大菱鲆SmLTL重組蛋白及其制備與應(yīng)用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域，具體地涉及一種大菱鲆SmLTL重組蛋白 及其制備與應(yīng)用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 魚(yú)類(lèi)皮膚分泌的大量粘液廣泛覆蓋在魚(yú)體表面構(gòu)成與外界接觸的第一道門(mén)戶(hù)，在 保護(hù)魚(yú)體抵抗養(yǎng)殖環(huán)境變化以及抵御外界病原生物侵襲起著至關(guān)重要的作用。魚(yú)類(lèi)體表分 泌物中存在多種生物活性因子，其中粘液凝集素（lectin)做為魚(yú)類(lèi)體表粘液中的重要天然 免疫因子，逐漸被國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。
[0003]本發(fā)明做出之前，Lily-type lectin作為粘液凝集素中主要類(lèi)型之一，最早是從 紅鰭東方飩(Takifugu rubripes)體表粘液中提取出的（pufflectin),是一種比較特殊的 凝集素，其氨基酸序列與單子葉甘露糖凝集素(MMB)具有高度同源性;據(jù)報(bào)道，MMB是一種重 要的植物保護(hù)因子，其轉(zhuǎn)基因植株可以抵抗吸吮性害蟲(chóng)及線(xiàn)蟲(chóng)等的侵襲；目前對(duì)于Lily-type Iect in 研究 僅局限 于河豚 T. rubr ipes ， 線(xiàn)體 C. striata 以及半滑舌觸 C. semi laevi s ， 然而，對(duì)于Lily-type Iectin在寄生蟲(chóng)抑制等應(yīng)用方面研究鮮有報(bào)道，其抗蟲(chóng)性的免疫效 應(yīng)尚不清楚。綜上所述，大菱鮮Lily-type Iectin(SmLTL)重組蛋白制備及其對(duì)盾纖毛蟲(chóng)活 力抑制研究，國(guó)內(nèi)外尚未有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種大菱鲆SmLTL重組蛋白的制備方法及該蛋 白對(duì)盾纖毛蟲(chóng)活力抑制性應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明是按照以下操作技術(shù)方案完成的：
[0006] 一種大菱鲆SmLTL的重組蛋白，它是由118個(gè)氨基酸組成，分子量為13.47KDa，等電 點(diǎn)為8.52,其氨基酸序列如下：
[0008] 所述大菱鲆SmLTL的重組蛋白的制備方法，具體步驟如下：
[0009] (1)對(duì)大菱鮮SmLTL(Genbank accession no.KU199003)進(jìn)行基因序列的設(shè)計(jì)和優(yōu) 化，并人工合成核酸片段；
[0010] (2)通過(guò)Ndel/Hindlll限制性酶切位點(diǎn)將步驟（1)中合成的核酸片段亞克隆到表 達(dá)載體PET43. Ia上，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-SmLTL;
[0011] (3)重組表達(dá)質(zhì)粒pET-SmLTL熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21 (DE3);
[0012] (4)加入IPTG，15°C表達(dá)過(guò)夜，并放大培養(yǎng)；
[0013] (5)超聲破菌，裂解物上樣于鎳親和柱，純化目的蛋白，并透析；
[0014] (6)Western_blot方法檢測(cè)重組表達(dá)蛋白。
[0015] 進(jìn)一步，所述的步驟(1)人工合成的核酸片段為
[0018] 進(jìn)一步，所述的放大培養(yǎng)：將菌種接種到含氨芐青霉素 LB培養(yǎng)基中，于37°0 200rpm搖床中生長(zhǎng)過(guò)夜；第二天接種到含100ug/mL氨芐青霉素的3L TB培養(yǎng)基中，放入37 °C*200rpm搖床中生長(zhǎng)至OD = 0.6-0.8時(shí)，將搖床溫度降至15°C，Ih后加入終濃度0.5mM IPTG誘導(dǎo)生長(zhǎng)過(guò)夜;8000rpm*15min*4°C離心收集濕菌，并用磷酸緩沖鹽重懸一次以清洗菌 體。
[0019] 進(jìn)一步，所述的超聲裂解時(shí)用500W功率的超聲波，在冰浴中進(jìn)行超聲，每超聲3s， 間歇8s，總計(jì)20min。
[0020] 本發(fā)明還提供一種用于抑制盾纖毛蟲(chóng)的組合物，包含上述大菱鲆SmLTL重組蛋白。
[0021] 本發(fā)明還提供大菱鲆SmLTL重組蛋白在抑制盾纖毛蟲(chóng)藥物中的應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果：
[0023] 第一，通過(guò)密碼子優(yōu)化的方法，克服了大腸桿菌的密碼子偏愛(ài)的缺點(diǎn)，使得蛋白獲 得高表達(dá)；
[0024] 第二，本發(fā)明通過(guò)重組制備了大菱鲆SmLTL重組蛋白，且大菱鲆SmLTL重組蛋白能 夠抑制纖毛蟲(chóng)活力，并與蟲(chóng)體具有結(jié)合現(xiàn)象，為大菱鲆抗纖毛蟲(chóng)藥物的研發(fā)發(fā)揮積極、重要 的推動(dòng)作用。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1為大菱鲆SmLTL重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果；其中1^1^1:303-PAGE Protein marker;Lane 0:對(duì)照；Lane 1:15°C誘導(dǎo)過(guò)夜；Lane 2:37°C誘導(dǎo)4h。
[0026] 圖2為SmLTL重組蛋白純化產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果；其中Lane M:SDS-PAGE Protein marker;Lane 1:全菌破菌離心后上清；Lane 2:上清同Ni-IDA孵育后流出液；Lane 3-6: 50mM咪唑的Buffer A洗脫液;Lane 7-10: IOOmM咪唑的Buffer A洗脫液；Lane 11-22:300mM 咪唑的Buffer A洗脫液。
[0027] 圖3為SmLTL重組蛋白的Western-blot分析結(jié)果；LaneM2:Western Blot Marker; Lane 1:重組蛋白特異條帶。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面通過(guò)實(shí)施例和附圖來(lái)對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步解釋?zhuān)景l(fā)明的保護(hù)范 圍不受實(shí)施例任何形式上的限制。
[0029]實(shí)施例1、大菱鲆SmLTL的核酸序列優(yōu)化 [0030] 1.大菱鲆SmLTL的核酸序列優(yōu)化與合成
[0031 ]采用德泰生物科技（南京）有限公司最新開(kāi)發(fā)的密碼子優(yōu)化軟件（MaxCodonTM Optimization Program(V13))，進(jìn)行SmLTL(Genbank access ion no.KU199003)基因序列 的設(shè)計(jì)和優(yōu)化，優(yōu)化的核酸序列為：
[0034] 2 ·亞克隆至表達(dá)載體pET43 · Ia上，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-SmLTL
[0035] 通過(guò)Ndel/Hindlll限制性酶切位點(diǎn)將步驟1優(yōu)化后的核酸序列亞克隆到表達(dá)載體 PET43 · Ia上，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-SmLTL;
[0036] 實(shí)施例二、SmLTL蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)中的表達(dá)與純化 [0037] I. SmLTL蛋白表達(dá)與鑒定
[0038] (1)表達(dá)載體的純化：
[0039] 從-80°C冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)，并將其迅速置于冰水中，在冰上融化 2-5分鐘;將約IOOng的表達(dá)載體質(zhì)粒pET-SmLTL DNA直接加入感受態(tài)細(xì)胞中，輕微搖動(dòng)混和 隨后置于冰水浴上30min;將離心管放置42°C水浴，熱激90s;快速將離心管轉(zhuǎn)移至冰水浴中 3min;拿出后取200ul的LB液體培養(yǎng)基加入到已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞中；放入搖床（37°0 195rpm)中生長(zhǎng)Ih;吸取50ul-80ul懸液均勻涂布含有100ug/mL氨芐青霉素(Amp)LB平板中； 將平板放于工作臺(tái)上數(shù)分鐘以使涂布的液體被吸收，倒置、37°C培養(yǎng)過(guò)夜。
[0040] (2)菌株的誘導(dǎo)表達(dá)：
[00411從轉(zhuǎn)化平板中接種單克隆，加入3支4ml含100ug/mL Amp的LB培養(yǎng)基中，編號(hào)為標(biāo) 記為"0""1""2"；37°0200印111培養(yǎng)至00600為0.5-0.8(通常需要2 - 3小時(shí)）；生長(zhǎng)過(guò)程中無(wú) 菌條件下取出樣品測(cè)定0D600值；向試管培養(yǎng)液中加入終濃度0.5mM IPTG( "0"對(duì)照組不加 IPTG)，通常"0" "Γ放置15°C誘導(dǎo)過(guò)夜，"2"放置37°C誘導(dǎo)4h。
[0042] (3) SDS-PAGE鑒定誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果：
[0043] 分別取"0" "Γ "2"試管中各400-600uL培養(yǎng)液12000rpm*10min*4°C離心，去除上清 液，加入500ul dd H2O重懸菌體，并再次12000rpm*10min*4°C離心，去除上清液；加入50μ1 的磷酸緩沖鹽(PBS)混合以重懸沉淀;加入50μ1的2 X SDS上樣緩沖液迅速在100