稻米直鏈淀粉含量微控基因isa的分子標(biāo)記及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種稻米直鏈淀粉含量微控基因ISA的分子標(biāo)記ISA?m，以水稻作為物種，所述分子標(biāo)記引物選自下列引物對，其中的核苷酸序列為5′→3′，ISA?m正向：ATAGATGCTAATGTGATGTGGC；反向：TGGTATAGGCACAACCGTAGA。該分子標(biāo)記ISA?m能用于水稻稻米直鏈淀粉含量鑒定和/或其后代輔助選擇育種。
【專利說明】
稻米直鏈淀粉含量微控基因 ISA的分子標(biāo)巧及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)工程，特別設(shè)及與稻米直鏈淀粉含量調(diào)控基因 ISA有關(guān) 的分子標(biāo)記ISA-m及其獲得方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)一直是水稻育種長期追求的目標(biāo)。經(jīng)過長期的努力，尤其是雜交稻技術(shù) 的利用，我國在水稻生產(chǎn)上取得了舉世公認(rèn)的成就。但是由于過去一直把如何解決人們的 溫飽問題放在第一位，故而水稻育種工作的重點大部分集中于水稻高產(chǎn)新品種的培育，從 而導(dǎo)致優(yōu)質(zhì)稻米的育種嚴(yán)重滯后，特別是一些高產(chǎn)的雜交稻品質(zhì)普遍偏差。
[0003] 導(dǎo)致稻米品質(zhì)改良進(jìn)展較慢的另一個主要原因是稻米品質(zhì)遺傳的復(fù)雜性和傳統(tǒng) 育種手段的局限性。稻米的品質(zhì)性狀包括外觀品質(zhì)、加工品質(zhì)、蒸煮品質(zhì)、營養(yǎng)品質(zhì)和食味 品質(zhì)等諸多方面，而稻米蒸煮品質(zhì)是評價稻米品質(zhì)的最重要指標(biāo)。蒸煮品質(zhì)是指稻米在蒸 煮過程中所表現(xiàn)出來的特性，主要由直鏈淀粉含量(Amylose Content ,AC)、膠稠度(Gel Consistency，GC)、糊化溫度（GeIatinization Temperature ,GT)S個理化指標(biāo)來評價，其 中AC是影響稻米品質(zhì)最主要的理化指標(biāo)。育種學(xué)家和遺傳學(xué)家做了大量的工作W探尋稻米 AC的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，然而不同實驗室的結(jié)果有著較大的差別。早期的研究表明稻米AC是由一 個主效基因控制，并受到其他微效WL的調(diào)控[1，2]。隨后的研究發(fā)現(xiàn)Waxy(Wx)對于稻米AC 的多少具有決定性的作用，可能就是控制AC的主效基因[3-5]。除在第6染體上檢測到1個主 效OTL外，不同研究檢測到的微效OTL數(shù)目及位置很不一致。例如，Tan等在第1、2染色體上檢 測到了兩個微效QTLs[6]，化等在第5染色體檢測到了一個微效QTL[6] ,Aluko等在第3和8染 色體上分別檢測到了微效QTLs[7]。黃祖六等研究發(fā)現(xiàn)除了第6染色體的Wx基因位點外，在 第3染色體也檢測到一個控制稻米AC的主效QTL另外5個微效QTLs分別位于第4、4、6、9、11 染色體的不同座位上[引。其他實驗室在第4、6、7染色體也檢測到了控制AC的QTLs[9]。吳長 明等在第6染色體上并沒有發(fā)現(xiàn)與AC有關(guān)的WL位點，只是在第1，7,8,9,12染色體上發(fā)現(xiàn)5 個OTL位點[10]。
[0004] 導(dǎo)致稻米品質(zhì)改良進(jìn)展較慢的另一個主要原因是在傳統(tǒng)育種手段的局限性。傳統(tǒng) 育種方法主要是對有利目標(biāo)性狀進(jìn)行定向選擇和固定，培育出優(yōu)良新品種，運具有很大的 盲目性和不可預(yù)測性[11]。并且，個體選擇的方法是對符合育種目標(biāo)的農(nóng)藝性狀進(jìn)行直接 選擇，即選擇的是個體表現(xiàn)型而不是基因型。由于基因間存在一因多效、多因一效、調(diào)控基 因 W及修飾基因等的作用，個體的表現(xiàn)型與基因型往往存在較大差異，因而通過田間表型 性狀進(jìn)行個體選擇的準(zhǔn)確性較差。分子標(biāo)記輔助選擇(Marker-assisted Select ion ,MAS) 技術(shù)給水稻育種提供了新的途徑，與傳統(tǒng)育種技術(shù)相結(jié)合可大大提高育種效率，縮短育種 周期。MAS的核屯、是把常規(guī)育種中的表型選擇轉(zhuǎn)化為基因型選擇，它直接反映了 DNA的序列 差異，不受基因表達(dá)的影響，結(jié)果可靠性強，并且不受植物的生長發(fā)育階段及環(huán)境條件的影 響[12]。
[0005] 上文中設(shè)及的參考文獻(xiàn)如下：
[0006] I.Bollich C.W.,BD. Inheritance of amylose in two hybrid populations of rice.Cereal Chem.l973,50,631-636(Bollich C.W.，BD.直鏈淀粉含量的在兩個雜交群體 的遺傳，谷物化學(xué).1973.50:631-636);
[0007] 2.McKenzie K.R.,JN.Genetic analysis of amylose content,alkali spreading score ,and grain dimensions in rice . Crop Sci.1983,23,306-311 (McKenzie K.R.，JN.水稻直鏈淀粉含量、堿消值和巧粒形態(tài)的遺傳分析.作物科學(xué).1983， 23:306-311)；
[0008] 3.Sano Y.Differential regulation of waxy gene expression in rice endosperm.Theor .Appl .Genet. 1984,68,467-473(Sano Y.水稻胚乳蠟質(zhì)基因表達(dá)的差異 調(diào)控.理論和應(yīng)用遺傳 .1984，68:467-473);
[0009] 4.Kumar I.K.,G S.Juliano,B 0.Genetic analysis of waxy locus in rice (0;ryzasativaL.).Theo;r.Awl.Genet.l987,73,481-488(KumarI.K.,GS.Juliano,B 0.水稻胚乳蠟質(zhì)基因位點的遺傳分析.理論和應(yīng)用遺傳 .1987，73:481-488);
[0010] 5.Kumar I.K.,GS.Inheritance of amylose content in rice(0ryza sativa L.). Euphy ti Ca 1988，38，261-269.化umar I. K.，GS.水稻直鏈淀粉含量的遺傳.歐洲植物 學(xué).1988,38:261-269)
[0011] 6.Tan Y.F.,Li J.X.,Yu S.B.,et al.The three important traits for cooking 曰nd e曰ting qu曰Iity of rice grains 曰re controlled by 曰 single locus in an elite rice hybrid,化anyou 63.Hieor.Appl.Genet.1999,99,642-648(Tan Y.F.,Li J.X.，化S.B.，等.優(yōu)異雜交稻燦優(yōu)63稻米蒸煮食味品質(zhì)的S個重要指標(biāo)受單位點控制.理 論和應(yīng)用遺傳 .1999，99:642-648);
[0012] 7.Aluko G.,Martinez C.,Tohme J.,et al.QTL mapping of grain quality traits from the interspecific cross Oryza sativa x 0.glabe;r;rima.Theo;r.Appl.Genet.2004,109,630-639(Al址oG.,Ma;rtinezC.,TohmeJ., 等.稻米巧粒性狀在亞洲栽培稻和非洲栽培稻種間雜交群體中的WL定位.理論和應(yīng)用遺 傳 .2004,109:630-639);
[0013] 8.黃祖六，和譚學(xué)林,Tragoonrung S.，et al.稻米直鏈淀粉含量基因座位的分子 標(biāo)記定位.作物學(xué)報2000，26，777-782;
[0014] 9.Lanceras J.C.,Huang Z.L.,Naivikul 0.,et al.Mapping of genes for cooking and eating qualities in Thai jasmine rice(KDML105).DNA Res.2000,7,93-lOULanceras J.C.,Huang Z丄.，Naivikul 0.,等.泰國香米蒸煮食味品質(zhì)的基因作圖 .DNA 研究.2000,7:93-101);
[0015] 10.吳長明，孫傳清，陳亮，等.水稻直鏈淀粉含量與釉梗分化度的WL及其相互關(guān) 系研究.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報2000，5，6-11;
[0016] 11.黎志康.我國水稻分子育種計劃的策略.分子植物育種2005，3，603-608;
[0017] 12.馮建成.分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)在水稻育種上的應(yīng)用.中國農(nóng)學(xué)通報2006，22， 43-47O

【發(fā)明內(nèi)容】

[0018] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種與稻米淀粉合成基因 ISA有關(guān)的分子標(biāo)記及 其用途，本發(fā)明所得的分子標(biāo)記ISA-m為稻米直鏈淀粉含量微控基因 ISA的分子標(biāo)記，能用 于稻米直鏈淀粉含量鑒定及相應(yīng)的輔助選擇育種。
[0019] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種稻米直鏈淀粉含量微控基因 ISA的分子 標(biāo)記ISA-m，W水稻作為物種，該分子標(biāo)記引物選自下列引物對，其中的核巧酸序列為5/^ 3'，
[0020] I SA-m正向：ATAGATGCTAATGTGATGTGGC
[0021] 反向：TGGTATAGGCACAACCGTAGA。
[0022] 本發(fā)明還提供了上述分子標(biāo)記ISA-m的開發(fā)方法，例如包括W下步驟：
[0023] 1)、W梗稻品種日本晴作為低直鏈淀粉含量基因供體親本與作為高直鏈淀粉的特 青進(jìn)行雜交、回交和自交，從而獲得作為后代的稻米低直鏈淀粉含量的單株；
[0024] 2)、用CTAB(十六烷基S乙基漠化錠，Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide) 法提取水稻親本幼苗及后代幼苗基因組DM;
[00巧]3)、采用Indel (插入/缺失片段，insertion/deletions)分子標(biāo)記方法進(jìn)行稻米低 直鏈淀粉含量基因標(biāo)記的篩選；
[0026] 4)、開發(fā)出一個Indel分子標(biāo)記ISA-m。
[0027] 與稻米低直鏈淀粉含量有關(guān)的分子標(biāo)記ISA-m，具體是用下述方法得到的：
[00%] 1)、根據(jù)基因 ISA的核巧酸序列，設(shè)計、發(fā)展Indel分子標(biāo)記，用于檢測低直鏈淀粉 含量日本晴和高直鏈淀粉含量特青的多態(tài)性;通過測序W進(jìn)一步確定引物ISA-m區(qū)間的序 列在低直鏈淀粉含量的日本晴和高直鏈淀粉含量的特青之間的差異;通過雜交、回交和自 交結(jié)合標(biāo)記輔助選擇，獲得特青背景的低直鏈淀粉含量的水稻新種質(zhì)；
[0029] 2)、用CTAB法提取水稻親本幼苗及后代幼苗基因組DNA;
[0030] 3)、采用Indel分子標(biāo)記方法進(jìn)行稻米低直鏈淀粉含量的基因標(biāo)記篩選低直鏈淀 粉含量的水稻新種質(zhì)；
[0031] 4)、鑒定出一個Indel分子標(biāo)記ISA-m，經(jīng)多態(tài)性檢測，發(fā)現(xiàn)其與稻米直鏈淀粉含量 相關(guān)聯(lián)。
[0032] 本發(fā)明還同時提供了上述分子標(biāo)記ISA-m的用途，用于水稻稻米直鏈淀粉含量鑒 定和/或其后代輔助選擇育種。
[0033] 作為本發(fā)明的分子標(biāo)記ISA-m的用途的改進(jìn)：當(dāng)篩選日本晴和釉稻(包括特青、桂 朝2號）的后代時，選擇后代中帶型與日本晴帶型一致的單株用于后續(xù)的育種改良。
[0034] 引物ISA-m PCR擴增所得的分子標(biāo)記ISA-m在日本晴中的序列為：
[0035] ATAGATGCTAATGTGATGTGGCAGCACCGACGTCACACCTGTGACATCTGGCCATATGTCTACAGCTAATGCTGTGT TTTGTTCAATTTTTATTMAGGCAAATAAATATCTATATCTAC GGTTGTGCCT ATACCA。
[0036] 引物ISA-m PCR擴增所得的分子標(biāo)記ISA-m在特青中的序列為：
[0037] ATAGATGCTAATGTGATGTGGCAGACACCTGTGACATCTGGCCATATGTCTACAGCTAATGCTGTGTTTTGTTCAAT TTTTATTAAAGGCAAATAAATATCTATATCTACGGTTGTGCCT ATACCA。
[0038] 采用Indel分子標(biāo)記ISA-m進(jìn)行稻米直鏈淀粉含量篩選的方法具體是：
[0039] (I)、Indel標(biāo)記在高、低稻米直鏈淀粉含量品種日本晴和特青間的DNA多態(tài)性分 析：
[0040] 根據(jù)基因 ISA的核巧酸序列，設(shè)計、發(fā)展Indel分子標(biāo)記ISA-m，用于檢測低直鏈淀 粉含量的日本晴和高直鏈淀粉含量的特青之間的多態(tài)性。引物委托上海申能博彩公司合 成，在PTC-225PCR儀上進(jìn)行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系為：20ng/ul水稻基因組DNA Iul，10 X PCR Buffer 2.Oul,25mM MgCb 2.Oul,2mM dNTP 2.Oul ,IOuM引物2.Oul,抓All Taq DNA聚合 酶0.化1，d地2〇 10.8ul，總體系20ul。反應(yīng)程序:95°C變性5分鐘;94°C變性1分鐘，55°C退火 1分鐘，72°C延伸1分鐘，40個循環(huán)；72°C補齊10分鐘；產(chǎn)物檢測：在含有0.5%ug/ul EB的 4.0%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察并照相記錄結(jié)果。
[0041 ] (2)、Indel標(biāo)記ISA-m的序列區(qū)間在低、高稻米直鏈淀粉含量品種日本晴和特青間 的基因組序列差異：
[0042] 根據(jù)獲得的Indel分子標(biāo)記ISA-m，用于PCR擴增低直鏈淀粉含量品種日本晴和高 直鏈淀粉含量品種特青的基因組序列，PCR擴增產(chǎn)物委托上海英驗生物技術(shù)有限公司進(jìn)行 測序分析。PCR擴增參照上述（1)進(jìn)行，PCR產(chǎn)物的回收選用北京百泰克生物技術(shù)有限公司開 發(fā)的PCR產(chǎn)物回收試劑盒(離屯、柱型，目錄號:DP1403)。
[0043] (3)、利用Indel標(biāo)記ISA-m開展低直鏈淀粉含量的輔助選擇育種
[0044] 低直鏈淀粉含量的基因供體親本日本晴，與高直鏈淀粉含量的釉稻品種特青進(jìn)行 雜交，通過回交、自交結(jié)合標(biāo)記輔助選擇，將日本晴的低直鏈淀粉含量基因 ISA導(dǎo)入到高直 鏈淀粉含量的特青中，選擇分離群體中帶型與日本晴帶型一致的單株用于育種改良，獲得 了若干份特青背景的帶日本晴ISA基因的材料;收獲運些植株上所結(jié)的種子，檢測其直鏈淀 粉含量，發(fā)現(xiàn)其直鏈淀粉含量顯著降低。
[0045] 直鏈淀粉含量高是稻米品質(zhì)低劣的最主要因素。本發(fā)明采用分子生物學(xué)方法W低 直鏈淀粉含量的日本晴為材料，發(fā)展和篩選新的、而且穩(wěn)定的能降低稻米直鏈淀粉含量的 分子標(biāo)記及其方法，用于優(yōu)質(zhì)稻米的輔助選擇育種；由于研究所用的材料能有效降低一般 稻米的直鏈淀粉含量，其對我國稻米品質(zhì)的改善具有普遍性。
[0046] 本發(fā)明創(chuàng)造了稻米淀粉合成相關(guān)基因 ISA的Indel標(biāo)記ISA-m。利用運種方法，不僅 克服了常規(guī)育種方法所需時間周期長等缺點，可W有目標(biāo)地將日本晴的低直鏈淀粉含量基 因 ISA在實驗室內(nèi)選擇獲得并有目的地進(jìn)行多個優(yōu)質(zhì)的聚合，從而培育出具有優(yōu)質(zhì)的水稻 新品種。在本發(fā)明中，當(dāng)所得植株經(jīng)檢測出現(xiàn)日本晴的條帶時，我們判定其屬于低直鏈淀粉 含量的水稻；當(dāng)所得植株經(jīng)檢測出現(xiàn)特青的條帶時，我們判定其屬于高直鏈淀粉含量的水 稻；當(dāng)所得植株經(jīng)檢測同時出現(xiàn)特青+日本晴的條帶時，我們判定其可能屬于高直鏈淀粉含 量的水稻。
[0047] 本發(fā)明可適用大部分的釉稻（如特青、桂朝2號）和梗稻(如日本晴）之間的標(biāo)記選 擇。
[004引因此，本發(fā)明結(jié)果在水稻優(yōu)質(zhì)育種實踐中具有重要意義。其優(yōu)點具體歸納如下：
[0049] (1)本發(fā)明的能調(diào)控稻米直鏈淀粉含量的分子標(biāo)記，是在通過低直鏈淀粉含量的 梗稻日本晴與高直鏈淀粉含量的釉稻特青的雜交、回交和自交中篩選獲得的，能顯著降低 稻米直鏈淀粉含量，而且穩(wěn)定存在，可用于優(yōu)質(zhì)稻米的輔助選擇育種。
[0050] (2)本發(fā)明依據(jù)的是稻米淀粉合成基因 ISA的核巧酸序列發(fā)展而獲得的Indel分子 標(biāo)記I SA-m，本發(fā)明的I SA-m與GBSSII -m、SSI Vb-m在不同染色體上，I SA-m與AGPS2a-m雖然均 位于第8染色體，但明顯是屬于不同的位置。且本發(fā)明標(biāo)記所篩選的效果更佳，并極大提高 了輔助選擇的效率，即，本發(fā)明的標(biāo)記能使稻米低直鏈淀粉含量的輔助選擇育種的效果更 佳。
【附圖說明】
[0051] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0052] 圖1是Indel標(biāo)記ISA-m在低直鏈淀粉含量的梗稻日本晴、高直鏈淀粉含量的釉稻 特青、Fl的電泳譜帶圖；
[0053] 圖2是引物ISA-m的PCR擴增產(chǎn)物在日本晴和特青間的序列差異；
[0054] 圖3是Indel標(biāo)記ISA-m鑒定獲得的9份低直鏈淀粉含量的日本晴和特青的后代的 電泳譜帶圖；
[0055] 圖4是標(biāo)記ISA-m輔助選育的9份材料的直鏈淀粉含量；
[0056] 對上述圖1、圖3~4中符號分別作如下說明：
[0057] 1代表:低直鏈淀粉含量的梗稻日本晴；
[0058] 2代表:高直鏈淀粉含量的釉稻特青；
[0059] 3代表：日本晴/特青的Fl植株；
[0060] 4，5，6，7，8，9，10，11，12均代表：日本晴和特青的后代，經(jīng)Inde 1標(biāo)記I SA-m的篩選 后獲得。
【具體實施方式】
[0061 ]實施例1、用Indel標(biāo)記ISA-m鑒定低直鏈淀粉含量的梗稻日本晴和高直鏈淀粉含 量的釉稻特青的多態(tài)性
[0062] 具體做法是:從中國水稻研究所種質(zhì)資源庫中選取水稻材料日本晴和特青，用日 本晴和特青雜交獲得其Fl，利用引物ISA-m鑒定其多態(tài)性（圖1)。
[0063] -、提取 DNA
[0064] 1 )、配制DNA提取緩沖液：
[00化]按順序依次加1體積的DNA提取溶液(0.35M sorbitol;0.1M化13,9冊.2;0.0051 EDTA;其余為水），1體積的核裂解液（0.2M Tris，pH7.5;0.05M EDTA;2M 化 C1;0.055M CTAB;其余為水)和0.4體積的5% (質(zhì)量濃度)sarkosyI溶液（即十二酷-N-甲基甘氨酸鋼的 水溶液）；最后加入亞硫酸氨鋼，配制成DNA提取緩沖液;亞硫酸氨鋼在DNA提取緩沖液中的 終濃度為0.02M。
[0066] 上述DNA提取溶液的制備方法為：在0.35mol的sorbitol (山梨糖醇）、0.1mol的 Tris(S徑甲基氨基甲燒，P冊.2)、0.OOSmol的邸TA(乙二胺四乙酸）中加水定容至1L。
[0067] 上述核裂解液的制備方法為：在0.2mo 1的Tr i S (S徑甲基氨基甲燒，pH7.5)、 0.05mol的抓TA(乙二胺四乙酸）、2mol的化CK氯化鋼）、0.055mol的CTAB(十六烷基S甲基 漠化錠)加水定容至1L。
[0068] 2)、對上述日本晴、特青、Fl的水稻葉片分別進(jìn)行如下處理：
[0069] ①、稱取0.1 g的水稻葉片用液氮研磨成粉狀，然后加入70化1的上述步驟1)配制的 DNA提取緩沖液，65°C水浴40分鐘。再加70化I的氯仿：異戊醇（24:1的體積比），并混勻。10， 00化pm離屯、5分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離屯、管中。
[0070] ②、在上述步驟①離屯、后所得的上清液中加2/3~1倍體積預(yù)冷(至4°C)的異丙醇， 輕輕混勻至DNA沉淀。13，00化pm離屯、8分鐘，倒出上清液。
[0071] ③、再用70% (體積濃度)的已醇20化1洗涂上述步驟②所得的DNA沉淀物。
[0072] ④、將上述洗涂后的DNA驚干并溶于10化1 TE緩沖液或純水中。
[0073] ⑤、紫外分光光度法檢測上述步驟④所得的DNA樣品的濃度，0.7%的瓊脂糖凝膠 電泳檢測DNA的完整性。完整合適的DNA用于PCR擴增，不完整的DNA則重新提取，直至獲得完 整的DNA。
[0074] 二、PCR 擴增 [007引1)、反應(yīng)體系：
[0076] 水稻基因組DNA 20ng/ul Iul ,IOXPCR Buffer 2.Oul,25mM MgCb 2.Oul,2mM dNTP 2.0ul，10uM引物各l.Oul，抓/ul Taq DNA聚合酶0.化l，d地2〇 lO.Sul，總體系20ul。
[0077] 所述引物為：ISA-m正向：ATAGATGCTAATGTGATGTGGC
[007引 反向：TGGTATAGGCACAACCGTAGA;
[0079] 2)、反應(yīng)程序：
[0080] 95 °C變性5分鐘;94 °C變性1分鐘，55 °C退火1分鐘，72 °C延伸1分鐘，40個循環(huán);72 °C 補齊10分鐘。
[00川 S、電泳檢測
[0082] 取擴增產(chǎn)物20ul，用4.0%的瓊脂糖凝膠(含有0.5%ug/ul EB)電泳，紫外燈下觀 察并照相記錄結(jié)果。如圖1所示。
[0083] 在圖1中，日本晴為13化P的條帶，特青為12化P的條帶，"Fr為13化P+12化P的條 帶。
[0084] 根據(jù)圖1，我們能得出下述結(jié)論：Indel分子標(biāo)記ISA-m能夠檢測特青和日本晴之間 的多態(tài)性，且日本晴的PCR擴增產(chǎn)物片段要大于特青，由此表明ISA-m能用于特青和日本晴 之間的分子檢測及其后代的標(biāo)記輔助選擇。
[00化]實施例2、用Indel分子標(biāo)記ISA-m鑒定低直鏈淀粉含量的梗稻日本晴和高直鏈淀 粉含量的釉稻特青的序列差異
[00化]具體做法是：應(yīng)用Indel分子標(biāo)記ISA-m對日本晴和特青的基因組DNA進(jìn)行PCR擴 增，擴增產(chǎn)物委托上海英驗生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，比較其序列的差異(圖2)。
[0087] -、提取 DNA
[0088] 1 )、配制DNA提取緩沖液：
[0089] 同實施例1。
[0090] 2)、對上述日本晴和特青的水稻葉片分別進(jìn)行如下處理：
[0091] 同實施例1。
[0092] 3)PCR 擴增
[0093] 同實施例1。
[0094] 4)PCR產(chǎn)物的回收
[00M] PCR產(chǎn)物的回收選用北京百泰克生物技術(shù)有限公司開發(fā)的PCR產(chǎn)物回收試劑盒(離 屯、柱型，目錄號:DP1403)，參照產(chǎn)品說明要求進(jìn)行，回收的PCR產(chǎn)物委托上海英驗生物技術(shù) 有限公司進(jìn)行測序。
[0096] 根據(jù)圖2,我們能得出W下結(jié)論：日本晴和特青的ISA-m擴增產(chǎn)物存在IObp的堿基 差異(如圖2中的下劃線所示），運是我們能夠使用Indel分子標(biāo)記ISA-m檢測出其多態(tài)性的 原因所在，也是我們能用于其后代標(biāo)記輔助選擇的遺傳基礎(chǔ)。
[0097] 實施例3、利用Indel標(biāo)記ISA-m開展低直鏈淀粉含量的輔助選擇育種
[0098] 具體做法是:低直鏈淀粉含量的基因供體親本日本晴，與高直鏈淀粉含量的釉稻 品種特青進(jìn)行雜交、回交和自交，對所得后代結(jié)合分子標(biāo)記ISA-m的輔助選擇，選擇分離群 體中帶型與日本晴帶型一致的單株用于育種改良。
[0099] -、提取 DNA
[0100] 1)、配制DNA提取緩沖液：
[0101] 同實施例1。
[0102] 2)、對上述日本晴、特青、所得后代的水稻葉片分別進(jìn)行如下處理：
[0103] 同實施例1。
[0104] 二、Indel 標(biāo)記檢測
[010 引 1)、PCR 擴增
[0106] 同實施例1。
[0107] 2)、電泳檢測 [010引同實施例1。
[0109] SJndel分子標(biāo)記ISA-m開展低直鏈淀粉含量的輔助選擇育種
[0110] 低直鏈淀粉含量的基因供體梗稻品種日本晴與高直鏈淀粉含量的普通釉稻品種 特青進(jìn)行雜交、回交和自交，結(jié)合分子標(biāo)記ISA-m的輔助選擇，選擇分離群體中帶型與日本 晴帶型一致的單株進(jìn)一步用于育種改良（圖3)，淘汰帶型與高直鏈淀粉含量特青的帶型一 致和雜合帶型（同時具有日本晴和特青帶型）的個體，育種材料的稻米直鏈淀粉含量采用國 家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T15683-2008)進(jìn)行檢測。分析表明，所選擇的帶日本晴帶型的9個單株均比輪回 親本特青明顯降低（圖4)。該實驗結(jié)果表明= Indel標(biāo)記ISA-m可W用于稻米直鏈淀粉含量的 輔助選擇育種。
[01川備注說明：
[0112] 圖3和圖4中的"4~12"均為日本晴和特青依次進(jìn)行雜交、回交和自交獲得的，且是 選擇了 "帶型與日本晴帶型一致"的單株。
[0113] 實驗1、利用Indel標(biāo)記ISA-m判別稻米直鏈淀粉含量
[0114] 具體做法是:將實施例3的步驟=中被淘汰的帶型與高直鏈淀粉含量特青的帶型 一致和雜合帶型（同時具有日本晴和特青帶型）的個體繼續(xù)進(jìn)行種植，通過對其后代稻米巧 粒直鏈淀粉含量的測定，進(jìn)一步分析分子標(biāo)記ISA-m輔助選擇的可靠性。
[011引一、提取DNA
[0116] 1)、配審化NA提取緩沖液：
[0117] 同實施例1。
[011引 2)、對上述水稻葉片分別進(jìn)行如下處理：
[0119]同實施例1。
[0120] 二、Inde I 標(biāo)記檢測
[0121] 1)、PCR 擴增
[0122] 同實施例1。
[0123] 2)、電泳檢測
[0124] 同實施例1。
[01巧]S、Indel標(biāo)記ISA-m判別稻米直鏈淀粉含量
[0126] 隨機選擇了在實施例3的步驟=中被淘汰4個帶型與特青一致的單株繼續(xù)種植，經(jīng) Indel分子標(biāo)記ISA-m檢測，其后代均表現(xiàn)與特青一致的帶型，分別收獲運些單株巧粒并測 定其直鏈淀粉含量。另外，隨機選擇其中1個雜合帶型（同時具有日本晴和特青帶型）的個體 用于繼續(xù)種植，在其后代中隨機選取12個單株，Indel分子標(biāo)記ISA-m檢測表明，該12個單株 中有3個單株表現(xiàn)特青帶型，6個單株表現(xiàn)雜合帶型，3個表現(xiàn)日本晴帶型，符合1: 2:1的分離 關(guān)系;待植株成熟后，分別收獲運些單株并測定其巧粒的直鏈淀粉含量。表1是運16個單株 (株系）的稻米巧粒的直鏈淀粉含量，4個與特青帶型一致的單株均表現(xiàn)與特青類似的高直 鏈淀粉含量;而在帶型雜合的12個后代單株中，有9個單株表現(xiàn)類似與特青的高直鏈淀粉含 量(其中，3個單株的帶型表現(xiàn)特青帶型，6個單株的帶型表現(xiàn)雜合帶型）；3個呈日本晴帶型 的單株，其直鏈淀粉含量顯著低于特青。該實驗結(jié)果表明= Indel分子標(biāo)記ISA-m可W用于判 別稻米直鏈淀粉含量。
[0127] 表1.稻米直鏈淀粉含量及其對應(yīng)的基因型
[012 引
[0129] 注:括號中字母代表該單株的基因型，T為特青帶型，H為雜合帶型，N為日本晴帶型
[0130] 對比例1、與ISA-m正、反向引物同源性高的標(biāo)記I SA-m-1和I SA-m-2 (如表2，其中的 核巧酸序列為5/^3/);按照本發(fā)明的上述方法進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)運兩個標(biāo)記擴增效果非常不 好，沒有條帶出現(xiàn)或者非特性條帶很多，不能用于判別稻米直鏈淀粉含量，即，不能成為稻 米直鏈淀粉含量微控基因分子標(biāo)記。
[0131] 表2
[0132]
[0133」 對化例2、將觀巧3所還的4種分于你記人0?82日-111、881￥6-111、068811-111、18人-111(本巧 明）按照實施例3所述方法進(jìn)行實驗，此時，低直鏈淀粉含量的基因供體親本仍為日本晴，高 直鏈淀粉含量的釉稻品種由特青改成了桂朝2號。
[0134]表3 「rnoc I
[0136] 選擇分離群體中帶型與日本晴帶型一致的單株，育種材料的稻米直鏈淀粉含量采 用國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 15683-2008)進(jìn)行檢測。
[0137] 所選擇的帶日本晴帶型單株中的直鏈淀粉含量與輪回親本桂朝2號相比的結(jié)果如 下表4:
[013引 表4
[0139]
[0140] 本實驗進(jìn)行了若干次的重復(fù)，結(jié)果均基本如上表4所述。
[0141] 最后，還需要注意的是，W上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā) 明不限于W上實施例，還可W有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容 直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項】
1. 稻米直鏈淀粉含量微控基因 ISA的分子標(biāo)記ISA-m，以水稻作為物種，其特征是:所述 分子標(biāo)記引物選自下列引物對，其中的核苷酸序列為5' ， ISA-m正向：ATAGATGCTAATGTGATGTGGC 反向：TGGTATAGGCACAACCGTAGA。2. 如權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記ISA-m的用途，其特征是：用于水稻稻米直鏈淀粉含量 鑒定和/或其后代輔助選擇育種。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的分子標(biāo)記ISA-m的用途，其特征是：當(dāng)篩選日本晴和秈稻的后 代時，選擇后代中帶型與日本晴帶型一致的單株用于育種。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的分子標(biāo)記I SA-m的用途，其特征是:所述秈稻為特青、桂朝2號。
【文檔編號】C12Q1/68GK105838819SQ201610389803
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年6月2日
【發(fā)明人】曾大力, 錢前, 李家洋, 朱麗, 代麗萍, 胡江, 張光恒, 郭龍彪, 董國軍, 高振宇, 陳 光
【申請人】中國水稻研究所