一種雙抗原重組蛋白及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供一種雙抗原重組蛋白及其制備方法和應(yīng)用，具體提供了一種EHEC O157:H7 espA?Tir?M雙抗原片段的融合基因，其序列如SEQ ID No.1所示，同時還提供了由此編碼的重組蛋白及其亞單位疫苗將制備雙抗原重組蛋白通過皮下注射、滴鼻方式免疫小鼠，并進(jìn)行EHEC O157:H7攻毒實驗，證明該雙抗原重組蛋白具有良好的免疫原性和免疫保護(hù)效果，可用于預(yù)防EHEC O157:H7感染的候選疫苗。
【專利說明】
一種雙抗原重組蛋白及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ] 本方法屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種EHEC 0157:H7espA-Tir-M雙抗原重 組蛋白。
【背景技術(shù)】
[0002] 腸出血型大腸埃希菌（enterohaemorrhagic E.coli，EHEC)0157:H7感染性腹瀉是 一種危害嚴(yán)重的腸道傳染病，臨床主要表現(xiàn)為出血性腸炎(haemorrhagic colitis，HC)、嚴(yán) 重者可引起溶血性尿毒綜合癥(hemolytic uremic syndrome，HUS)、血栓性血小板減少性 紫療（thrombotic thromobocytopenie porpura，TTP)等并發(fā)癥，甚至可導(dǎo)致死亡。EHEC 0157: H7可通過多種途徑傳播，其中以食源性傳播為主，水源性傳播和接觸傳播也是重要的 傳播途徑。我國的大部分地區(qū)已陸續(xù)在市售食品和進(jìn)口食品、家畜家禽和腹瀉病患者中檢 出EHEC 0157:H7,有些地區(qū)還發(fā)生了較大規(guī)模的暴發(fā)流行，EHEC 0157:H7感染因具有暴發(fā) 流行趨勢、強(qiáng)烈的致病性與致死性以及抗生素治療可能會加劇病情等特點，目前已經(jīng)成為 世界范圍內(nèi)重要的公共衛(wèi)生問題，有效的疫苗研制是預(yù)防和控制EHEC 0157:H7感染最經(jīng) 濟(jì)、有效的方法，但是目前尚未有可用于人體的疫苗。
[0003] EHEC 0157:H7的致病性主要體現(xiàn)在細(xì)菌的黏附定植力和毒素兩個方面，黏附是腸 出血性大腸埃希菌感染的第一步，Tir和espA在細(xì)菌黏附和形成特征性的黏附和抹平損傷 (attaching and effacing lesion，A/E lesion)，即A/E損傷的效應(yīng)分子傳遞中起到重要 的橋梁作用。因此我們選擇EHEC 0157:H7Tir和espA兩個關(guān)鍵性定植功能蛋白作為研制預(yù) 防其感染的疫苗候選抗原，結(jié)合生物信息學(xué)B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位預(yù)測其作為抗原的潛 力，構(gòu)建EHEC 0157:H7espA-Tir-M雙抗原重組蛋白作為預(yù)防EHEC 0157:H7感染的候選疫 苗。基因工程亞單位疫苗是只含有病原體的一種或幾種只產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答所必需的免 疫原成分，而不含有感染性成分和病原體的其他遺傳信息，無須滅活，也無致病性，減少或 消除了常規(guī)活疫苗或滅活疫苗難以避免有害的反應(yīng)原，是最具安全性和穩(wěn)定性的一種基因 工程疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是構(gòu)建一種EHEC 0157:H7espA-Tir-M雙抗原重組蛋白， 該重組蛋白可用于預(yù)防EHEC 0157:H7感染的候選疫苗。
[0005] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：
[0006] 1.EHEC 0157:H7espA-Tir-M雙抗原片段，其特征在于:espA和Tir-M通過生物信息 學(xué)表位預(yù)測，采用ABCPred和BepPred在線軟件B細(xì)胞表位的預(yù)測，ProPred和NetMHCIIPan在 線軟件進(jìn)行Th細(xì)胞表位預(yù)測，ProPred選擇49種系統(tǒng)中的HLA-DRB1等位基因，NetMHCIIpan 選擇中國人群分布頻率較高的7種等位基因：HLA-DRB1*0901(14.4%)、HLA-DRB1*1202 (13.3%)、HLA-DRB1*1501(10.8%)、HLA-DRB1*1101(7.0%)、HLA-DRB1*0803(5.9%)、HLA-DRB1*0701(5.7%)^HLA-DRB1*1602(5.3%)〇
[0007] 2. -種制備如權(quán)利要求1所述的EHEC 0157: H7espA-Tir-M雙抗原片段，該方法包 括以下步驟：
[0008] (1)通過重疊延伸PCR法制備espA-Tir-M雙鏈融合基因，其序列為SEQ ID No.l;
[0009] (2)將步驟（1)得到espA-Tir-M雙鏈融合基因和質(zhì)粒pet_28a( + )分別用EcoR I和 Hind III進(jìn)行雙酶切后，用T4連接酶連接，得到連接產(chǎn)物；
[0010] (3)將步驟(2)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)中，鑒定含有Pet-28a( + )-espA-Tir-M 重組質(zhì)粒的重組DH5a菌株，得到重組質(zhì)粒；
[0011] (4)將步驟(3)重組質(zhì)粒導(dǎo)入BL21(DE3)感受態(tài)，得到重組菌株BL21-pet-28a( + )-espA-Tir-M;
[0012] (5)誘導(dǎo)步驟(4)重組菌株BL21-pet-28a( + )-espA-Tir-M表達(dá)和純化重組融合蛋 白 espA-Tir_M(et);
[0013] (6)將步驟(5)制備的重組蛋白et進(jìn)行WB鑒定，得到重組蛋白et。
[0014] 本發(fā)明一個方面提供了一種EHEC 0157:H7espA-Tir-M雙抗原片段的融合基因，其 序列如SEQ ID No.l所示。
[0015] 本發(fā)明另一個方面提供了一種重組蛋白，其由前述的融合基因編碼。
[0016] 本發(fā)明另一個方面提供了一種用于前述的融合基因的引物組合物，其由四條引物 組成
[0017] espA-Pl:57-CGGAATTCATGGATACATCAAATGCA(SEQ ID No.2),
[0018] espA-P2:57-GCTACCTCCTCCACTTCCGCCTCCTTTACCAAGGGATATTGCTG(SEQ ID No.3)；
[0019] Tir-M上游引物引入linker，下游引物引入酶 GGAGGCGGAAGTGGAGGAGGTAGCAGCCCAACCACGACCGAC(SEQ ID No.4),
[0020] Tir M-P2:57-CCCAAGCTTGGCTTGCTGTTTGGCCTCTT(SEQ ID No.5)〇
[0021] 本發(fā)明另一個方面提供了如前述的重組蛋白的制備方法，該方法包括以下步驟：
[0022] (1)通過重疊延伸PCR法制備espA-Tir-M雙鏈融合基因，其序列為SEQ ID No.l;
[0023] (2)將步驟（1)得到espA-Tir-M雙鏈融合基因和質(zhì)粒pet_28a( + )分別用EcoR I和 Hind III進(jìn)行雙酶切后，用T4連接酶連接，得到連接產(chǎn)物；
[0024] (3)將步驟(2)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)中，鑒定含有pet-28a( + )-EspA-Tir-M 重組質(zhì)粒的重組DH5a菌株，得到重組質(zhì)粒；
[0025] (4)將步驟(3)重組質(zhì)粒導(dǎo)入BL21(DE3)感受態(tài)，得到重組菌株BL21-pet-28a( + )_ EspA-Tir-M;
[0026] (5)誘導(dǎo)步驟(4)重組菌株BL21-pet-28a( + )-EspA-Tir-M表達(dá)和純化重組融合蛋 白 EspA-Tir_M(et)〇
[0027]其中，步驟(1)中PCR所用的引物組如前所示。
[0028]本發(fā)明另一個方面提供了一種重組亞單位疫苗，其中包含前述的重組蛋白。
[0029]本發(fā)明另一個方面提供了本發(fā)明蛋白或者重組亞單位疫苗在預(yù)防EHEC 0157:H7 感染的疫苗或者藥品中的用途。
[0030]上述技術(shù)方案中所述的重組蛋白即為預(yù)防EHEC 0157:H7感染的候選疫苗。
[0031]本發(fā)明具有的有益效果為：通過使用生物信息學(xué)表位預(yù)測的方法對EHEC 0157: H7espA和Tir-M作為抗原進(jìn)行理論上的研究，表明espA-Tir-M具有較多的B細(xì)胞和T細(xì)胞表 位，可作為有效的保護(hù)性抗原，進(jìn)一步用動物實驗驗證了重組蛋白espA-Tir-M免疫小鼠后 可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性抗體和細(xì)胞因子，有效保護(hù)感染EHEC 0157 : H7的小鼠。亞單位是最 具安全性和穩(wěn)定性的一種基因工程疫苗，該重組espA-Tir-M可用于預(yù)防EHEC 0157:H7感染 的候選疫苗。
[0032]為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點能更明顯易懂，下文特舉實例，并配以 附圖表，作如下詳細(xì)說明。
【附圖說明】
[0033] 圖1:重組質(zhì)粒pet-28a( + )-espA-Tir_M構(gòu)建路線圖；
[0034]圖2:重疊延伸PCR結(jié)果，其中泳道M為核酸（DNA)分子量標(biāo)準(zhǔn)（Marker)，泳道1為 espA-Tir M(816bp)；
[0035] 圖3:重組細(xì)菌菌落質(zhì)粒pet-28a( + )-espA-Tir_M PCR鑒定結(jié)果，泳道M為核酸 (DNA)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)，泳道1-6為PCR結(jié)果(816bp);
[0036] 圖4:重組質(zhì)粒pet-28a( + )-espA-Tir_M酶切鑒定，泳道M為核酸(DNA)分子量標(biāo)準(zhǔn) (Marker)，泳道1是重組質(zhì)粒EcoR I和Hind III雙酶切后基因片段，泳道2是重組質(zhì)粒EcoR I單酶切后的基因片段，泳道3是重組質(zhì)粒Hind III單酶切后的基因片段；
[0037] 圖5:重組質(zhì)粒 pet-28a( + )-espA-Tir_M 測序結(jié)果；
[0038] 圖6:SDS-PAGE檢測重組菌株BL21-pet-28a( + )-espA-Tir-M在不同時間誘導(dǎo)產(chǎn)生 重組蛋白et結(jié)果，泳道M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker )，泳道1-4分別為重組菌株加入IPTG誘 導(dǎo)0，l，3,4h的蛋白表達(dá)，泳道5-6為空載體菌株BL21-pet-28a( + )分別誘導(dǎo)0,4h結(jié)果；
[0039]圖7: SDS-PAGE檢測重組蛋白et純化結(jié)果，泳道M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)，泳道 1-2是為空載體菌株BL21-pet-28a( + )分別誘導(dǎo)0,4h結(jié)果對照，泳道3是重組菌株BL21-pet-28a( + )-espA-Tir-M用IPTG誘導(dǎo)4h后細(xì)菌裂解上清液；泳道4重組菌株BL21-pet-28a( + )_ espA-Tir-M用IPTG誘導(dǎo)4h后細(xì)菌裂解后沉淀;泳道5是純化后的重組蛋白et;
[0040] 圖8:WB檢測重組蛋白et結(jié)果；
[0041] 圖9:小鼠血清IgG檢測結(jié)果，分別為首次免疫0,7,21，35天后采血血清用間接 ELI SA檢測，PBS組為roS陰性對照組，et (s. c)為重組蛋白et與弗氏佐劑皮下注射免疫組，et (i ? n)為重組蛋白et滴鼻免疫組；
[0042]圖10:小鼠糞便IgA檢測結(jié)果，小鼠末次免疫后14天糞便用間接ELISA檢測；
[0043]圖11:小鼠細(xì)胞因子檢測，小鼠末次免疫后14天血清用ELISA試劑盒檢測IL-4、IL-10、INF-y表達(dá)水平；
[0044]圖12:攻毒后小鼠生存曲線；
[0045]圖13:攻毒后小鼠體內(nèi)0157定植結(jié)果；
[0046] 圖14:攻毒后小鼠病理切片結(jié)果，厶中11611111、〇〇1〇11、〇6(311111、1^；[￥61'、？&116代&8、 Kindey分別為未免疫的小鼠攻毒EHEC 0157: H7后小腸、結(jié)腸、盲腸、肝臟、脾臟和腎臟的病 理切片;B中a、b、c分別為正常小鼠結(jié)腸、滴鼻免疫小鼠結(jié)腸和皮下注射免疫小鼠結(jié)腸。
【具體實施方式】
[0047] 以下實施例和試驗例中除特別說明外，所用試劑和實驗方法均為本領(lǐng)域常用技術(shù) 方法和材料。
[0048] 實施例1生物信息學(xué)表位預(yù)測篩選EHEC 0157:H7的抗原表位
[0049] 從GenBank查找espA基因序列（KJ549678.1)和Tir M基因序列（NC_002655.2)，分 別使用InterProScan對氨基酸序列中所包含的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行預(yù)測，分別通過ABCPred (http://www?imtech?res?in/raghava/abcpred/ABC_submission?html)和BepiPred (http: //tools ? immuneepi tope ? org/tools/bcell/iedb_input)兩種分析工具預(yù)測蛋白質(zhì) B細(xì)胞表位，通過ProPred(http ://www. imtech .res ? in/raghava/propred/^PINetMHCIIpan (http: //www. cbs ? dtu ? dk/services/NetMHCIIpan/)兩種分析工具預(yù)測蛋白質(zhì)Th細(xì)胞表 位。ProPred選擇49種系統(tǒng)中的HLA-DRB1等位基因，NetMHCIIpan選擇中國人群分布頻率較 高的7種等位基因：HLA-DRB1*0901 (14 ? 4% )、HLA-DRB1*1202( 13 ? 3% )、HLA-DRB1*1501 (10?8 %)、HLA-DRB1*1101(7?0 %)、HLA-DRB1*0803(5?9 %)、HLA-DRB1*0701(5?7 %)、HLA-DRB1*1602(5.3%)〇
[0050] 表1生物信息學(xué)預(yù)測espA、Tir-M細(xì)胞表位結(jié)果
[0052]實施例2引物的設(shè)計及合成
[0053]從GenBank查找espA基因序列（KJ549678.1)和Tir M基因序列（NC_002655.2)， espA上游引物Y端引入EcoR I酶切位點，下游引物去除終止密碼子TAA，引入linker (ggaggcggaagtggaggaggtagc)，引物設(shè)計如下：espA-Pl: 5' -CGGAATTCATGGATACATCAAATGCA (SEQ ID No.2),espA-P2:5/-GCTACCTCCTCCACTTCCGCCTCCTTTACCAAGGGATATTGCTG(SEQ ID No.3) ;Tir-M上游引物引入linker，下游引物引入酶切位點氾11(1111，1'化-]\1-?1:5/-GGAGGCGGAAGTGGAGGAGGTAGCAGCCCAACCACGACCGAC(SEQ ID No.4),Tir M-P2:57-CCCAAGCTTGGCTTGCTGTTTGGCCTCTT(SEQ ID No . 5)，引物由上海生工基因技術(shù)有限公司合 成。
[0054] 實施例3.重疊延伸PCR法制備EspA-Tir M雙鏈融合基因
[0055] 3.1采用基因組DNA提取試劑盒（天根生物）提取EHEC 0157:H7標(biāo)準(zhǔn)株EDL933染色 體DNA為模板，分別擴(kuò)增espA基因序列和Tir-M基因序列，按以下循環(huán)參數(shù)在PCR儀上進(jìn)行反 應(yīng):94°C預(yù)變性5分鐘，然后94°C30sec-58°C30sec-72°C45sec進(jìn)行30個循環(huán)，最后72°C延 伸10分鐘。反應(yīng)結(jié)束1%瓊脂糖凝膠電泳，采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(購于大連寶生物公 司）回收espA和Tir M后進(jìn)行重疊延伸PCR。
[0056] 3.2重疊延伸？0?:先將68口4和1'化]\1在高保真酶反應(yīng)體系中941€3〇86(3458 1€ 30sec-72°C45sec反應(yīng)10個循環(huán)，之后加入上下游引物espA-Pl和Tir M-P2在反應(yīng)條件為 94°C30sec-58°C30sec-72°Clmin反應(yīng)30循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。反應(yīng)結(jié)果1%瓊脂糖 凝膠電泳，瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收espA-Tir M雙鏈融合基因。對espA-Tir M雙鏈融合 基因進(jìn)行測序，測序的結(jié)果如SEQ ID No. 1所示：
[0058]實施例 4 ?構(gòu)建 pet-28a( + )-espA-Tir_M 重組質(zhì)粒
[0059] 4.1將導(dǎo)入pet_28a( + )質(zhì)粒的大腸桿菌DH5a在含50ug/ml紅霉素LB固體培養(yǎng)基復(fù) 蘇后挑取單菌落，在含紅霉素的LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)后，采用小提質(zhì)粒試劑盒(大連寶 生物)提取pet_28a( + )質(zhì)粒。
[0060] 4.2采用EcoR I、Hind III內(nèi)切酶(賽默飛世爾科技)分別雙酶切espA-Tir-M雙鏈 融合基因和pet-28a( + )質(zhì)粒，37°C水浴箱酶切2h，l%瓊脂糖凝膠電泳，采用瓊脂糖凝膠回 收試劑盒回收雙酶切后的產(chǎn)物。
[00611 4.3采用T4連接酶（賽默飛世爾科技)在16°C連接4h后，將含雙酶切后的重組雙鏈 espA-Tir-M融合基因連接入雙酶切后的pet-28a( + )載體(10:1)。
[0062] 4.4將步驟4.3連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌DH5a感受態(tài)，采用PCR鑒定、重組質(zhì)粒雙酶切 鑒定、測序測定篩重組質(zhì)粒pet-28a( + )-espA-Tir-M。
[0063]實施例 5 重組菌株 BL21-pet-28a( + )-espA-Tir-M 的構(gòu)建
[0064] 將步驟4中成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒PET-28a( + )-espA-Tir_M從重組DHDH5a中采用小 提質(zhì)粒試劑盒（大連寶生物）提取后，取2ul轉(zhuǎn)化至BL21/DE3感受態(tài)細(xì)菌后，挑選陽性重組 子，得到重組菌株 BL21-pet-28a( + )-espA-Tir-M。
[0065] 實施例6 ?誘導(dǎo)重組菌株BL21-pet-28a( + )-espA-Tir_M表達(dá)蛋白和純化重組融合 蛋白EspA-Tir_M(et);
[0066] 6.1將重組菌株BL21-pet-28a( + )-espA-Tir_M接種至含卡那霉素(Kan+)(終濃度 50yg/mL)的5mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C200rpm振搖培養(yǎng)過夜。
[0067] 6.2第二天按1:100(菌液:培養(yǎng)基)轉(zhuǎn)接，在371€250印111搖振培養(yǎng)至00 6()() = 0.6(約 3-4h)，取lmL菌液作為誘導(dǎo)前對比樣品后，再加入IPTG(終濃度1 mmol/L)，37°C，200rpm誘 導(dǎo)培養(yǎng)l，3,4h，分別取lmL菌液作為誘導(dǎo)后樣品，并且以空載體菌株BL21-pet-28a( + )分別 誘導(dǎo)〇,4h作為對照。
[0068] 6.3將所有樣品離心收菌，在沉淀中加入100此1\505卞46￡上樣裂解緩沖液后， 煮沸10min，12000rpm離心5min，取10yL進(jìn)行12%SDS-PAGE(分離膠12%、濃縮膠5%)，用考 馬斯亮藍(lán)R250染液室溫染色約4h，脫色液脫色后，用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察是否有重組目 的蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示該重組菌利用IPTG誘導(dǎo)4h可產(chǎn)生較多的重組蛋白。
[0069] 6.4根據(jù)步驟6.3實驗結(jié)果情況，大量表達(dá)重組目的蛋白，用Ni-Agarose His標(biāo)簽 蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化(康為世紀(jì)），按照試劑盒說明操作，并且取重組菌裂解液上清和 沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE，考察重組蛋白et可溶性表達(dá)和包涵體的表達(dá)情況，用SDS-PAGE檢 測顯示，該重組蛋白主要存在細(xì)菌裂解上清液，即主要以可溶性形式存在。
[0070] 實施例7.重組蛋白espA-Tir-M表達(dá)和免疫原性鑒定
[0071] 取步驟6誘導(dǎo)4h后的重組菌種lml，離心棄上清，在沉淀中加入適量1*SDS-PAGE上 樣緩沖液，煮沸10111；[11，12000印1]1離心5111；[11，取20此進(jìn)行12%303-?46￡，用常規(guī)￥68丨61111310七 檢測，結(jié)果顯示在36KD處可檢測到目的條帶。
[0072]實驗例:雙抗原亞單位疫苗對0157 :H7感染的小鼠具有免疫保護(hù)作用 [0073]實驗例1重組蛋白的準(zhǔn)備
[0074] 大量純化制備重組蛋白et，將洗脫的重組蛋白進(jìn)行4°C透析24h，期間更換透析液 PBS 4-5次，取出透析后的蛋白用10KD超濾濃縮管進(jìn)行濃縮，用BCA法進(jìn)行蛋白定量，調(diào)整蛋 白濃度為2mg/ml。
[0075]實驗例2重組亞單位疫苗免疫原性研究
[0076] 2.1選取4-5周齡SPF級BALB/c小鼠，將其隨機(jī)分組15只/組，皮下注射組首次免疫 將2mg/ml的重組蛋白與弗式完全佐劑等體積研磨成水包油懸滴，第2、3次加強(qiáng)免疫將2mg/ ml的重組蛋白與弗式不完全佐劑等體積研磨，在小鼠背部、腹股溝等進(jìn)行多點皮下注射 l〇〇ul/只（蛋白抗原lOOul);滴鼻免疫組進(jìn)行滴鼻lOOul/只蛋白抗原；同時設(shè)置PBS陰性對 照，免疫程序為:〇d、7d和21d。
[0077] 2.2在首次免疫前及首次免疫后7，21，35d斷尾采血，室溫靜置2h后離心取血清（1: 50)用間接ELISA法測定特異性IgG類抗體效價，并且在末次免疫后采集小鼠糞便(1:5)檢測 小鼠特異性SIgA類抗體。
[0078] 2.3第三次免疫后14天，采血測血清中細(xì)胞因子忭1丫，11-4，和11-10 (Elabascience試劑盒)等表達(dá)水平，考察該重組蛋白誘導(dǎo)小鼠的免疫效果，確定最佳免疫 途徑，評價其安全性和免疫預(yù)防效果。
[0079] 實驗例3攻毒菌株準(zhǔn)備
[0080]為解決小鼠對0157菌感染不敏感的問題，先用抗生素選擇的方法使0157獲得對鏈 霉素的耐藥性，鏈霉素的作用是抑制腸道的其它正常菌群，使0157在腸道中成為優(yōu)勢菌 群，有利于其感染。將耐鏈霉素的EHEC 0157 : H7菌接種于LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)8h，離心 后棄上清，再以無菌LB洗滌2次，最后以無菌LB液體重懸菌體，調(diào)整濃度為1.0 X 101()CFU/ml。 [0081 ]實驗例4重組亞單位疫苗免疫保護(hù)效果研究
[0082]小鼠于末次免疫后14天進(jìn)行攻毒實驗，在攻毒前3天給予小鼠含有5g/L鏈霉素的 無菌水溶液飲用，再以5 X 109CFU/只劑量的0157全菌液分兩次，間隔6小時，經(jīng)口灌入小鼠 胃腸道，攻菌后密切觀察小鼠的活動、攝食及精神狀態(tài)的改變，15天觀察期結(jié)束時計算小鼠 的死亡率和排菌量，取病死小鼠的腸道組織、肝臟、脾臟和腎臟，及15天觀察期結(jié)束后免疫 組結(jié)腸進(jìn)行病理切片觀察。
[0083]實驗例5小鼠糞便0157的培養(yǎng)鑒定
[0084] 攻菌后小鼠糞便0157的培養(yǎng)鑒定:取小鼠攻毒后3、5、7、9、11、13、15d糞便數(shù)粒，用 LB培養(yǎng)基懸浮、振碎后置4°C冰箱lh后，涂布于麥康凱瓊脂（SMAC)選擇性培養(yǎng)基平板，以 100mg/CFU< 100視為排菌結(jié)束。
[0085] 6.統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS21.0進(jìn)行單向方差分析LSD統(tǒng)計方法和兩獨立樣本的t檢 驗，以P〈0.05為統(tǒng)計學(xué)有差異，采用GraphPad Prism5進(jìn)行作圖。
[0086] 結(jié)果:動物實驗結(jié)果表明，重組蛋白第一次免疫小鼠后，皮下注射和滴鼻均可以誘 導(dǎo)特異性IgG抗體(*p〈0.05)且兩免疫組無統(tǒng)計學(xué)差異，第二次免疫后滴鼻組的特異性IgG 抗體高于皮下注射組(*P〈〇. 05 )，滴鼻組在第三次免疫后，特異性IgG抗體達(dá)到高峰，且明顯 高于皮下注射組(**P〈〇.001)。兩個免疫組在糞便均可檢測到特異性SIgA類抗體，抗體水平 高于對照組(皮下注射*P〈〇.〇5,滴鼻**口〈0.001)，且滴鼻組高于皮下注射組(*口〈0.05)。末 次免疫后14d，滴鼻免疫可提高IL-4的表達(dá)水平(*p〈0.05)，皮下注射組IL-4表達(dá)水平與PBS 對照無統(tǒng)計學(xué)差異；而滴鼻組和皮下注射組兩個免疫組卻均可提高IL-10和INF-y的表達(dá) 水平(*p〈〇.05)，而且兩免疫組之間并我統(tǒng)計學(xué)差異。
[0087] 對小鼠攻毒后進(jìn)行15天觀察，在觀察期內(nèi)，PBS對照組存活率為10%，滴鼻組存活 率為90%，皮下注射免疫組存活率為50%，在存活小鼠中進(jìn)行0157排菌量的監(jiān)測，結(jié)果顯示 滴鼻組排菌量基本均少于皮下注射組(*P〈〇.05)，且在第11天滴鼻組0157排菌結(jié)束，皮下注 射組有1只在15天觀察期內(nèi)尚未結(jié)束排菌。未免疫接種的小鼠攻毒后狀態(tài)萎靡，行動遲緩， 在攻毒后3天基本出現(xiàn)大部分死亡，病理切片顯示，腸道組織出現(xiàn)不同程度損傷，以結(jié)腸最 為嚴(yán)重，可觀察到腸道潰瘍形成;肝臟可觀察到肝小葉中央靜脈輕度擴(kuò)張充血，少量肝細(xì)胞 水腫變性，肝實質(zhì)內(nèi)少量炎癥細(xì)胞浸潤;脾臟中脾血竇擴(kuò)張，重度淤血，脾小梁動脈壁玻璃 樣變;腎臟出現(xiàn)部分腎近曲小管上皮水腫變性，間質(zhì)毛細(xì)血管充血，少量炎癥細(xì)胞浸潤。取 免疫后小鼠結(jié)腸病理切片可觀察，結(jié)腸的損傷明顯減輕，可見部分炎癥細(xì)胞。
[0088] 綜合，espA-Tir-M重組蛋白滴鼻免疫小鼠產(chǎn)生可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體和細(xì)胞因 子，用具有鏈霉素抗性的0157菌攻毒，經(jīng)加強(qiáng)免疫的小鼠攻毒后可減少0157在腸道內(nèi)的定 植量，保護(hù)率可達(dá)90%，而espA-Tir-M重組蛋白皮下注射免疫效果較差，保護(hù)率為50 %，可 能改重組蛋白不適合用弗氏佐劑作為免疫佐劑。表明重組蛋白滴鼻免疫可對小鼠產(chǎn)生良好 的免疫保護(hù)效果，可作為預(yù)防EHEC 0157: H7感染的候選疫苗。
[0089]以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實施例，并非對本發(fā)明作任何形式上和實質(zhì)上的限 制，凡熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，當(dāng)可利用以上所揭示的技 術(shù)內(nèi)容，而作出的些許改動、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實施例；同時，凡依 據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)技術(shù)對以上實施例所作的任何等同變化的改動、修飾與演變，均仍屬于本 發(fā)明的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種EHEC 0157:H7espA-Tir-M雙抗原片段的融合基因，其序列如SEQ ID No.l所示。2. -種重組蛋白，其由權(quán)利要求1所述的融合基因編碼。3. -種用于權(quán)利要求1所述的融合基因的引物組合物，其由四條引物組成 espA-Pl:5'-CGGAATTCATGGATACATCAAATGCA(SEQ ID No.2), espA-P2:57-GCTACCTCCTCCACTTCCGCCTCCTTTACCAAGGGATATTGCTG(SEQ ID No.3)； Tir-M上游引物引入linker，下游引物引入酶切位點則11(1111，1'化-1-?1:5/-GGAGGCGGAAGTGGAGGAGGTAGCAGCCCAACCACGACCGAC(SEQ ID No.4), Tir M-P2:57-CCCAAGCTTGGCTTGCTGTTTGGCCTCTT(SEQ ID No.5)。4. 如權(quán)利要求2所述的重組蛋白的制備方法，該方法包括以下步驟： (1) 通過重疊延伸PCR法制備espA-Tir-M雙鏈融合基因，其序列為SEQ ID No.l; (2) 將步驟（1)得到espA-Tir-M雙鏈融合基因和質(zhì)粒pet-28a( + )分別用EcoR I和Hind III進(jìn)行雙酶切后，用T4連接酶連接，得到連接產(chǎn)物； (3) 將步驟(2)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)中，鑒定含有pet-28a( + )-EspA-Tir-M重組 質(zhì)粒的重組DH5a菌株，得到重組質(zhì)粒； (4) 將步驟(3)重組質(zhì)粒導(dǎo)入BL21 (DE3)感受態(tài)，得到重組菌株BL21 -pe t-28a (+) -EspA-Tir-M； (5) 誘導(dǎo)步驟（4)重組菌株BL21-pet-28a( + )-EspA-Tir-M表達(dá)和純化重組融合蛋白 espA-Tir-M(et)〇5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其中，步驟（1)中PCR所用的引物組如權(quán)利要求3所 不。6. -種重組亞單位疫苗，其中包含權(quán)利要求2所述的重組蛋白。7. 權(quán)利要求2所述的重組蛋白或者權(quán)利要求6所述的重組亞單位疫苗在預(yù)防EHEC 0157:H7感染的疫苗或者藥品中的用途。
【文檔編號】C12N15/70GK105821065SQ201610280481
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月29日
【發(fā)明人】范宏英, 林如琴, 吳嫻波, 張益多, 李亞文, 吳宇樺
【申請人】南方醫(yī)科大學(xué)