Nfic基因在制備垂體瘤診治產(chǎn)品中的應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了NFIC基因可以作為垂體瘤早期診斷的分子標(biāo)志物。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，與正常垂體組織相比，垂體瘤組織中NFIC基因表達(dá)顯著升高，且經(jīng)過(guò)RNA干擾實(shí)驗(yàn)證明NFIC能夠影響垂體瘤細(xì)胞的增殖。根據(jù)本發(fā)明的研究成果，可以研發(fā)能夠抑制NFIC基因表達(dá)的藥物，從而實(shí)現(xiàn)臨床上對(duì)于垂體瘤的預(yù)防和治療。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
NFIC基因在制備垂體瘤診治產(chǎn)品中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及NFIC基因在垂體瘤的診斷、治療中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 垂體瘤(pituitary adenoma)是常見(jiàn)的顏內(nèi)腫瘤，在顏內(nèi)腫瘤發(fā)生率中位于第三 位，僅次于腦膠質(zhì)瘤和腦膜瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的10-25 %，雖然垂體腺瘤是一種良性腫瘤，但 是部分腫瘤呈侵襲性生長(zhǎng)常累及視神經(jīng)、蝶竇、海綿竇、頸內(nèi)動(dòng)脈(：2段、下丘腦等周?chē)匾?結(jié)構(gòu)。影響患者正常的內(nèi)分泌及神經(jīng)功能，如閉經(jīng)、泌乳、不孕，性功能障礙，肢端肥大癥，皮 質(zhì)醇增多癥，視力下降，視野缺損等。對(duì)大多數(shù)垂體瘤而言，經(jīng)蝶竇顯微手術(shù)仍是首選的治 療方法，盡管相對(duì)于傳統(tǒng)開(kāi)顱手術(shù)，經(jīng)蝶竇顯微手術(shù)并發(fā)癥有所減少，但是手術(shù)并不能完全 解除患者的問(wèn)題，同時(shí)術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，大腺瘤(直徑>lcm)術(shù)后5年復(fù)發(fā)率高達(dá)。侵襲性垂 體腺瘤手術(shù)很難完全切除，復(fù)發(fā)率更高，是臨床治療中的一大難題。
[0003] 因此，提高該腫瘤的早期診斷，探索有效的治療方法具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì) 效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種可用于垂體瘤早期診斷的分子標(biāo)志物。使用基因標(biāo)志 物來(lái)診斷垂體瘤的具有及時(shí)性、特異性和靈敏性，從而使患者在疾病早期就能知曉疾病風(fēng) 險(xiǎn)，針對(duì)風(fēng)險(xiǎn)高低，采取相應(yīng)的預(yù)防和治療措施。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明提供了檢測(cè)NFIC基因表達(dá)的產(chǎn)品在制備診斷垂體瘤的工具中的應(yīng)用。
[0007] 進(jìn)一步，所述檢測(cè)NFIC基因表達(dá)的產(chǎn)品包括檢測(cè)NFIC基因 mRNA水平的產(chǎn)品、和/或 檢測(cè)NFIC蛋白水平的產(chǎn)品。
[0008] 進(jìn)一步，所述檢測(cè)NFIC基因表達(dá)的產(chǎn)品包括:通過(guò)RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫檢 測(cè)、原位雜交或芯片檢測(cè)NFIC基因表達(dá)以診斷垂體瘤的產(chǎn)品。
[0009] 進(jìn)一步，所述用RT-PCR診斷垂體瘤的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增NFIC基因的引 物;所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷垂體瘤的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增NFIC基因的引物;所述用 免疫檢測(cè)診斷垂體瘤的產(chǎn)品包括:與NFIC蛋白特異性結(jié)合的抗體;所述用原位雜交診斷垂 體瘤的產(chǎn)品包括:與NFIC基因的核酸序列雜交的探針;所述用芯片診斷垂體瘤的產(chǎn)品包括： 蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括與NFIC蛋白特異性結(jié)合的抗體，基因芯片包括與 NFIC基因的核酸序列雜交的探針。
[0010]所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷垂體瘤的產(chǎn)品至少包括的一對(duì)特異擴(kuò)增NFIC基因的引物 如SEQIDN0·3和SEQIDN0·4所示。
[0011]所述檢測(cè)NFIC基因表達(dá)的產(chǎn)品可以是檢測(cè)NFIC基因表達(dá)的試劑、也可以是包含所 述試劑的試劑盒、芯片、試紙等，也可以是使用所述試劑的高通量測(cè)序平臺(tái)。
[0012]所述診斷垂體瘤的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測(cè)序平臺(tái)；高 通量測(cè)序平臺(tái)是一種特殊的診斷垂體瘤的工具，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，對(duì)一個(gè)人的 基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過(guò)對(duì)比疾病患者和正常人群的基因表達(dá)譜， 容易分析出哪個(gè)基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測(cè)序中獲知NFIC基因的異常與垂 體瘤相關(guān)也屬于NFIC基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種診斷垂體瘤的工具，所述工具包括檢測(cè)NFIC基因表達(dá)的試 劑;所述試劑包括檢測(cè)NFIC基因 mRNA的引物和/或探針、檢測(cè)NFIC蛋白的抗體。
[0014] 所述工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測(cè)序平臺(tái)。
[0015] 其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片;所述基因芯片包括固相載體以及固定 在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測(cè)NFIC基因轉(zhuǎn)錄水平的針對(duì) NFIC基因的寡核苷酸探針;所述蛋白質(zhì)芯片包括固相載體以及固定在固相載體的NFIC蛋白 的特異性抗體;所述基因芯片可用于檢測(cè)包括NFIC基因在內(nèi)的多個(gè)基因（例如，與垂體瘤相 關(guān)的多個(gè)基因）的表達(dá)水平。所述蛋白質(zhì)芯片可用于檢測(cè)包括NFIC蛋白在內(nèi)的多個(gè)蛋白質(zhì) (例如與垂體瘤相關(guān)的多個(gè)蛋白質(zhì)）的表達(dá)水平。通過(guò)將多個(gè)與垂體瘤的標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè)， 可大大提高垂體瘤診斷的準(zhǔn)確率。
[0016] 其中，所述試劑盒包括基因檢測(cè)試劑盒和蛋白免疫檢測(cè)試劑盒;所述基因檢測(cè)試 劑盒包括用于檢測(cè)NFIC基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑;所述蛋白免疫檢測(cè)試劑盒包括NFIC蛋白的特 異性抗體。進(jìn)一步，所述試劑包括使用RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫檢測(cè)、原位雜交或芯片方 法檢測(cè)NFIC基因表達(dá)水平過(guò)程中所需的試劑。優(yōu)選地，所述試劑包括針對(duì)NFIC基因的引物 和/或探針。根據(jù)NFIC基因的核苷酸序列信息容易設(shè)計(jì)出可以用于檢測(cè)NFIC基因表達(dá)水平 的引物和探針。
[0017] 所述試紙包括檢測(cè)NFIC基因表達(dá)的試劑。
[0018] 所述高通量測(cè)序平臺(tái)包括檢測(cè)NFIC基因表達(dá)的試劑。
[0019 ] 與NF IC基因的核酸序列雜交的探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其它衍 生物。所述探針的長(zhǎng)度沒(méi)有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié)合，任 何長(zhǎng)度都可以。所述探針的長(zhǎng)度可短至25、20、15、13或10個(gè)堿基長(zhǎng)度。同樣，所述探針的長(zhǎng) 度可長(zhǎng)至60、80、100、150、300個(gè)堿基對(duì)或更長(zhǎng)，甚至整個(gè)基因。由于不同的探針長(zhǎng)度對(duì)雜交 效率、信號(hào)特異性有不同的影響，所述探針的長(zhǎng)度通常至少是14個(gè)堿基對(duì)，最長(zhǎng)一般不超過(guò) 30個(gè)堿基對(duì)，與目的核苷酸序列互補(bǔ)的長(zhǎng)度以15-25個(gè)堿基對(duì)最佳。所述探針自身互補(bǔ)序列 最好少于4個(gè)堿基對(duì)，以免影響雜交效率。
[0020 ]進(jìn)一步，所述NF IC蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述NF IC蛋白 的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾(例如，，嵌合抗體、scFv、Fab、F (ab'）2、Fv等。只要所述片段能夠保留與NFIC蛋白的結(jié)合能力即可。用于蛋白質(zhì)水平的抗體 的制備時(shí)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且本發(fā)明可以使用任何方法來(lái)制備所述抗體。
[0021] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述檢測(cè)NFIC基因 mRNA的引物包括SEQ ID N0.3和 SEQ ID NO.4所示的引物對(duì)。
[0022] 本發(fā)明還提供了NFIC基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的抑制劑在制備治療垂體瘤的藥物中 的應(yīng)用。所述抑制劑包括抑制NFIC基因表達(dá)的試劑、和/或抑制NFIC基因表達(dá)產(chǎn)物的試劑。 [0023] 進(jìn)一步，所述抑制NFIC基因表達(dá)的試劑包括抑制基因轉(zhuǎn)錄的試劑、抑制基因翻譯 的試劑;所述抑制NF IC基因表達(dá)產(chǎn)物的試劑包括抑制NF IC基因 mRNA的試劑、抑制NF IC蛋白 的試劑。所述抑制NFIC基因 mRNA的試劑包括抑制mRNA穩(wěn)定性的試劑、抑制mRNA翻譯活性的 試劑。所述抑制NFIC蛋白的試劑包括抑制NFIC蛋白穩(wěn)定性的試劑、抑制NFIC蛋白活性的試 劑、抑制NFIC蛋白功能的試劑。
[0024] 進(jìn)一步，抑制NFIC基因 mRNA的試劑包括針對(duì)NFIC基因 mRNA的雙鏈核糖核酸;抑制 NFIC蛋白功能的試劑包括NFIC抗原蛋白的腫瘤疫苗、抑制NFIC蛋白功能的抗體。所述抗體 可以是多克隆抗體，或是單克隆抗體。
[0025]在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述針對(duì)NFIC基因 mRNA的雙鏈核糖核酸是siRNA。為 了確保NFIC基因能夠被高效剔除或沉默，根據(jù)NFIC基因的mRNA序列設(shè)計(jì)了 s iRNA特異性片 段。siRNA的設(shè)計(jì)根據(jù)已發(fā)表的通用設(shè)計(jì)原則（Elbashir et.al 2001，Schwarz et.al 2003,Khvorova et.al 2003,Reynolds et.al 2004,Hsieh et.al 2004,Ui-Tei et.al 2004)，通過(guò)在線工具完成設(shè)計(jì)，該在線工具為：siRNASelectionProgram of Whitehead Institute(BingbingYuan et.al 2004，http://jura·wi.mit·edu/bioc/siRNAext/)和 BLOCK-iTTM RNAi Designer ofINVITR0GEN(winner of the 2004Frost&Sul1ivan Excellence in Research Award，https ://rnaidesigner · invitrogen · com/sirna/) 〇為了 進(jìn)一步提高siRNA片斷的有效性，綜合兩個(gè)在線設(shè)計(jì)工具的優(yōu)點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)用于篩選的siRNA片 斷。最后，通過(guò)同源性比對(duì)(NCBI BLAST)來(lái)過(guò)濾siRNA序列，以提高siRNA片斷的特異性并減 少RNAi干擾的脫靶效應(yīng)。
[0026] 優(yōu)選地，所述siRNA的序列如SEQIDN0·9和SEQIDN0.10所示。
[0027] 本發(fā)明還提供了一種用于治療垂體瘤的藥物組合物，所述藥物組合物包括上面所 述的NFIC基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的抑制劑。
[0028] 本發(fā)明的藥物組合物還包括藥學(xué)上可接受的載體，其中該載體可為賦形劑、稀釋 劑、增稠劑、填充劑、結(jié)合劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、油脂或非油脂的基劑、表面活性劑、懸浮劑、膠 凝劑、輔助劑、防腐劑、抗氧化劑、穩(wěn)定劑、著色劑或香料其中之一或兩者以上的混合。
[0029] 本發(fā)明的藥物組合物可用于制造治療垂體瘤的藥劑。
[0030] 本發(fā)明的藥物組合物首選應(yīng)用于哺乳動(dòng)物，其中該哺乳動(dòng)物優(yōu)選為人類(lèi)病患。
[0031] 本發(fā)明的藥物組合物可例如以口服、注射等方式給予至該人類(lèi)病患體內(nèi)。
[0032] 本發(fā)明的藥物組合物還可與其他治療垂體瘤的藥物聯(lián)用，多種藥物聯(lián)合使用可以 大大提到治療的成功率。
[0033] 在本發(fā)明的上下文中，"NFIC基因"包括NFIC基因以及NFIC基因的任何功能等同物 的多核苷酸。NFIC基因包括與目前國(guó)際公共核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)GeneBank中NFIC基因（NC_ 000019.10)DNA序列具有70%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
[0034] 優(yōu)選地，NFIC基因的編碼序列包括以下任一一種DNA分子：
[0035] (1)序列表中SEQ ID N0· 1所不的DNA序列；
[0036] (2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；
[0037] (3)與（1)或(2)限定的DNA序列具有70%、優(yōu)選地，90%以上同源性，且編碼相同功 能蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0038]在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述NFIC基因的編碼序列是SEQ ID NO. 1所示的DNA 序列。
[0039]在本發(fā)明的上下文中，NF IC基因表達(dá)產(chǎn)物包括NFIC蛋白以及NFIC蛋白的部分肽。 所述NFIC蛋白的部分肽含有與垂體瘤相關(guān)的功能域。
[0040] "NFIC蛋白"包括NFIC蛋白以及NFIC蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括 NFIC蛋白保守性變異蛋白質(zhì)、或其活性片段，或其活性衍生物，等位變異體、天然突變體、誘 導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與NFIC的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白質(zhì)。
[0041 ]優(yōu)選地，NFIC蛋白是具有下列氣基酸序列的蛋白質(zhì)：
[0042] (1)由序列表中SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0043] (2)將SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且與SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID N0.2所示的氨 基酸序列衍生的蛋白質(zhì)。取代、缺失或者添加的氨基酸的個(gè)數(shù)通常為1-50個(gè)，較佳地1-30 個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè)。
[0044] (3)與SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性(又稱(chēng)為序列同一性）， 更優(yōu)選地，與SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列至少約90%至95%的同源性，常為96%、97%、 98 %、99 %同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。
[0045]在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述NFIC蛋白是具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序 列的蛋白質(zhì)。
[0046] 通常，已知的是，一個(gè)蛋白質(zhì)中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的修飾不會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能。 本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可改變單個(gè)氨基酸或小百分比的氨基酸或?qū)Π被嵝蛄械膫€(gè)別添加、 缺失、插入、替換是保守修飾，其中蛋白質(zhì)的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白質(zhì)。提供功能相 似的氨基酸的保守替換表是本領(lǐng)域公知的。
[0047] 通過(guò)添加一個(gè)氨基酸或多個(gè)氨基酸殘基修飾的蛋白質(zhì)的例子是NFIC蛋白的融合 蛋白。對(duì)于與NFIC蛋白融合的肽或者蛋白質(zhì)沒(méi)有限制，只要所得的融合蛋白保留NFIC蛋白 的生物學(xué)活性即可。
[0048]本發(fā)明的NFIC蛋白也包括對(duì)SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列的非保守修飾，只要 經(jīng)過(guò)修飾的蛋白質(zhì)仍然能夠保留NFIC蛋白的生物學(xué)活性即可。在此類(lèi)修飾蛋白質(zhì)中突變的 氨基酸數(shù)目通常是10個(gè)或者更少，例如6個(gè)或者更少，例如3個(gè)或者更少。
[0049] 在本發(fā)明的上下文中，"診斷垂體瘤"既包括判斷受試者是否已經(jīng)患有垂體瘤、也 包括判斷受試者是否存在患有垂體瘤的風(fēng)險(xiǎn)。
[0050] 在本發(fā)明的上下文中，"治療垂體瘤"從疾病的狀態(tài)變化來(lái)分，可以包括疾病的緩 解、疾病的完全治愈，還包括用于評(píng)價(jià)疾病的治療效果。
[0051 ]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：
[0052] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了NFIC基因表達(dá)與垂體瘤相關(guān)，通過(guò)檢測(cè)受試者組織中NFIC的表 達(dá)，可以判斷受試者是否患有垂體瘤、或者判斷受試者是否存在患有垂體瘤的風(fēng)險(xiǎn)，從而指 導(dǎo)臨床醫(yī)師給受試者提供預(yù)防方案或者治療方案。
[0053]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種新的分子標(biāo)記物-NFIC基因，相比傳統(tǒng)的檢測(cè)手段，基因診斷更 及時(shí)、更特異、更靈敏，能夠?qū)崿F(xiàn)垂體瘤的早期診斷，從而降低垂體瘤的死亡率和復(fù)發(fā)率。
【附圖說(shuō)明】
[0054]圖1顯示利用基因芯片檢測(cè)NFIC基因在垂體瘤組織與正常垂體組織中的表達(dá)情 況；
[0055] 圖2顯示利用QPCR檢測(cè)s i RNA對(duì)NFIC基因的干擾效率；
[0056] 圖3顯示NFIC基因表達(dá)對(duì)垂體瘤細(xì)胞增殖能力的影響。
[0057]具體的實(shí)施方式
[0058]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件，例如Sambrook等人，分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0059] 實(shí)施例1 NFIC基因的差異表達(dá)
[0060] 1、收集樣本
[0061 ]垂體瘤患者：10例垂體瘤患者中男性5例，年齡為28-73歲，平均年齡為47歲；女性5 例，年齡為25-68歲，平均年齡為44歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者行經(jīng)鼻蝶垂體瘤手術(shù)切除，術(shù)前有顱 腦MRI等影像學(xué)資料，術(shù)后病理切片證實(shí)為垂體瘤。經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，經(jīng)患者簽署 知情同意書(shū)后取材。
[0062]正常垂體組織:取自大學(xué)解剖教研室，共5例，排除內(nèi)分泌相關(guān)疾患。取材方法同垂 體瘤患者。
[0063] 手術(shù)取所需組織，生理鹽水洗凈后，立即放入經(jīng)焦碳酸二乙醋(DEPC)水處過(guò)的凍 存管中，置入液氮備用。
[0064] 2、RNA提取以及質(zhì)量分析
[0065] 使用Trizol-步法提取垂體瘤組織和正常垂體組織的總RNA，通過(guò)Nanodrop ND- 1000讀取260nm和280nm處的吸光度值(A)測(cè)定RNA溶液的純度。經(jīng)1 %甲醛變性瓊脂糖凝膠 電泳，紫外透射光下觀察，檢測(cè)RNA的完整性。
[0066] 3、基因芯片雜交及掃描
[0067] 總RNA經(jīng)線性化擴(kuò)增后，cy3-UTP標(biāo)記，熒光標(biāo)記后的cRNAs采用RNEASY Mini Kit 純化，用Amhion的RNA Fragmentation Reagents對(duì)標(biāo)記好的cRNAs進(jìn)行片段化處理。采用美 國(guó)Agilent公司的人全基因表達(dá)譜芯片(4x 44K基因），在芯片雜交爐中65°C雜交17h，然后 洗脫、染色，最后用Agilent DNA MicroarrayScanner掃描儀掃描。
[0068] 4、芯片數(shù)據(jù)處理與分析
[0069] 雜交后的芯片經(jīng)芯片掃描儀讀取數(shù)據(jù)點(diǎn)后，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入分析軟件，對(duì)于兩組比值 的自然對(duì)數(shù)絕對(duì)值大于2.0或小于0.5的基因作為差異表達(dá)基因。
[0070] 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
[0071] 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間差異比較采用單因素方差分析法，P〈 0.05差異有顯著性意義。
[0072] 6、結(jié)果
[0073] 結(jié)果如圖1所示，與正常垂體組織相比，垂體瘤組織中NFIC基因的mRNA水平顯著增 加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈〇. 05)。
[0074] 實(shí)施例2 qPCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證NFIC基因的差異表達(dá)
[0075] 1、收集樣本
[0076]按照實(shí)施例1的標(biāo)準(zhǔn)收集垂體瘤患者40例，取其垂體瘤組織。收集正常垂體組織30 例。
[0077] 2、RNA 提取
[0078] 米用 TRIz〇:l?Reagent( invitrogen，貨號(hào) 15596_018)進(jìn)行樣本1?祖提取。具體操作 如下：
[0079] 收集樣本后凍存于液氮，取出后把組織放入已預(yù)冷的研缽中進(jìn)行研磨，待組織樣 本成粉末狀后：
[0080] ①加入Trizol，室溫保存5分鐘；
[0081 ]②加氯仿0.2ml，用力振蕩離心管，充分混勻，室溫下放置5-10分鐘；
[0082]③12000rpm高速離心15分鐘后吸取上層水相(吸70% )到另一新離心管管中，注意 不要吸到兩層水相之間的蛋白物質(zhì)。移入新管，加入等體積的_20°C預(yù)冷異丙醇，充分顛倒 混勻，置于冰上10分鐘；
[0083] ④12000rpm高速離15分鐘后小心棄掉上清液，按lml/ml Trizol的比例加入75% DEPC乙醇洗漆沉淀(4°C保存），洗漆沉淀物，振蕩混合，4°C下12000rpm高速離心5分鐘； [0084]⑤棄去乙醇液體，室溫下放置5分鐘以充分晾干沉淀，加入DEPC處理過(guò)的水溶解沉 淀；
[0085] ⑥用Nan〇dr〇p2000紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA純度及濃度，凍存于-70°C JNA質(zhì)量判 定標(biāo)準(zhǔn):RNA樣本的0D260/0D280值為1.7-2.2之間；總RNA電泳圖譜有清晰的28S、18S條帶； 70°C水浴保溫1小時(shí)后的電泳圖譜與水浴保溫前的圖譜無(wú)明顯差異。
[0086] 3、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA
[0087] 米用SuperScript3iIII Reverse Transcriptase(invitrogen，貨號(hào) 18080-044)進(jìn) 行cDNA反轉(zhuǎn)錄，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，具體操作如下：
[0088] 使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，用逆轉(zhuǎn)錄緩沖液對(duì)lyg總RNA進(jìn)行逆反錄合成cDNA。采用25μ1 反應(yīng)體系，每個(gè)樣品取lyg總RNA作為模板RNA，在PCR管中分別加入以下組分：
[0089] 5X逆轉(zhuǎn)錄緩沖液5yl，10mmol/l dNTP 1.25yl，0.1mmol/l DTT 2·5μ1，30μπιπιο1/1 Oligo dT 2μ1，20〇υ/μ1 MMLV 1·25μ1，模板RNA lyg，加入滅菌水至總體系25以1。42°(：孵育 1 小時(shí)，72 °C 10分鐘，短暫離心。cDNA保存放-20°C冰箱備用。
[0090] 4、qPCR
[0091] 4.1儀器及分析方法
[0092]用ABI 7500型熒光定量PCR儀，采用2-AACT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。
[0093] 4.2反應(yīng)體系：
[0094]用PowerSYBR顧:Green PCR Master Mix(invitrogen，貨號(hào)4367659)進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí) 驗(yàn)操作按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)?95°(：1〇1^11，（95°(：1586(3,6〇1€6〇86(3)\45個(gè)循環(huán)。 RealTime反應(yīng)體系為： 2.X mix .:. ΙΟμΙ 上游引物（lOuM): 0 5μ1
[0095] 下游引物（10uM): 0 5μ1 模板:； 2μ1 加入滅菌蒸餾水至25μ1。
[0096] 其中，引物序列如表1所示：
[0097] 表1引物序列
[0098]
[0099] 5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0100] 與正常垂體組織相比，垂體瘤組織中NFIC基因的mRNA水平顯著增加，根據(jù)qRT-PCR 的相對(duì)定量公式:2-AAct，相對(duì)表達(dá)量約為5.92，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05)，驗(yàn)證結(jié) 果同基因芯片結(jié)果。
[0101] 實(shí)施例3抑制NFIC基因表達(dá)
[0102] l、siRNA 設(shè)計(jì)合成
[0103] 針對(duì) NFIC 的 siRNA 序列：
[0104] siRNAl-NFIC：
[0105] 正義鏈為5'-UCUUCUUCUUCUUCUUCUGCC-3'（SEQ ID N0.7);
[0106] 反義鏈為5'-CAGAAGAAGAAGAAGAAGAAA-3'（SEQ ID N0.8)，
[0107] siRNA2-NFIC：
[0108] 正義鏈為5'-AGAUGAAUAACUUAGGAAGAC-3'（SEQ ID N0.9);
[0109] 反義鏈為5'-CUUCCUAAGUUAUUCAUCUCC-3'（SEQ ID N0.10)，
[0110] siRNA3-NFIC：
[0111] 正義鏈為5'-UAUUGUUUAAAGGUAAUACUU-3'（SEQ ID N0.11);
[0112] 反義鏈為5'-GUAUUACCUUUAAACAAUAUC-3'（SEQ ID N0.12)
[0113] 以上s i RNA序列與陰性對(duì)照s i RNA序列（s i RNA-NC)均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公 司提供：
[0114] 2、垂體瘤細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
[0115] 2.1細(xì)胞培養(yǎng)
[0116] 取垂體瘤組織塊浸入RPMI-1640培養(yǎng)基，DTOS清洗3次后剪碎，室溫下0.25 %胰蛋 白酶消化lh，加入等體積含10%FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化，添加終濃度為0.87% NH4C1于37°C作用5mim;70目細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾除去組織碎片后，1000r/min離心5min，用含10% FCS，2mM谷氨酞胺、100U/mL青霉素和100pg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，在 5 %二氧化碳，37 °C及飽和濕度的二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。3d換液1次，直到細(xì)胞形成單 層，用0.25 %胰蛋白酶消化，重新接種，傳代培養(yǎng)。
[0117] 2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染
[0118] 將2 X 105個(gè)垂體瘤細(xì)胞接種到25cm2細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當(dāng) 細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑2000(購(gòu)自于Invitrogen 公司）的說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組（s i RNA-NC)和實(shí)驗(yàn)組（s i RNA-NFIC)，濃度為 20nM/孔，同時(shí)分別轉(zhuǎn)染。
[0119] 3、利用QPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)s iRNA的干擾效率。
[0120] 3.1提取細(xì)胞總RNA利用常規(guī)方法進(jìn)行操作。
[0121] 3.2逆轉(zhuǎn)錄
[0122] 同實(shí)施例2。
[0123] 3.3 QPCR
[0124] 同實(shí)施例2。
[0125] 3.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0126] 同實(shí)施例2。
[0127] 4、結(jié)果
[0128] 結(jié)果如圖2所示，與siRNAl-NFIC、siRNA3-NFIC相比，siRNA2-NFIC能夠更有效的抑 制NFIC基因的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05)，使用siRNA2-NFIC進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
[0129] 實(shí)施例4 NFIC基因的表達(dá)對(duì)垂體瘤細(xì)胞增殖能力的測(cè)定
[0130] 使用Cell Counting kit-8(cck-8)試劑盒用于檢測(cè)垂體瘤細(xì)胞增殖
[0131] 1、步驟
[0132] 按照前面實(shí)施例3的方法進(jìn)行垂體瘤細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染，細(xì)胞分為二個(gè)實(shí)驗(yàn)組：
[0133]
[0134] 組1:轉(zhuǎn)染siRNA-NC細(xì)胞組；
[0135] 組2:轉(zhuǎn)染siRNA2_NFIC 細(xì)胞組。
[0136] 轉(zhuǎn)染24h后，以2.5 X105/ml密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)計(jì)三復(fù) 孔，每孔加入1〇μ1的CCK-8溶液，37°C，5 %⑶2培養(yǎng)箱中孵育4h;然后按照試劑盒說(shuō)明，選擇 450nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔吸光度值(0D值）。
[0137] 2、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0138] 實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來(lái)完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示， 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P〈0.05時(shí)具 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0139] 3、結(jié)果
[0140] 結(jié)果圖3所示，與轉(zhuǎn)染siRNA-NC組相比，轉(zhuǎn)染siRNA2-NFIC細(xì)胞組細(xì)胞增殖緩慢，差 異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈〇.05)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NFIC基因表達(dá)促進(jìn)了垂體瘤細(xì)胞的增殖。
[0141] 上述實(shí)施例的說(shuō)明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn) 和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 檢測(cè)NFIC基因表達(dá)的產(chǎn)品在制備診斷垂體瘤的工具中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述產(chǎn)品包括:通過(guò)RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、 免疫檢測(cè)、原位雜交、芯片或高通量測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)NFIC基因表達(dá)以診斷垂體瘤的產(chǎn)品;所述 用RT-PCR診斷垂體瘤的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增NFIC基因的引物;所述用實(shí)時(shí)定量PCR 診斷垂體瘤的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增NFIC基因的引物;所述用免疫檢測(cè)診斷垂體瘤的 產(chǎn)品包括:與NFIC蛋白特異性結(jié)合的抗體;所述用原位雜交診斷垂體瘤的產(chǎn)品包括:與NFIC 基因的核酸序列雜交的探針;所述用芯片診斷垂體瘤的產(chǎn)品包括:蛋白芯片和基因芯片；其 中，蛋白芯片包括與NFIC蛋白特異性結(jié)合的抗體，基因芯片包括與NFIC基因的核酸序列雜 交的探針。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷垂體瘤的產(chǎn)品至 少包括的一對(duì)特異擴(kuò)增NFIC基因的引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。4. 一種診斷垂體瘤的工具，其特征在于，所述工具包括檢測(cè)NFIC基因表達(dá)的試劑;所述 試劑包括檢測(cè)NFIC基因 mRNA的引物和/或探針、檢測(cè)NFIC蛋白的抗體。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的工具，其特征在于，所述檢測(cè)NFIC基因 mRNA的引物包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物對(duì)。 6. NFIC基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的抑制劑在制備治療垂體瘤的藥物中的應(yīng)用。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抑制劑包括抑制NFIC基因表達(dá)的試 劑、和/或抑制NFIC基因表達(dá)產(chǎn)物的試劑。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抑制NFIC基因表達(dá)產(chǎn)物的試劑包括抑 制針對(duì)NFI C基因的s iRNA、和/或NFI C蛋白的抗體。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述針對(duì)NFIC基因的siRNA序列如SEQ ID NO .7和SEQ ID NO .8所示。10. -種用于治療垂體瘤的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包括權(quán)利要求6-9中任一項(xiàng)所述的抑制劑。
【文檔編號(hào)】A61K45/00GK105838818SQ201610389535
【公開(kāi)日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年6月2日
【發(fā)明人】趙澎, 張亞卓, 李儲(chǔ)忠, 白吉偉, 桂松柏, 王紅云, 李丹, 何樂(lè), 劉潛
【申請(qǐng)人】北京市神經(jīng)外科研究所