一種洛美沙星半抗原制備方法及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種洛美沙星半抗原和相應(yīng)的人工抗原，同時本發(fā)明也公開了所述洛美沙星半抗原和相應(yīng)的人工抗原的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的洛美沙星半抗原是式1所示產(chǎn)物，用式1所示產(chǎn)物與載體蛋白連接可以得到洛美沙星抗原。所述洛美沙星抗原可應(yīng)用于制備洛美沙星特異性抗體。本發(fā)明制備方法簡便可行、成本較低，半抗原產(chǎn)率較高。本發(fā)明的洛美沙星人工抗原，通過免疫動物可產(chǎn)生針對洛美沙星的特異性抗體，可用于制備檢測洛美沙星殘留的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，具有簡單、快速、處理樣品量大、靈敏度高、特異性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】
-種洛美沙星半抗原制備方法及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于食品安全檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種洛美沙星半抗原、抗原制備方 法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 洛美沙星（lomefloxacin，LMLX)屬二氣哇諾酬類，為第Ξ代哇諾酬類抗菌藥、抗菌 譜廣，1985年首先由日本北陸制藥公司和鹽野義制藥公司生產(chǎn)，我國湖北宜昌制藥廠和南 京第二制藥廠的產(chǎn)品于1993年上市，其化學(xué)名稱為1-乙基-6,8-二氣-7-(3-甲基-1-贓嗦)- 4-氧代-3-哇嘟簇酸，分子量387.81。體外抗菌作用與諾氣沙星相似，較環(huán)丙沙星略差，但其 體內(nèi)抗菌活性，包括對大腸桿菌、肺炎桿菌、綠脈桿菌和金葡菌的作用均明顯優(yōu)于諾氣沙 星。臨床上用于敏感菌所致的呼吸道、尿道感染。該品對鏈球菌、肺炎鏈球菌、洋蔥假單胞 菌、支原體和厭氧菌均無效。
[0003] 洛美沙星副作用的發(fā)生率3.45%，主要為皮疹、曖氣、胃不適、軟便、腹瀉、目眩、搖 晃等;洛美沙星藥物的殘留除其本身的毒副作用對人體造成直接危害外，更為嚴(yán)重的是人 類長期食用含較低濃度洛美沙星藥物的動物源性食品，容易誘導(dǎo)人類致病菌產(chǎn)生耐藥性， 從而影響該類藥物的臨床療效。
[0004] 國內(nèi)外現(xiàn)已開發(fā)出檢測洛美沙星的酶聯(lián)免疫試劑盒，但是現(xiàn)在國內(nèi)生產(chǎn)的試劑盒 在準(zhǔn)確性、靈敏度、特異性等方面還不能完全達(dá)到檢測的要求。本發(fā)明公開的洛美沙星半抗 原、抗原為進(jìn)一步研制洛美沙星抗體及洛美沙星酶聯(lián)免疫試劑盒提供了原料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種洛美沙星半抗原、抗原制備方法及其應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明提供的洛美沙星半抗原，是式1所示化合物：
[0007] 本發(fā)明還公開了式1所示產(chǎn)物的制備方法，包括如下步驟： 50ml圓底燒瓶中加入氯化亞諷10ml，20-24°C磁力攬拌下分批加入洛美沙星原料藥 1100.3mg，50-60°C磁力攬拌3-4小時后50-55°C加壓濃縮，殘留物中加入10ml THF溶解，得 洛美沙星酷氯中間體；50ml圓底燒瓶中加入4-氨基下酸645.8mg，THF 20ml，Ξ乙胺 1266.5mg，20-24°C磁力攬拌15-30min后滴加上步洛美沙星酷氯中間體THF溶液10ml，20-24 °C磁力攬拌3-4小時后35-40°C減壓濃縮，殘留物中加入30ml水，1M鹽酸調(diào)PH到6.5-7，析出 類白色固體，過濾，濾餅用10ml水洗，收集濾餅50°C鼓風(fēng)干燥5-6小時得到957 mg洛美沙星 4-氨基下酸半抗原。
[0008] 本發(fā)明提供的洛美沙星抗原，是將式1所示產(chǎn)物和載體蛋白偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物。
[0009] 本發(fā)明還保護(hù)所述洛美沙星抗原的制備方法，包括如下步驟： (1) 將19.5mg洛美沙星半抗原用1.5ml DMF溶解，200巧m攬拌lOmin，加入邸C 21.5mg溶 解后再加入畑S 13mg，室溫攬拌巧00巧m)活化2-化； (2) 稱取BSA 50mg溶于3.5ml 0.1M碳酸氨鋼溶液中，200巧m攬拌lOmin，使其充分溶解， 將步驟（1)反應(yīng)液于<4°C冰浴1000巧m條件下攬拌，逐滴加入到BSA溶液中，于5(Κ)巧m攬拌反 應(yīng)2地； (3) 將反應(yīng)產(chǎn)物裝入蒸饋水沖洗干凈透析袋，1L 0.01M PH7.2 PBS，4°C 10化pm攬拌， 透析3d，每天換液3次，共計換液9次，將透析產(chǎn)物5000rpm離屯、6min，1.5ml/管分裝，將抗原 編號，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0010] 常用載體蛋白均可采用，如牛血清白蛋白（BSA)，卵清蛋白（OVA)，人血清白蛋白 (HSA)，鼠血清白蛋白（MSA)，甲狀腺蛋白（TG)或血藍(lán)蛋白化LH)等。
[0011] 所述洛美沙星抗原可W作為免疫原免疫動物制備洛美沙星特異性抗體，也可W作 為包被原制備酶標(biāo)板。
[0012] 所述抗體具體可為單克隆抗體。
[0013] 式1所示產(chǎn)物、所述洛美沙星抗原、所述抗體均可應(yīng)用于檢測洛美沙星。
[0014] 本發(fā)明還公布了應(yīng)用洛美沙星抗原和洛美沙星單克隆抗體制備得到的酶聯(lián)免疫 試劑盒。
[0015] 所述酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，是由包被有洛美沙星抗原的酶標(biāo)板、酶標(biāo)抗體工作液、 洛美沙星系列標(biāo)準(zhǔn)品、底物顯色液、終止液、濃縮復(fù)溶液、濃縮洗涂液。
[0016] 本發(fā)明依靠免疫學(xué)、免疫化學(xué)基本原理和殘留分析技術(shù)手段，設(shè)計、合成小分子目 標(biāo)分析物半抗原，并與載體蛋白偶聯(lián)，制備有效人工抗原。本發(fā)明制備方法簡便可行、成本 較低，半抗原產(chǎn)率較高。本發(fā)明的洛美沙星人工抗原，通過免疫動物可產(chǎn)生了針對洛美沙星 的特異性抗體，用于快速檢測食品中的洛美沙星殘留。
【附圖說明】
[0017] 圖1為洛美沙星半抗原的合成路線圖。
[0018] 圖2為洛美沙星半抗原的質(zhì)譜檢測結(jié)果。
[0019] 圖3為洛美沙星酶聯(lián)免疫檢測試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實施方式】
[0020] W下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。
[0021] 實施例1、洛美沙星半抗原的制備 一、洛美沙星半抗原的制備 50ml圓底燒瓶中加入氯化亞諷10ml，20-24°C磁力攬拌下分批加入洛美沙星原料藥 1100.3mg，50-60°C磁力攬拌3-4小時后50-55°C加壓濃縮，殘留物中加入10ml THF溶解，得 洛美沙星酷氯中間體；50ml圓底燒瓶中加入4-氨基下酸645.8mg，THF 20ml，Ξ乙胺 1266.5mg，20-24°C磁力攬拌15-30min后滴加上步洛美沙星酷氯中間體THF溶液10ml，20-24 °C磁力攬拌3-4小時后35-40°C減壓濃縮，殘留物中加入30ml水，1M鹽酸調(diào)PH到6.5-7，析出 類白色固體，過濾，濾餅用10ml水洗，收集濾餅50°C鼓風(fēng)干燥5-6小時得到957 mg洛美沙星 4-氨基下酸半抗原。
[0022] 反應(yīng)方程式如下：
二、洛美沙星半抗原的鑒定 對所得產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，ES+: M+l=437.43 (圖2)。
[0023] 結(jié)果顯示其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式1所示(MW=436)，即為洛美沙星半抗原。
[0024]
[0025] 實施例2、洛美沙星人工抗原的制備和鑒定 一、洛美沙星免疫抗原的合成 1、將19.5mg洛美沙星半抗原用1.5ml DMF溶解，200巧m攬拌lOmin，加入邸C 21.5mg溶 解后再加入畑S 13mg，室溫攬拌巧00巧m)活化2-化。
[0026] 2、稱取BSA 50mg溶于3.5ml 0.1M碳酸氨鋼溶液中，200巧m攬拌lOmin，使其充分溶 解，將步驟1反應(yīng)液于<4°C冰浴lOOOrpm條件下攬拌，逐滴加入到BSA溶液中，于50化pm攬拌 反應(yīng)24h;
[0027] 3、將反應(yīng)產(chǎn)物裝入蒸饋水沖洗干凈透析袋（10cm)，lL0.01M PBSax，pH7.2)4°C 攬拌（lOOrpm)透析3d，每天換液3次(早中晚各一次），共計換液9次，將透析產(chǎn)物5000rpm離 屯、6min，1.5ml/管分裝，將抗原編號，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0027]二、洛美沙星包被抗原的合成 1、將19.5mg洛美沙星半抗原用1.5ml DMF溶解，200巧m攬拌lOmin，加入邸C 21.5mg溶 解后再加入畑S 13mg，室溫攬拌巧00巧m)活化2-化。
[002引 2、稱取OVA 33.6mg溶于3.5ml 0.1M碳酸氨鋼溶液中，200巧m攬拌lOmin，使其充分 溶解，將步驟1反應(yīng)液于<4°C冰浴1000巧m條件下攬拌，逐滴加入到OVA溶液中，于50化pm攬 拌反應(yīng)24h; 3、將反應(yīng)產(chǎn)物裝入蒸饋水沖洗干凈透析袋（10cm)，1L0.01M PBS( 1 X，pH7.2)4°C攬拌 (lOOrpm)透析3d，每天換液3次（早中晚各一次），共計換液9次，將透析產(chǎn)物5000rpm離屯、 6min，1.5ml/管分裝，將抗原編號，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0029]實施例3、酶標(biāo)單抗的制備和特異性鑒定 一、洛美沙星單抗的制備 1、用上述制備出的免疫原按l(K)yg/只，W生理鹽水溶解免疫原與弗氏完全佐劑等體積 混勻，頸背部皮下注射免疫6~8周齡Ba化/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天W免疫原與弗氏 不完全佐劑等體積混勻，各追加免疫一次，融合前3天W免疫復(fù)合物l(K)yg/只，不加弗氏佐 劑再追加免疫一次。
[0030] 2、按常規(guī)方法進(jìn)行，取免疫小鼠的脾細(xì)胞與處于對數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞 (SP2/0)混合，然后在45 s內(nèi)緩慢加入預(yù)熱的融合劑(PEG4000)進(jìn)行融合，用HAT培養(yǎng)基懸浮 均勻，再加入適量的飼養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板，于37 °C，5 % C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5天后用 HT培養(yǎng)基半換液，9天時候進(jìn)行全換液。
[0031] 3、細(xì)胞融合后，待細(xì)胞長到培養(yǎng)孔面積的1/4時，采用分步篩選法篩選雜交瘤細(xì) 胞。初選采用間接化ISA方法，W包被抗原(預(yù)先用方陣法常規(guī)滴定其最佳包被濃度和陽性 血清稀釋度)包被酶標(biāo)板，加入被測孔培養(yǎng)上清，解育，清洗后加入羊抗鼠 IgG-HRP和IgM- HRP，Oro進(jìn)行顯色反應(yīng)。篩選出的陽性孔再用間接競爭化ISA方法篩選，先將細(xì)胞上清與100 yg/mL的洛美沙星等體積混合，37°C水浴作用30min，再加入到包被好的酶標(biāo)板中。同時用 PBS取代洛美沙星作對照，其余步驟同上。若經(jīng)洛美沙星阻斷后的0〇45〇皿值下降到對照孔的 50% W下，則判為陽性，經(jīng)2~3次檢測都為陽性的孔，立即用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆化。
[0032] 4、將2~3次亞克隆建株后的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，收集上清液用間接化ISA測定效 價，凍存;并取8~10周齡Ba化/c小鼠腹腔注射液體石蠟0.5mL/只，7~10日后腹腔注射雜交瘤 細(xì)胞1~2Xl(yV只，7~10日后抽取小鼠腹水，離屯、取上清，測定效價，并凍存?zhèn)溆谩?br>[0033] 二、酶標(biāo)抗體的制備 (1) 稱取辣根過氧化物酶（HRP)2 mg溶解于0.5 mL水中，加入0.5 mL 0.06 mol/L NaI〇4溶液，4°C避光作用30 min; (2) 加入160 mmol/L的乙二醇0.5血，室溫作用30 min; (3) 加入步驟一制備的洛美沙星單抗2 mg，混勻后裝入處理過的透析袋中，置1000 mL 的0.05 mmo 1/L碳酸鋼緩沖液中透析，4°C過夜； (4) 透析液吸至10血的離屯、管中，加0.25mL 5g/L的NaBH4溶液，混勻后置4°C2 h; 巧)加入等體積的飽和硫酸錠溶液，4°C作用30 min后4°C下3000 r/min離屯。5 min,棄 上清； (6) 將沉淀溶于1.5 mL0.02 mol/L pH 7.4的PBS中，吸入透析袋內(nèi)，在0.02mol/L pH 7.4 PBS透析，4°C過夜（中途更換PBS 3次）； (7) 將透析袋中液體吸至微量離屯、管中，4°C下1000化/min離屯、30min，將上清液吸出， 加等量甘油，混勻，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0034] Ξ、酶標(biāo)洛美沙星抗體效價的測定 洛美沙星標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司。
[0035] 用方陣滴定法確定洛美沙星包被抗原和步驟一制備的單抗的工作濃度，洛美沙星 包被抗原的工作濃度為1.化g/mL，單克隆抗體的工作濃度為1:50000。
[0036] 用不同濃度的洛美沙星標(biāo)準(zhǔn)品溶液做實驗溶液，其濃度如下：0、0.6、1.8、5.4、 16.2、48.化g/L。采用8組平行試驗(n=8)。間接競爭性化ISA方法： (1)用上述工作濃度的洛美沙星抗原包被酶標(biāo)板，將洛美沙星標(biāo)準(zhǔn)品實驗溶液與酶標(biāo) 抗體溶液同時加入酶標(biāo)板微孔中，再在每孔中加入50化抗體工作液，同時設(shè)置空白孔(將 添加的抗體溶液換成高純水，其它一致)和陰性對照孔(將標(biāo)準(zhǔn)品實驗溶液用PBS溶液代替， 其它一致），25°C避光環(huán)境中反應(yīng)30min; (2 )倒出孔內(nèi)液體，用洗涂液洗涂3~5次，將酶標(biāo)板倒置在吸水紙上拍干； (3 )加入底物顯色溶液到酶標(biāo)板微孔中，25 °C避光環(huán)境中反應(yīng)15min; (4)加入終止液，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀在波長450nm處測定0D值。
[0037] W0D值為縱坐標(biāo)，W洛美沙星實驗溶液濃度的loglO值為橫坐標(biāo)，繪制半對數(shù)標(biāo)準(zhǔn) 曲線圖。標(biāo)準(zhǔn)曲線具有完整的反S形狀，并具有上平臺和下平臺，標(biāo)準(zhǔn)曲線的平行測定次數(shù)8 次，實驗重復(fù)性良好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(變異系數(shù))均在1 〇%W內(nèi)。
[0038] 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出半數(shù)抑制量(IC50)，確定檢測靈敏度。
[0039] 抑制率用W下式計算： 式中：ODmax:為不加標(biāo)準(zhǔn)品時的吸光值，ODx為標(biāo)準(zhǔn)品X時的吸光值，ODmin為空白對照 孔的吸光值。
[0040] 由上述公式計算得洛美沙星抗體在緩沖液中的半數(shù)抑制量(IC50)為1.8 yg/L。 [0041 ]實施例4、檢測洛美沙星的酶聯(lián)免疫試劑盒及其制備 一、酶聯(lián)免疫試劑盒由下述物質(zhì)組成： (1)包被洛美沙星抗原的酶標(biāo)板； (2 )酶標(biāo)洛美沙星抗體工作液:實施例3中所述酶標(biāo)抗體溶液； (3) 洛美沙星標(biāo)準(zhǔn)品:洛美沙星標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度分別為0、0.6、1.8、5.4、16.2、48.化g/ L； (4) 底物顯色液：由A液和B液組成，A液為2%過氧化脈的水溶液，B液為1%四甲基聯(lián)苯胺 (TMB)的水溶液； (5 )終止液:0.2M硫酸水溶液； (6) 濃縮洗涂液:每1升所述洗涂液是按照如下方法配制得到的：將lOmL吐溫-20、5g疊 氮化鋼和990mL憐酸鹽緩沖液混合，得到所述洗涂液;所述憐酸鹽緩沖液的濃度為0.01M pH 值為7.4; (7) 濃縮復(fù)溶液:0.04mol/L的憐酸鹽緩沖液。
[0042] 二、包被有洛美沙星抗原的酶標(biāo)板及其制備 包被洛美沙星抗原的聚苯乙締酶標(biāo)板:用0.05M的碳酸鹽溶液將抗原稀釋至1.化g/mL， 包被96孔聚苯乙締酶標(biāo)板，每孔10化L，37 °C溫育化，傾去包被液，用洗涂液洗涂3次，每次 10s，拍干，然后在每孔中加入15化L封閉液，37°C溫育化，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用侶膜真空 密封保存。
[0043] 包被緩沖液:pH9.6，0.05mol/L的碳酸鋼緩沖液； 封閉液:每1升封閉液按照如下方法配制：將5mL馬血清、Ig疊氮化鋼、30g酪蛋白混合， 用憐酸鹽緩沖液溶解并定容至lOOOmL，得到封閉液;其中，憐酸鹽緩沖液的濃度為0.02M，抑 值為7.2。
[0044] Ξ、試劑盒檢測方法 (一)樣品前處理 (1)雞肉、鴨肉 a)準(zhǔn)確稱取1±〇.01 g新鮮樣品于50 mL離屯、管中；b)雞肉樣本:加入4 mL雞肉樣 品提取液；鴨肉樣本:加入4 mL鴨肉樣品提取液，滿動2 min; C) 4000 g離屯、10 min;d) 取500 mL上清液于屯、的離屯、管中；e)加入500 mL樣品稀釋液，充分滿動10s;f)取50 mL上 清液進(jìn)行檢測。
[0045] (2)純牛奶 a)將純牛奶樣品充分平衡至室溫(25±2°C)，混勻;b)取50 mL純牛奶樣品于離屯、管 中，加入450 mL樣品稀釋液，充分滿動20 s;c)取50 mL進(jìn)行檢測。
[0046] (3)牛肉、豬肉、豬肝、雞肝 a)稱取1±0.01 g均質(zhì)后的樣品于離屯、管中；b)加入0.5 mL樣品稀釋液，充分滿動 2〇3;(3)再加入4.5血乙臘，立即滿動至組織完全分散;(1)室溫(25±2°(：)下，搖床300巧111 振搖20 min;e) 4000 gW上，離屯、10 min;f)取1 mL上清液于新的離屯、管中；g) 50-60°C 水浴中，氮?dú)獯蹈?h)加入2 mL正己燒，充分滿動20 s，再加入1 mL樣品稀釋液，低速滿動 10 s;i) 4000 gW上，離屯、5 min,完全棄去上層正己燒及中間層雜質(zhì)；j)豬肉樣品：直接 取50 mL進(jìn)行檢測；牛肉、豬肝、雞肝樣品：取100 mL與100化樣品稀釋液，充分滿動20 S后， 取50 mL進(jìn)行檢測。
[0047] (二)用試劑盒檢測 1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 向包被有洛美沙星抗原的酶標(biāo)板微孔中加入洛美沙星標(biāo)準(zhǔn)品溶液50化，然后加入酶標(biāo) 二抗工作液50化/孔，再在每孔中加入50化抗體工作液，輕輕振蕩混合均勻，用蓋板膜蓋 板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)40 min。小屯、掲開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，加入洗涂工作液 260 mL/孔，充分洗涂4~5次，每次間隔10s，潑掉板孔內(nèi)洗涂液，用吸水紙拍干。加入底物A液 50 μL孔、底物B液50 μL孔，輕輕振蕩混勻，25°C恒溫箱避光顯色15 min,每孔加入終止液 50 yL，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀，測定每孔吸光度值。
[0048] 用每個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均值(B)除W第一個標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0標(biāo)準(zhǔn)）的 吸光度值(Bo)再乘W100%，得到百分吸光度值。W洛美沙星標(biāo)準(zhǔn)品濃度(yg/L)的半對數(shù)值 為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。
[0049] 百分吸光度值(％)=(B/B0) X100% 2、 樣品中洛美沙星濃度的測定 用每個檢測樣本溶液的吸光度平均值(B)除W第一個標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值 (Bo)再乘W100%，得到百分吸光度值。相對應(yīng)每一個檢測樣本溶液的百分吸光度值，則可從 標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出檢測樣本溶液的吸光度值，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度值換算出樣本溶液中 洛美沙星的殘留量，最后再乘W各樣品前處理過程的稀釋倍數(shù)，即可計算出樣品中洛美沙 星的濃度。
[0050] 四、試劑盒檢測效果評價 (一)準(zhǔn)確度和精密度試驗 向不含洛美沙星的雞肉、豬肉樣品中添加洛美沙星標(biāo)準(zhǔn)品，使洛美沙星標(biāo)準(zhǔn)品在樣品 中的終濃度分別為4、8、16 μg/レ將添加后的樣品分別按照實驗Ξ中所述方法進(jìn)行前處理， 得到檢測樣本溶液。
[0051] 從Ξ個不同批次的試劑盒中各抽取3個試劑盒進(jìn)行檢測，檢測方法如實驗Ξ中所 述，每個實驗重復(fù)5次，分別計算變異系數(shù)。結(jié)果分別見表1。
[0052] 表1準(zhǔn)確度和精密度試驗結(jié)果
批內(nèi)變異系數(shù):同一次測定中各平行樣本的變異系數(shù)。
[0053] 批間變異系數(shù):同一樣本在不同批次測定結(jié)果的變異系數(shù)，取其平均值。
[0054] 結(jié)果表明：雞肉樣品的平均添加回收率在86.9~97.3%，批內(nèi)變異系數(shù)在6.4~ 13.6%，批間變異系數(shù)在9.8~10.1 %;豬肉樣品的平均添加回收率在87.0~102.3%，批內(nèi)變異 系數(shù)在3.7~11.0%，批間變異系數(shù)在7.0~9.5%。
[0055] (二)試劑盒保存期 試劑盒保存條件為2~8°C，經(jīng)過15個月的測定，試劑盒的最大吸光度值(0標(biāo)準(zhǔn)），50%抑 制濃度、洛美沙星添加實際測定值均在正常范圍之內(nèi)。考慮到運(yùn)輸和使用過程中，會有非正 常保存條件出現(xiàn)，將試劑盒在37°C保存的條件下放置9天，進(jìn)行加速老化實驗，結(jié)果表明該 試劑盒的各項指標(biāo)完全符合要求?？紤]到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將試劑盒放入-20°C冰箱冷 凍9天，測定結(jié)果也表明試劑盒各項指標(biāo)完全正常。從W上結(jié)果可得出試劑盒可W在2~8°C 至少可W保存12個月W上。
[0056] (Ξ)交叉反應(yīng)率試驗 選擇與洛美沙星結(jié)構(gòu)或功能相似的其他藥物進(jìn)行交叉反應(yīng)試驗，通過各種藥物的標(biāo)準(zhǔn) 曲線分別得到其50%抑制濃度。計算試劑盒對其它類似物的交叉反應(yīng)率，與其他藥物的交叉 反應(yīng)率越小，說明洛美沙星酶聯(lián)免疫檢測試劑盒對洛美沙星的檢測特異性越好。結(jié)果見表 2。
[0化7] 表2洛美沙星試劑盒交叉反應(yīng)率
試驗結(jié)果表明，本發(fā)明試劑盒對洛美沙星的交叉反應(yīng)率為100%、氧氣沙星、達(dá)氣沙星、 諾氣沙星和培氣沙星的交叉反應(yīng)率均小于1%，所W試劑盒對洛美沙星的特異性好，即本發(fā) 明試劑盒可W檢測洛美沙星。
【主權(quán)項】
1. 一種洛美沙星半抗原，為式1所示產(chǎn)物：2. 式1所示產(chǎn)物的制備方法，包括如下步驟： 50ml圓底燒瓶中加入氯化亞諷10ml，20-24°C磁力攬拌下分批加入洛美沙星原料藥 1100.3mg，50-60°C磁力攬拌3-4小時后50-55°C加壓濃縮，殘留物中加入10ml THF溶解，得 洛美沙星酷氯中間體；50ml圓底燒瓶中加入4-氨基下酸645.8mg，THF 20ml，Ξ乙胺 1266.5mg，20-24°C磁力攬拌15-30min后滴加上步洛美沙星酷氯中間體THF溶液10ml，20-24 °C磁力攬拌3-4小時后35-40°C減壓濃縮，殘留物中加入30ml水，1M鹽酸調(diào)PH到6.5-7，析出 類白色固體，過濾，濾餅用10ml水洗，收集濾餅50°C鼓風(fēng)干燥5-6小時得到957 mg洛美沙星 4-氨基下酸半抗原。3. -種洛美沙星抗原，是將式1所示產(chǎn)物和載體蛋白偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的洛美沙星抗原，其特征在于，所述載體蛋白可為牛血清白蛋 白，卵清蛋白，人血清白蛋白，鼠血清白蛋白，甲狀腺蛋白或血藍(lán)蛋白。5. 權(quán)利要求3所述洛美沙星抗原的制備方法，包括如下步驟： (1) 將19.5mg洛美沙星半抗原用1.5ml DMF溶解，200巧m攬拌10分鐘，加入抓C 21.5mg 溶解后再加入畑S 13mg，室溫50化pm攬拌活化2-3小時； (2) 稱取BSA 50mg溶于3.5ml 0.1M碳酸氨鋼溶液中，200巧m攬拌10分鐘，使其充分溶 解，將步驟（1)反應(yīng)液于<4°C冰浴100化pm條件下邊攬拌，逐滴加入至化SA溶液中，于50化pm 攬拌反應(yīng)24小時； (3) 將反應(yīng)產(chǎn)物裝入蒸饋水沖洗干凈透析袋，1L 0.01M PH7.2 PBS，4°C l(K)rpm攬拌， 透析3天，每天換液3次，將透析產(chǎn)物5000巧m離屯、6min，-20 °C保存?zhèn)溆谩?. 權(quán)利要求3所述洛美沙星抗原在制備洛美沙星特異性抗體中的應(yīng)用。7. 應(yīng)用權(quán)利要求3所述洛美沙星抗原制備得到的特異性抗體。8. 權(quán)利要求1所述產(chǎn)物、權(quán)利要求3所述洛美沙星抗原、權(quán)利要求7所述抗體在檢測洛美 沙星中的應(yīng)用。9. 應(yīng)用權(quán)利要求1所述產(chǎn)物、權(quán)利要求3所述洛美沙星抗原、權(quán)利要求7所述特異性抗體 制備得到的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。10. 權(quán)利要求9所述酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于包括:包被有洛美沙星抗原的酶 標(biāo)板、酶標(biāo)抗體工作液、洛美沙星系列標(biāo)準(zhǔn)品、底物顯色液、終止液、濃縮復(fù)溶液、濃縮洗涂 液。
【文檔編號】C07K14/77GK106083815SQ201610516996
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月4日
【發(fā)明人】曹罡, 吳雨洋, 秦譽(yù), 王照鵬, 李詩焱, 劉薇
【申請人】北京明日達(dá)科技發(fā)展有限責(zé)任公司