶的原核表達方法，包括，其中:包括對海參組織蛋白酶基因序列克隆；在獲得海參組織蛋白酶基因序列克隆的基礎上構建具有海參組織蛋白酶基因序列的融合表達載體，然后將融合表達載體轉(zhuǎn)化到表達宿主菌進行誘導表達目標蛋白；海參組織蛋白酶基因序列含有SEQl序列。表達宿主菌為大腸桿菌。海參組織蛋白酶基因序列克隆所使用的擴增目標蛋白DNA片段的引物為增加EcoRI和NotI識別位點的引物 1:F:5，-CCGGAATTCATGCCAGACACTGTTGATT-3’ ；(SEQ3)
引物 2:R:5，-ATAGTTTAGCGGCCGCTTAGACAGTTGGGTAACTG-3，。(SEQ4)
構建融合表達載體所使用的限制性內(nèi)切酶為EcoRI和Notl，雙酶切所獲得的DNA序列片段長度約660bp，通過DNA連接酶作用，連接至pET32a，完成表達載體構建。宿主菌的誘導表達步驟如下:將構建完成的融合表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，利用IPTG進行誘導表達目標蛋白。融合表達載體選自pET32a載體。pET32a載體的構建步驟如下:以添加限制性內(nèi)切酶識別位點序列的引物，克隆制備海參組織蛋白酶成熟肽區(qū)域基因序列。使用內(nèi)切酶，對PCR產(chǎn)物以及空載pET32a載體分別進行雙酶切，通過電泳及膠回收純化酶切產(chǎn)物?；旌辖?jīng)過雙酶切處理的組織蛋白酶基因片段及載體片段，使用DNA快速連接酶連接構建表達載體。IPTG誘導表達組織蛋白酶的溫度低于30°C，IPTG濃度小于3mM，誘導表達的組織蛋白酶以非包涵體形式表達于大腸桿菌胞內(nèi)。
[0016]本發(fā)明采用的刺參的拉丁命名為Apostichopus japonicus。
[0017]海參組織蛋白酶基因序列為SEQl:CCAGACACTGTTGATTGGAGACCAAAGGGTTACGTCACTGGGGTCAAAGATCAGAAACAATGCGGATCCTGCTGGGCATTCAGCACCACTGGGTCACTTGAAGGTCAGATGTTCAACAAGACTGGTATGCTGGTCAGCTTGAGCGAACAGAATCTCGTCGACTGCTCTCGTAAGGAGGGTAACATGGGTTGCCAAGGGGGGCTTATGGACGACGCCTTTCAATATGTCATTGATAACGGAGGTCTTGACACCGAGGATTGTTACCCGTACAA