專利名稱：C2orf40基因在制備預(yù)防、診斷或治療乳腺腫瘤藥物中的應(yīng)用、表達(dá)載體和診斷藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種人類乳腺癌相關(guān)的抑癌基因C2orf40 (chromosome 2 open reading fame 40)在乳腺癌預(yù)防、診斷及治療藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乳腺癌是當(dāng)今世界女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，目前我國(guó)乳腺癌已成為第I位嚴(yán)重危害女性健康的惡性腫瘤，盡管乳腺癌的診斷治療技術(shù)日益提高，但其病死率并未下降，防治形勢(shì)十分嚴(yán)峻。乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展受多種因素的影響，其中某些抑癌基因起著關(guān)鍵作用，對(duì)這些基因的生物學(xué)功能的研究和探討有助于為乳腺癌的基因治療、愈后及抗癌藥物的研發(fā)提供新的方向。抑癌基因(antioncogene)又稱腫瘤抑制基因(tumorsuppressor gene),是一種抑制腫瘤過度生長(zhǎng)，而遏制腫瘤形成的基因，在生物體內(nèi)與癌基因功能相抵抗，共同保持生物體內(nèi)正負(fù)信號(hào)相互作用的相對(duì)穩(wěn)定。從腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程來看由隨機(jī)突變或缺失導(dǎo)致的抑癌基因失活要比誘發(fā)癌基因激活的概率大，因此從理論上講致癌變過程中抑癌基因的作用更突出。除了腫瘤抑制基因的突變失活和丟失外，基因的沉默在各種的癌癥當(dāng)中具有重要作用。C2orf40最初是通過對(duì)比正常人的食管上皮與食管鱗狀細(xì)胞癌不同的基因表達(dá)而發(fā)現(xiàn)的，ESCC細(xì)胞取自食管癌高發(fā)地區(qū)-中國(guó)北部林縣。C2orf40 (chromosome 2 openreadingframe 40)(又稱 ECRG4, esophageal cancer related gene 4)是位于人 2 號(hào)染色體2ql4. 1-14. 3的一種抑癌基因，含有4個(gè)外顯子，由772bp組成，它的開放閱讀框444bp能夠編碼具有148個(gè)氨基酸分子量為17kDa的多肽。迄今為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)該抑癌基因的研究較少，有限的文獻(xiàn)報(bào)道顯示C2orf40基因啟動(dòng)子中CpG島的超甲基化，可抑制該基因的表達(dá)，可能與食管癌、結(jié)直腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生和愈后有關(guān)。但是目前，尚無對(duì)其在乳腺腫瘤中的功能及其分子機(jī)制的研究報(bào)道。C2orf40在乳腺癌中的作用機(jī)制尚不完全清楚，其功能和表達(dá)變化的臨床意義尚未有報(bào)道。因此，分析C2orf40與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，探索針對(duì)C2orf40途徑的乳腺癌診斷和治療策略至關(guān)重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的抑癌基因在乳腺癌預(yù)后預(yù)測(cè)診斷及制備預(yù)防、治療乳腺腫瘤藥物中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，C2orf40 (如SEQ ID NO. I所示)基因在乳腺癌腫瘤組織中的特異性低表達(dá)與乳腺癌的分子類型相關(guān)，并且在特定分子類型的乳腺癌中具有延長(zhǎng)患者生存時(shí)間的作用，因此，在篩選C2orf40基因低表達(dá)的腫瘤基礎(chǔ)上，特異性恢復(fù)該抑癌基因在腫瘤組織細(xì)胞中的表達(dá)，有望成為乳腺癌靶向治療的一種新方法和手段。C2orf40表達(dá)作為乳腺癌診斷的生物靶標(biāo)。C2orf40在制備預(yù)防或治療乳腺腫瘤藥物中的應(yīng)用。所述乳腺腫瘤診斷、預(yù)防或治療藥物以C2orf40基因?yàn)榘悬c(diǎn)。所述藥物為藥劑學(xué)上可接受的任何一種劑型，包括粉劑、注射劑、膠囊、片劑或口服液。所述乳腺癌腫瘤包括但不限于乳腺癌?！N預(yù)防或治療乳腺腫瘤的表達(dá)載體,它是由C2orf40基因和pBabe-puro載體構(gòu)
建而成。上述預(yù)防或治療乳腺腫瘤藥物的表達(dá)載體的制備方法，步驟過下(I)獲得cDNA :全長(zhǎng)C2orf40基因的開放閱讀框采用RT-PCR法從正常乳腺組織的總RNA中獲得，然后進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增所用引物為C2orf40-cF (SEQ ID NO. 2) agcgggatagcccgcggccgcgccC2orf40~cR (SEQ ID NO. 3) tagaaataaagcattttgttaa(2)將上述cDNA連接到TOPO PCR Blunt載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，在含青霉素培養(yǎng)LB板中培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆培養(yǎng)，經(jīng)測(cè)序選擇正確克隆；(3)C2orf40表達(dá)載體的構(gòu)建抽提正確克隆的質(zhì)粒，用EcoR I酶切后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后回收目的片段，連入線性化的PCDNA3. I載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，在含青霉素培養(yǎng)LB板中培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆培養(yǎng)，經(jīng)酶切和測(cè)序雙鑒定后，保存正確克隆，抽提質(zhì)粒，即得。一種乳腺腫瘤診斷藥物，它至少包括一對(duì)特異性擴(kuò)增C2orf40基因的引物，所述的引物由上游引物和下游引物組成，其中，所述的上游引物具有如ggtaccagcagtttctctacatg(SEQ IDN0. 4)的核苷酸序列，下游引物具有如 cagcgtgtggaagtcatggttagt (SEQ ID NO. 5)的核苷酸序列。診斷方法是所述的乳腺腫瘤診斷藥物以C2orf40基因?yàn)榛A(chǔ)的檢測(cè)手段，檢測(cè)手段為RT-PCR或?qū)崟r(shí)定量PCR。用GAPDH作為對(duì)照，PCR使用美國(guó)Applied biosystem公司的定量RT-PCR試劑盒。反應(yīng)總體積為20微升采用I微升cDNA模板，加入2 XPCR buffer 10微升，高純?nèi)ルx子水9微升。反應(yīng)參數(shù)如下95°C預(yù)熱5分鐘；35個(gè)循環(huán)設(shè)置如下，95°C，30秒；58°C，30秒；72°C 45秒；最后進(jìn)行表達(dá)分析。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明提供了一種新抑癌基因在制備乳腺癌診斷、預(yù)防或治療藥物中的應(yīng)用，以C2orf40基因?yàn)榛A(chǔ)的診斷藥物可方便快捷的在基因水平上實(shí)現(xiàn)腫瘤的檢測(cè)，同時(shí)，以C2orf40基因?yàn)榘悬c(diǎn)的藥物有望成為腫瘤靶向治療的一種新手段。


圖la GSE3744數(shù)據(jù)庫(kù)分析正常乳腺組織和乳腺癌組織中C2orf40mRNA表達(dá)水平；圖Ib GSE10780數(shù)據(jù)庫(kù)分析正常乳腺組織和乳腺癌組織中C2orf40 mRNA表達(dá)水平；圖Ic GSE14548數(shù)據(jù)庫(kù)分析正常乳腺組織和乳腺癌組織中C2orf40 mRNA表達(dá)水平；圖2a. NKI數(shù)據(jù)庫(kù)分析C2orf40 mRNA表達(dá)水平與乳腺癌患者無病生存率的相關(guān)性；圖2b. GSE1456數(shù)據(jù)庫(kù)分析C2orf40 mRNA表達(dá)水平與患者無病生存率的相關(guān)性；圖2c. GSE3494數(shù)據(jù)庫(kù)分析C2orf40 mRNA表達(dá)水平與患者無病生存率的相關(guān)性；圖2d. GSE6532數(shù)據(jù)庫(kù)分析C2orf40 mRNA表達(dá)水平與患者無病生存率的相關(guān)性； 圖2e. NKI數(shù)據(jù)庫(kù)分析C2orf40 mRNA表達(dá)水平與患者無轉(zhuǎn)移生存率的相關(guān)性；圖2f. GSE6532數(shù)據(jù)庫(kù)分析C2orf40 mRNA表達(dá)水平與患者無轉(zhuǎn)移生存率的相關(guān)性；圖3. Westren blotting和RT-PCR法檢測(cè)C2orf40基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染前后的基因及蛋白表達(dá)情況；其中3a C2orf40 高表達(dá)的 BT549 和 MDA-MB-231 細(xì)胞3b C2orf40 基因沉默的 MDA-MB-468 細(xì)胞圖4.克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)C2orf40對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響；其中4a C2orf40 高表達(dá)的 MDA-MB-231 細(xì)胞4b C2orf40 高表達(dá)的 BT549 細(xì)胞4c C2orf40 基因沉默的 MDA-MB-468 細(xì)胞圖5. MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)C2orf40對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響；其中5a C2orf40 高表達(dá)的 MDA-MB-231 細(xì)胞5b C2orf40 高表達(dá)的 BT549 細(xì)胞5c C2orf40 基因沉默的 MDA-MB-468 細(xì)胞圖6.劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)C2orf40對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響；其中6a C2orf40 高表達(dá)的 MDA-MB-231 細(xì)胞6b C2orf40 高表達(dá)的 BT549 細(xì)胞6c C2orf40 基因沉默的 MDA-MB-468 細(xì)胞圖7. Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)C2orf40對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響；其中7a C2orf40 高表達(dá)的 MDA-MB-231 細(xì)胞7b C2orf40 高表達(dá)的 BT549 細(xì)胞7c C2orf40 基因沉默的 MDA-MB-468 細(xì)胞
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例和說明書附圖，更具體地說明本發(fā)明的內(nèi)容。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的實(shí)施并不局限于下面的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護(hù)范圍。在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設(shè)備和原料等均可從市場(chǎng)購(gòu)得或是本行業(yè)常用的。若無特別指明，實(shí)施例采用的方法為本領(lǐng)域通用技術(shù)。本發(fā)明所述的抑癌基因C2orf40基因在開發(fā)乳腺癌診斷、預(yù)防和治療手段中的應(yīng)用，可參考常規(guī)的藥物配置方法和試劑開發(fā)。藥物劑型和生物劑型為醫(yī)學(xué)上認(rèn)可的任何一種劑型，例如為粉劑、注射劑、膠囊、片劑或口服液。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，是按照常規(guī)條件，例如Sambrook等所著的分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中所述的條件，或按照制造廠商說明書建議的條件。試驗(yàn)試劑DNA聚合酶，Trizol試劑，小牛血清，磷酸鹽緩沖液，RPMI-1640培養(yǎng)基，青霉素-鏈霉素和胰蛋白酶購(gòu)于Invitrogen(USA)。Taq聚合酶購(gòu)于Promega。乳腺癌細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)的ATCC。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用High Capacity cDNA Reverse Transcription試劑盒(美國(guó) Applied Biosystem 公司)。實(shí)施例I C2orf40基因在正常乳腺組織和乳腺癌組織中的薈萃分析I.材料和方法選取7個(gè)包含正常樣本和乳腺癌樣本的臨床資料及基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)，在這些數(shù)據(jù)庫(kù)中的樣本均已通過Affymetrix microarray assay (either HG-U133A or HG U133Plus 2. 0)or Agilent oligo microarray檢測(cè)分析。通過調(diào)取GEO網(wǎng)站中的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。2.統(tǒng)計(jì)分析通過卡方檢驗(yàn)分析正常和乳腺癌之間在C2orf40基因mRNA表達(dá)水平的差異。采用Kaplan-Meier法分析無病和總生存率之間C2orf40的差異。所有分析均采用SPSS11. 5. O, p〈0. 05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.結(jié)果我們首先分析GSE3744數(shù)據(jù)庫(kù)中C2orf40基因在正常和乳腺癌中的表達(dá)。C2orf40在乳腺癌中的表達(dá)水平比在正常的乳腺表達(dá)水平顯著降低(圖la)。在另外的數(shù)據(jù)庫(kù)中，也發(fā)現(xiàn)乳腺癌C2orf40表達(dá)水平顯著低于在正常乳腺組織(圖lb，C)。接下來，我們研究了從4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中乳腺癌患者的無病生存與C2orf40基因表達(dá)水平的關(guān)系。我們首先根據(jù)C2orf40在每個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá)將患者分為不同組別(“C2orf40高”，“中級(jí)C2Orf40”，“C2Orf40低”)。然后統(tǒng)計(jì)匯集所有數(shù)據(jù)庫(kù)中的患者。所有患者的無病生存率(DFS)的曲線如圖2a，b，c，d所示在4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中低表達(dá)C2orf40的患者其無病生存率顯著縮短。此外，我們還進(jìn)一步分析了另外2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中C2orf40的表達(dá)與乳腺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，結(jié)果顯示，低表達(dá)C2orf40的患者其轉(zhuǎn)移的幾率顯著增加(圖2e，f )。4.結(jié)論我們的薈萃分析表明，C2orf40作為一個(gè)抑癌基因其mRNA表達(dá)水平可能是乳腺癌患病的標(biāo)志之一，可以作為乳腺癌診斷、預(yù)防和治療的一個(gè)靶標(biāo)。實(shí)施例2 C2orf40cDNA的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建I.克隆專用cDNA合成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT)使用Fermentas 公司的First Synthesis System for RT-PCR試劑盒，每個(gè)反應(yīng)使用2 μ g總RNA。反應(yīng)總體積為20 μ I : 10 X RT buffer 2 μ I，總RNA 5 μ I，oligodT20 引物 I μ 1，IOmM dNTP I μ l,25mM MgCl24 μ 1，O. IM DTT I μ 1，RNaseOUT I μ I,SuperScript III逆轉(zhuǎn)錄酶I μ I，高純?nèi)ルx子水4 μ I。使用ABI PCR儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),具體運(yùn)行參數(shù)如下25°C IOmin ；37°C 60min ；75°C 5min ;冷卻至 4°C。_20°C保存?zhèn)溆谩?. C2orf40 cDNA 的克隆全長(zhǎng)C2orf40基因的開放閱讀框采用RT-PCR法從正常乳腺組織的總RNA中擴(kuò)增獲得，其中PCR使用Fermentas公司的Mix，反應(yīng)總體積為50 μ I 2XPCR Mix 25μ1，引物各1μ l，cDNA模板5μ 1，高純度去離子水23μ I。PCR反應(yīng)參數(shù)如下95°C預(yù)變性4min ;反應(yīng) 35 個(gè)循環(huán)95V , 30s ；58V 30s ；72°C 45s, 72°C延伸 Imin0運(yùn)用TOPO技術(shù)，連接到TOPO PCR Blunt載體。具體步驟如下取新鮮PCR產(chǎn)物2 μ 1，加入載體I μ 1，試劑盒中NaCl溶液I μ I，高純?nèi)ルx子水2 μ I。室溫下孵育IOmin后轉(zhuǎn)化細(xì)胞將TOPO反應(yīng)產(chǎn)物加入冰浴融化的感受態(tài)細(xì)菌中，冰浴孵育30min，42°C熱激活90s，加入試劑盒中SOB培養(yǎng)液lml，37°C低俗培養(yǎng)lh，再將細(xì)菌培養(yǎng)液接種在含青霉素培養(yǎng)LB板中繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)過夜。第二天，挑取克隆培養(yǎng)，經(jīng)測(cè)序選擇正確克隆。3.C2orf40的克隆引物C2orf40-cF (SEQ ID NO. 2) ttcaccatgaatcaggaactgctcC2orf40~cR (SEQ ID NO. 3) acacctgtacttcacttgatga4. C2orf40表達(dá)載體的構(gòu)建·抽提正確克隆的質(zhì)粒，用EcoR I酶切后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后回收目的片段，連入線性化的pBabe-puro。連接反應(yīng)如下載體I μ I,回收插入5 μ I,連接酶緩沖液
2μ 1，T4DNA連接酶I μ I。16°C連接過夜。過夜連接產(chǎn)物參照步驟2中的細(xì)菌轉(zhuǎn)化程序進(jìn)行轉(zhuǎn)化和細(xì)菌接種。挑取克隆培養(yǎng)，經(jīng)酶切和測(cè)序雙鑒定后，保存正確克隆，抽提質(zhì)粒，用于基因轉(zhuǎn)染。5.結(jié)果分析經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序分析，C2orf40基因的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體構(gòu)建成功。實(shí)施例3 C2orf40高表達(dá)和低表達(dá)乳腺癌細(xì)胞系的構(gòu)建I.操作過程①制作逆轉(zhuǎn)率病毒用磷酸鈣法將構(gòu)建好的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入Phi-NX逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞，獲得攜帶 pBabe-puro、pBabe-puro_C2orf40、pSuper-puro 或 pSuper-puro-sh.C2orf40的逆轉(zhuǎn)錄病毒，分別于24h、36h、48h收集含有病毒的上清，_80°C保存?zhèn)溆?；②?xì)胞系的選擇BT549和MDAMB231細(xì)胞用于構(gòu)建C2orf40高表達(dá)的細(xì)胞系，MDAMB468細(xì)胞用于C2orf40沉默③建立C2orf40基因高表達(dá)或沉默的細(xì)胞系用含有pBabe-puro、pBabe-puro-C2orf40的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清感染乳腺癌細(xì)胞系BT549和MDAMB231，37° C培養(yǎng)2d后加入嘌呤霉素篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)C2orf40的細(xì)胞系和相應(yīng)的對(duì)照細(xì)胞系；④建立C2orf40基因沉默細(xì)胞系用含有pSuper-puro或pSuper-puro-sh.C2orf40的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清感染乳腺癌細(xì)胞系MDAMB468，37°C培養(yǎng)2d后加入嘌呤霉素篩選，制備C2orf40基因沉默的乳腺癌細(xì)胞系；⑤RT-PCR和Western Blot驗(yàn)證C2orf40基因高表達(dá)和沉默細(xì)胞系中C2orf40的表達(dá)上述細(xì)胞裂解液，通過凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫反應(yīng)、化學(xué)發(fā)光、顯影、定影檢測(cè)C2orf40的水平。2.結(jié)果分析結(jié)果如圖3所示,分別成功構(gòu)建對(duì)照(pBabe-puro、pSuper_puro)、C2orf40高表達(dá)(pBabe-puro-C2orf40)、和 C2orf40 低表達(dá)(pSuper-puro_shC20rf40)乳腺癌細(xì)胞系。實(shí)施例4集落形成實(shí)驗(yàn)分析C2orf40基因的抑癌功能I.實(shí)驗(yàn)分組對(duì)照組(pBabe-puro、pSuper-puro)乳腺癌細(xì)胞；C2orf40高表達(dá)組(pBabe-puro-C2orf40)乳腺癌細(xì)胞；C2orf40 低表達(dá)組(pSuper-puro_shC20rf40)乳腺癌細(xì)胞2.操作過程(I)將不同組的乳腺癌細(xì)胞分別接種到6cm的培養(yǎng)皿中，200細(xì)胞/培養(yǎng)皿每組三個(gè)重復(fù)皿；(2)將培養(yǎng)皿移到培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)2周；(3) 2周后終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，用無菌的D-Hanks洗2次；(4)加入5ml甲醇,靜置15min (固定細(xì)胞)；(5)棄固定液后，Giemsa染液染色30min ； (6)流水沖去染液，置于空氣中干燥；(7)顯微鏡下計(jì)數(shù)，大于50個(gè)細(xì)胞以上者算一個(gè)克隆，按每個(gè)克隆大小(細(xì)胞個(gè)數(shù)50-100、100-200、> 200)分別計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)。3.結(jié)果分析克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C2orf40高表達(dá)的MDA-MB-231和BT549乳腺癌細(xì)胞比對(duì)照組細(xì)胞克隆形成數(shù)顯著減少(圖4a，b) (P < O. 05) ；C2orf40基因沉默的MDAMB468細(xì)胞比對(duì)照組細(xì)胞克隆形成數(shù)多，其中shRNA. A組比shRNA. B組克隆形成數(shù)多，與其基因沉默效率相對(duì)應(yīng)(圖4c) (P < O. 05)。C2orf40高表達(dá)的MDA-MB-231和BT549細(xì)胞與各自的對(duì)照組相比，兩株C2orf40基因沉默的MDA-MB-468細(xì)胞與其對(duì)照組相比，C2orf40不僅抑制克隆形成而且形成的克隆小，進(jìn)一步說明C2orf40能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。實(shí)施例5MTT法檢測(cè)C2orf40對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖功能的影響I.實(shí)驗(yàn)分組對(duì)照組(pBabe-puro、pSuper-puro)乳腺癌細(xì)胞；C2orf40高表達(dá)組(pBabe-puro-C2orf40)乳腺癌細(xì)胞；C2orf40 低表達(dá)組(pSuper-puro_shC20rf40)乳腺癌細(xì)胞2.操作過程(I)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，用O. 25%的胰酶常規(guī)消化，計(jì)數(shù)，用含有10%FBS的培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為2X 104/ml，分別接種到96孔板中，100 μ I/孔，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔；另外設(shè)置調(diào)零孔含有10%FBS的培養(yǎng)基，100 μ I/孔；(2)將96孔板置于CO2培養(yǎng)箱，在37°C，5%C02及飽和濕度環(huán)境下，培養(yǎng)3天；(3) 3天后，每孔加入10 μ I MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)；(4)將上清去掉，每孔加入150 μ I DMSO溶液，置于搖床上低速震蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解；(5)在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上，OD值490nm處測(cè)量各孔的吸光值。3.結(jié)果分析MTT數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，C2orf40高表達(dá)的MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞比對(duì)照組吸光度值降低36%，C2orf40高表達(dá)的BT549乳腺癌細(xì)胞比對(duì)照組吸光度值降低57%(圖5，a，b)，兩株C2orf40基因沉默的MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞系比對(duì)照組吸光度值分別增加了 83%和23%，其中shRNA. A組比shRNA. B組吸光度值高60%，與其基因沉默效率相對(duì)應(yīng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)，顯示0201^40對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖有抑制作用，且抑制效果明顯(圖5c)。
實(shí)施例6劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)C2orf40對(duì)乳腺癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)功能的影響I.實(shí)驗(yàn)分組對(duì)照組(pBabe-puro、pSuper-puro)乳腺癌細(xì)胞；C2orf40高表達(dá)組(pBabe-puro-C2orf40)乳腺癌細(xì)胞；C2orf40 低表達(dá)組(pSuper-puro_shC20rf40)乳腺癌細(xì)胞2.操作過程(I)將各組細(xì)胞種到6cm的皿中，培養(yǎng)細(xì)胞密度達(dá)到90%左右時(shí)；(2)用200 μ I的槍頭在皿中輕輕劃一直線；(3)用D-Hanks輕輕洗2次，將漂浮的細(xì)胞沖洗干凈；(4)在 0h、24h、48h 時(shí)分別拍照。2.結(jié)果分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，C2orf40高表達(dá)的MDA-MB-231實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組細(xì)胞劃痕愈合能力降低(圖6a)，C2orf40高表達(dá)的BT549實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組細(xì)胞劃痕愈合能力降低(圖6b)，C2orf40基因沉默的MDA-MB-468細(xì)胞比對(duì)照組細(xì)胞劃痕愈合能力增強(qiáng)，其中shRNA. A組比shRNA. B組劃痕愈合能力強(qiáng)，與其基因沉默效率相對(duì)應(yīng)(圖6c，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< O. 05)，結(jié)果顯示C2orf40能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移能力。實(shí)施例7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)C2orf40對(duì)乳腺癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)功能的影響I.實(shí)驗(yàn)分組對(duì)照組(pBabe-puro、pSuper-puro)乳腺癌細(xì)胞；C2orf40高表達(dá)組(pBabe-puro-C2orf40)乳腺癌細(xì)胞；C2orf40 低表達(dá)組(pSuper-puro_shC20rf40)乳腺癌細(xì)胞2.操作過程Matrigel是一種可溶性的基底膜基質(zhì),細(xì)胞穿過Matrigel的能力與它在體內(nèi)侵襲能力具有相關(guān)性。transwell小室有微孔膜分隔，可以使上、下小室內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)成分不同，上室中為不含胎牛血清的培養(yǎng)基，下室中為含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基。腫瘤細(xì)胞會(huì)分泌水解酶水解Matrigel，然后變形穿過濾膜孔進(jìn)入下室，可以通過計(jì)數(shù)膜上的穿透細(xì)胞數(shù)來檢測(cè)細(xì)胞的體外侵襲能力?！?I)Matrigel在4 °C過夜融化，實(shí)驗(yàn)所用槍頭、24孔板、Transwell小室均放入-20°C預(yù)冷，過夜；(2)在冰上，用4°C預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基將Matrigel稀釋7倍；(3)在transwell小室的上室底部中央垂直加入50 μ I稀釋后的Matrigel，37°C溫育半小時(shí)使其干成膠狀；(4)所有細(xì)胞培養(yǎng)試劑和放在37°C溫育；(5)待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，消化細(xì)胞，用D-Hanks和無血清培養(yǎng)基先后洗滌一次，用無血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為2 X 105/ml ；(6)在下室(即24孔板底部)加入800μ I含10%血清的培養(yǎng)基，上室加入100 μ I細(xì)胞懸液，繼續(xù)在孵箱培養(yǎng)48小時(shí)；(7)用鑷子小心取出chamber，吸干上室液體，移到預(yù)先加入約800 μ I甲醇的孔中，室溫固定30分鐘；(8)取出chamber,吸干上室固定液,移到預(yù)先加入約800 μ I Giemsa染液的孔中，室溫染色15 — 30分鐘；
(9)在清水浸泡數(shù)次，取出chamber，吸干上室液體，用濕棉棒小心擦拭上室底部膜表面上的細(xì)胞；(10)小心地用鑷子揭下膜，底面向上晾干，用中性樹膠將膜封片在載玻片上；(11)于光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)，將每張膜分為九個(gè)區(qū)域中，分別計(jì)數(shù)穿透的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值，每組設(shè)3個(gè)平行孔，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。3.結(jié)果分析本研究利用鋪有Matrigel的Transwell小室觀察了 C2orf40對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響。Transwell培養(yǎng)細(xì)胞48小時(shí)后細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果表明，C2orf40高表達(dá)的MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組細(xì)胞平均每個(gè)視野的穿透細(xì)胞數(shù)多26個(gè)(圖7a), C2orf40高表達(dá)的BT549實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組細(xì)胞平均每個(gè)視野的穿透細(xì)胞數(shù)多41個(gè)(圖7b)，C2orf40基因沉默的MDA-MB-468的shRNA. A組比對(duì)照組平均每個(gè)視野的穿透細(xì)胞數(shù)多 162個(gè)，比shRNA. B組多84個(gè)，shRNA. B組比對(duì)照組細(xì)胞平均每個(gè)視野的穿透細(xì)胞數(shù)多78個(gè)，與其基因沉默效率相對(duì)應(yīng)(圖7c)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < O. 05)，結(jié)果顯示C2orf40能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力。實(shí)施例8一種乳腺腫瘤診斷藥物，它至少包括一對(duì)特異性擴(kuò)增C2orf40基因的引物，所述的引物由上游引物和下游引物組成，其中，所述的上游引物具有如SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列。所述的乳腺腫瘤診斷藥物以C2orf40基因?yàn)榛A(chǔ)的檢測(cè)手段，檢測(cè)手段為RT-PCR或?qū)崟r(shí)定量PCR。診斷方法是用GAPDH (內(nèi)參)作為對(duì)照,PCR使用美國(guó)Applied biosystem公司的定量RT-PCR試劑盒。反應(yīng)總體積為20微升采用I微升cDNA模板，加入2 XPCR buffer10微升，高純?nèi)ルx子水9微升。反應(yīng)參數(shù)如下95°C預(yù)熱5分鐘；35個(gè)循環(huán)設(shè)置如下，95°C，30秒；58°C，30秒；72°C 45秒；最后進(jìn)行表達(dá)分析。結(jié)論C2orf40基因在乳腺癌組織中表達(dá)下降，且其表達(dá)水平-乳腺癌患者的預(yù)后生存時(shí)間及轉(zhuǎn)移幾率密切相關(guān)；通過克隆C2orf40cDNA，構(gòu)建C2orf40基因的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)使C2orf40基因在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)后，可以抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，降低其遷移和侵襲的能力。以上結(jié)果表明C2orf40基因在乳腺癌中具有抑癌功能。檢測(cè)C2orf40基因的表達(dá)可以用于乳腺癌的診斷。而恢復(fù)C2orf40基因的抑癌功能則可以達(dá)到治療腫瘤的目的。因此，C2orf40基因在乳腺癌的診斷、預(yù)防及治療中均有一定的應(yīng)用價(jià)值。盡管本發(fā)明人已經(jīng)對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做了較為詳細(xì)的闡述和列舉，應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言，對(duì)上述實(shí)施例作出修改和或變通或者采用等同的替代方案是顯然的，都不能脫離本發(fā)明精神的實(shí)質(zhì)，本發(fā)明中出現(xiàn)的術(shù)語(yǔ)用于對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的闡述和理解，并不能構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。
權(quán)利要求
1.抑癌基因C2orf40在制備診斷、預(yù)防或治療乳腺腫瘤藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征是，所述乳腺腫瘤預(yù)防或治療藥物以C2orf40基因?yàn)榘悬c(diǎn)。
3.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征是，所述藥物為藥劑學(xué)上可接受的任何一種劑型，包括粉劑、注射劑、膠囊、片劑或口服液。
4.一種預(yù)防或治療乳腺腫瘤的表達(dá)載體，其特征是，它是由C2orf40基因和pBabe-puro載體構(gòu)建而成。
5.權(quán)利要求4所述的預(yù)防或治療乳腺腫瘤藥物的表達(dá)載體的制備方法，其特征是，步驟過下 Cl)獲得cDNA :全長(zhǎng)C2orf40基因的開放閱讀框采用RT-PCR法從正常乳腺組織的總RNA中獲得，然后進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增所用引物為C2orf40-cF ttcaccatgaatcaggaactgctcC2orf40~cR acacctgtacttcacttgatga (2)將上述cDNA連接到TOPOPCR Blunt載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，在含青霉素培養(yǎng)LB板中培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆培養(yǎng)，經(jīng)測(cè)序選擇正確克?。? (3)C2orf40表達(dá)載體的構(gòu)建 抽提正確克隆的質(zhì)粒，用EcoR I酶切后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后回收目的片段，連入線性化的pcDNA3. I載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，在含青霉素培養(yǎng)LB板中培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆培養(yǎng)，經(jīng)酶切和測(cè)序雙鑒定后，保存正確克隆，抽提質(zhì)粒，即得。
6.一種乳腺腫瘤診斷藥物，其特征是，它至少包括一對(duì)特異性擴(kuò)增C2orf40基因的引物，所述的引物由上游引物和下游引物組成，其中，所述的上游引物具有如SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列。
7.如權(quán)利要求6所述的乳腺腫瘤診斷藥物，其特征是，所述的乳腺腫瘤診斷藥物以C2orf40基因?yàn)榛A(chǔ)的檢測(cè)手段，檢測(cè)手段為RT-PCR或?qū)崟r(shí)定量PCR。
8.如權(quán)利要求7所述的乳腺腫瘤診斷藥物，其特征是，所用RT-PCR試劑盒為反應(yīng)總體積為20微升采用I微升cDNA模板，加入2 XPCR buffer 10微升，高純?nèi)ルx子水9微升；反應(yīng)參數(shù)如下95°C預(yù)熱5分鐘；35個(gè)循環(huán)設(shè)置如下，95°C，30秒；58°C，30秒；72°C 45秒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抑癌基因C2orf40在制備預(yù)防、診斷或治療乳腺腫瘤藥物中的應(yīng)用、表達(dá)載體和診斷藥物，屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，內(nèi)容包括抑癌基因C2orf40在制備預(yù)防或治療乳腺腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還公開相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒和藥物組合物。作為基因治療的靶基因，針對(duì)高表達(dá)該基因而獲得對(duì)乳腺腫瘤治療效果的各種基因治療方案。
文檔編號(hào)A61K45/00GK102925564SQ201210398378
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月18日
發(fā)明者魏光偉, 王允山, 路婧, 何秀全, 張鵬舉 申請(qǐng)人:山東大學(xué)