本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種基于多個基因診斷胃癌患者的檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：在我國，消化道系統(tǒng)腫瘤的發(fā)病率排在第一位，其中最高的是胃癌。全球每年胃癌發(fā)病人數(shù)約為87萬，我國就有30多萬。1962年日本胃癌研究會正式提出早期胃癌(EGC)的概念，這是胃癌診斷和治療一個里程碑的事件，由于早期胃癌概念的提出，使得胃癌達到臨床治愈、獲得長期存活成為可能。歷經(jīng)半個世紀(jì)的研究與診治工作，對于早期胃癌的認(rèn)識也逐步深入，對早期胃癌的診斷也得以逐漸精細，特別是近年來，對于早期胃癌治療的指導(dǎo)思想由原來的片面追求根治效果延長生存期轉(zhuǎn)變?yōu)椴粌H要求有長期的存活率，更要求在微創(chuàng)的情況下獲得根治，保證術(shù)后病人有良好的生活質(zhì)量，所以精準(zhǔn)的早期診斷使其治療手段也更趨于個體化。目前在我國早期胃癌的診斷率仍不足10％，而日本則高達50％～70％，開發(fā)胃癌早期診斷方法，提高早期胃癌的診斷率，使胃癌病人能夠早期得到合適的治療，是當(dāng)前從事胃癌診斷產(chǎn)品開發(fā)企業(yè)的重要任務(wù)。目前，在包括體液如血液、尿液、唾液、支氣管液、痰液、腹膜灌洗液和糞便等提取物在內(nèi)的生物標(biāo)本中的特異性癌癥相關(guān)標(biāo)記物的鑒定能提供有價值的癌癥早期診斷方法，以便早期治療并改善預(yù)后。特異性癌癥標(biāo)記物還能提供用于監(jiān)測疾病進展的方法，從而能跟蹤外科手術(shù)、放射治療和化學(xué)治療的功效。然而，對于許多主要癌癥，可利用的標(biāo)記物缺乏足夠的敏感性和特異性。例如，用于胃癌的最常用標(biāo)記物CA19-9、CA72-4和癌胚抗原(CEA)僅檢測到大約15-50％的任何階段的胃腫瘤，對于疾病早期的檢測則降至大約2-11％。因此，出現(xiàn)假陰性檢測的頻率非常高，這導(dǎo)致患者和健康護理工作者認(rèn)為不存在疾病，而事實上，患者可能患有嚴(yán)重的需要立即注意的癌癥。而且，使用這些標(biāo)記物可能對高達1/3的患有良性胃疾病個體給出假陽性信號。因此，有效的胃癌早期診斷生物標(biāo)志物是迫切需要的。在散發(fā)性胃癌的發(fā)病中，表遺傳學(xué)改變比遺傳學(xué)改變占有更重要的地位。近20年的研究發(fā)現(xiàn)，作為表遺傳學(xué)的重要組成部分，表觀遺傳學(xué)(epigenetics)是研究轉(zhuǎn)錄前基因在染色質(zhì)水平的結(jié)構(gòu)修飾對基因功能的影響，這種修飾可通過細胞分裂和增殖周期進行傳遞，并適當(dāng)?shù)恼{(diào)控基因轉(zhuǎn)錄表達，以保證細胞進行正常的增殖-分化-成熟-衰老的發(fā)育進程。長期以來，人們一直認(rèn)為腫瘤的發(fā)生是基因突變累積的結(jié)果，然而近年隨著表觀遺傳學(xué)的研究進展，已越來越清楚地發(fā)現(xiàn)表觀遺傳機制在腫瘤的發(fā)生中起著非常重要的作用。表觀遺傳修飾包括DNA甲基化修飾、組蛋白修飾和染色體印跡等。而DNA甲基化是腫瘤中最常見的分子改變之一，CpG島甲基化導(dǎo)致抑癌基因失活是引起細胞惡化的重要步驟。以種系特異性基因為例：體細胞中需要保持永久關(guān)閉的關(guān)鍵基因在胚胎干細胞中被甲基化，然而一旦甲基化丟失則將導(dǎo)致細胞的去分化，并向著腫瘤相關(guān)的表型發(fā)展，如果抑癌基因再發(fā)生高甲基化或/和基因突變，則導(dǎo)致腫瘤的形成。DNA甲基化改變調(diào)控基因表達、與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的概念是人類基因組計劃完成之后，表觀遺傳學(xué)研究的一個重要的成果。DNA甲基化是基因表達調(diào)控的一種中間形式，最可能的調(diào)控作用是通過抑制關(guān)鍵基因的表達，從而決定該細胞的命運，如對于腫瘤細胞中DNA甲基化異?，F(xiàn)象的研究已經(jīng)在多種腫瘤中取得了許多重大的進展。哺乳動物中，甲基化僅影響DNA鏈上鳥嘌呤前的胞嘧啶(CpG)。正常細胞中CpG雙核苷酸的甲基化分布并不均一，大約50％的基因在啟動子區(qū)域有CpG集中分布的CpG島存在，長度從0.5～2kb不等，該區(qū)域與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有著密切關(guān)系。人體某些基因調(diào)控區(qū)域的CpG島甲基化在相關(guān)癌細胞組織中頻繁出現(xiàn)，顯示出與某些腫瘤的發(fā)病、病程進展和預(yù)后、用藥敏感性等相關(guān)。迄今為止，已在大多數(shù)人類腫瘤中發(fā)現(xiàn)了基因甲基化異常。研究發(fā)現(xiàn)在癌細胞中表觀遺傳編碼發(fā)生紊亂，首先表現(xiàn)在DNA甲基化水平紊亂，又稱為甲基化重排，即促進增殖的基因低甲基化、高表達；促進細胞分化的基因高甲基化、低表達；DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶家族(DNMTfamily)高表達。癌癥中甲基化重排涉及的基因包括：細胞周期調(diào)控基因、DNA修復(fù)基因、血管形成基因、細胞凋亡相關(guān)基因、細胞黏附遷移相關(guān)基因、激素受體基因、核轉(zhuǎn)錄因子、酶類等等。通過對DNA甲基化修飾的研究，有可能為腫瘤發(fā)病機制的闡明、腫瘤早期診斷和治療開辟新的有效途徑，達到腫瘤治療的目的。由于CpG島的局部高度甲基化早于細胞的惡性增生，因此，甲基化的診斷可以用于腫瘤發(fā)生的早期預(yù)測。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種檢測p16、CDH1、MGMT、RARB和RNF180基因及其片段的甲基化的試劑盒，包括引物探針組合物甲、引物探針組合物乙、引物探針組合物丙、引物探針組合物丁和引物探針組合物戊；引物探針組合物甲包括特異性引物對甲、封閉引物甲和探針甲；引物探針組合物乙包括特異性引物對乙、封閉引物乙和探針乙；引物探針組合物丙包括特異性引物對丙、封閉引物丙和探針丙；引物探針組合物丁包括特異性引物對丁、封閉引物丁和探針?。灰锾结樈M合物戊包括特異性引物對戊、封閉引物戊和探針戊；引物探針組合物甲為第一引物探針組合物甲或第二引物探針組合物甲；第一引物探針組合物甲中：特異性引物對甲為序列表的序列6所示DNA和序列表的序列7所示DNA組成的引物對，封閉引物甲的核苷酸序列如序列表的序列8所示，探針甲的核苷酸序列如序列表的序列9所示；第二引物探針組合物甲中：特異性引物對甲為序列表的序列10所示DNA和序列表的序列11所示DNA組成的引物對，封閉引物甲的核苷酸序列如序列表的序列12所示，探針甲的核苷酸序列如序列表的序列13所示；引物探針組合物乙為第三引物探針組合物乙或第四引物探針組合物乙；第三引物探針組合物乙中：特異性引物對乙為序列表的序列14所示DNA和序列表的序列15所示DNA組成的引物對，封閉引物乙的核苷酸序列如序列表的序列16所示，探針乙的核苷酸序列如序列表的序列17所示；第四引物探針組合物乙中：特異性引物對乙為序列表的序列18所示DNA和序列表的序列19所示DNA組成的引物對，封閉引物乙的核苷酸序列如序列表的序列20所示，探針乙的核苷酸序列如序列表的序列21所示；引物探針組合物丙為第五引物探針組合物丙或第六引物探針組合物丙；第五引物探針組合物丙中：特異性引物對丙為序列表的序列22所示DNA和序列表的序列23所示DNA組成的引物對，封閉引物丙的核苷酸序列如序列表的序列24所示，探針丙的核苷酸序列如序列表的序列25所示；第六引物探針組合物丙中：特異性引物對丙為序列表的序列26所示DNA和序列表的序列27所示DNA組成的引物對，封閉引物丙的核苷酸序列如序列表的序列28所示，探針丙的核苷酸序列如序列表的序列29所示；引物探針組合物丁為第七引物探針組合物丁或第八引物探針組合物?。坏谄咭锾结樈M合物丁中：特異性引物對丁為序列表的序列30所示DNA和序列表的序列31所示DNA組成的引物對，封閉引物丁的核苷酸序列如序列表的序列32所示，探針丁的核苷酸序列如序列表的序列33所示；第八引物探針組合物丁中：特異性引物對丁為序列表的序列34所示DNA和序列表的序列35所示DNA組成的引物對，封閉引物丁的核苷酸序列如序列表的序列36所示，探針丁的核苷酸序列如序列表的序列37所示；引物探針組合物戊為第九引物探針組合物戊或第十引物探針組合物戊；第九引物探針組合物戊中：特異性引物對戊為序列表的序列38所示DNA和序列表的序列39所示DNA組成的引物對，封閉引物戊的核苷酸序列如序列表的序列40所示，探針戊的核苷酸序列如序列表的序列41所示；第十引物探針組合物戊中：特異性引物對戊為序列表的序列42所示DNA和序列表的序列43所示DNA組成的引物對，封閉引物戊的核苷酸序列如序列表的序列44所示，探針戊的核苷酸序列如序列表的序列45所示。需要說明的是，引物探針組合物甲用于檢測p16基因核酸序列的甲基化，引物探針組合物乙用于檢測CDH1基因核酸序列的甲基化，引物探針組合物丙用于檢測MGMT基因核酸序列的甲基化，引物探針組合物丁用于檢測RARB基因核酸序列的甲基化，引物探針組合物戊用于檢測RNF180基因核酸序列的甲基化，不同的引物探針組合物分別檢測對應(yīng)基因靶區(qū)域核酸序列中至少一段核酸序列的甲基化；其中，靶區(qū)域分別選自序列表的序列1所示、序列表的序列2所示、序列表的序列3所示、序列表的序列4所示和序列表的序列5所示的序列中的連續(xù)的至少15個堿基長度的片段；核酸序列分別等同、互補或雜交于上述靶區(qū)域。試劑盒中，每種引物探針組合物均可以單獨包裝。試劑盒還包括針對內(nèi)參基因的內(nèi)參引物和內(nèi)參探針，內(nèi)參基因為ACTB(NCBI基因庫序列號：NM_001101.3)和/或GSTP1(NCBI基因庫序列號：NM_000852.3)。內(nèi)參基因ACTB的內(nèi)參引物對為序列表的序列46所示DNA和序列表的序列47所示DNA組成的引物對；內(nèi)參基因ACTB的內(nèi)參探針的核苷酸序列如序列表的序列48所示；內(nèi)參基因GSTP1的內(nèi)參引物對為序列表的序列49所示DNA和序列表的序列50所示DNA組成的引物對；內(nèi)參基因GSTP1的內(nèi)參探針的核苷酸序列如序列表的序列51所示。本發(fā)明的目的還在于提供一種用于診斷胃癌患者的試劑盒，包括如下五個引物探針組合物中的至少一種：引物探針組合物甲、引物探針組合物乙、引物探針組合物丙、引物探針組合物丁和引物探針組合物戊，不同的引物探針組合物包括的引物對、封閉引物和探針分別同上述的引物探針組合物。也就是說，引物探針組合物甲、引物探針組合物乙、引物探針組合物丙、引物探針組合物丁和引物探針組合物戊可以分別檢測p16、CDH1、MGMT、RARB和RNF180基因及其片段的甲基化，五種甲基化結(jié)果共同用于診斷是否為胃癌患者；當(dāng)然，也可以挑選引物探針組合物甲、引物探針組合物乙、引物探針組合物丙、引物探針組合物丁和引物探針組合物戊中的一種、兩種、三種或四種引物探針組合物分別檢測對應(yīng)的基因及其片段的甲基化，根據(jù)一種、兩種、三種或四種甲基化結(jié)果來診斷是否為胃癌患者。本發(fā)明提供的引物探針組合物甲、引物探針組合物乙、引物探針組合物丙、引物探針組合物丁和引物探針組合物戊(對應(yīng)十種引物探針組)分別對p16、CDH1、MGMT、RARB和RNF180基因及其片段的甲基化具有較高的特異性，只是五種引物探針組合物聯(lián)合診斷時的靈敏度最高。試劑盒還包括針對內(nèi)參基因的內(nèi)參引物和內(nèi)參探針，內(nèi)參基因為ACTB和/或GSTP1，基因序列同上所述，內(nèi)參基因ACTB和GSTP1的內(nèi)參引物對同上所述。試劑盒還包括DNA提取試劑和亞硫酸氫鹽試劑；DNA提取試劑包括裂解緩沖液、清洗緩沖液和洗脫緩沖液；其中，裂解緩沖液包括蛋白變性劑、去垢劑、pH緩沖劑和核酸酶抑制劑；清洗緩沖液分為清洗緩沖液A和清洗緩沖液B，清洗緩沖液A包括蛋白質(zhì)變性劑、核酸酶抑制劑、pH緩沖劑、乙醇，清洗緩沖液B包括核酸酶抑制劑、pH緩沖劑、乙醇；洗脫緩沖液包括核酸酶抑制劑和pH緩沖劑；蛋白變性劑選自異硫氰酸胍、鹽酸胍和尿素中的一種或幾種；去垢劑選自Tween20、Tween40、TritonX-100、NP-40和SDS中的一種或幾種；pH緩沖劑選自Tris、硼酸、磷酸鹽、MES和HEPES中的一種或幾種；核酸酶抑制劑選自EDTA、EGTA和DEPC中的一種或幾種；亞硫酸氫鹽試劑包括亞硫酸氫鹽緩沖液和保護緩沖液；其中，亞硫酸氫鹽緩沖液選自重亞硫酸鈉、亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、亞硫酸氫銨和亞硫酸銨中的一種或幾種；保護緩沖液包括氧自由基清除劑，氧自由基清除劑選自對苯二酚、維生素E、維生素E衍生物、沒食子酸、Trolox、三羥基苯甲酸和三羥基苯甲酸衍生物中的一種或多種。本發(fā)明還保護上述試劑盒在制備檢測胃癌產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護試劑盒檢測p16、CDH1、MGMT、RARB和RNF180基因及其片段的甲基化的方法，包括如下步驟：S1：采用DNA提取試劑提取人源樣本的DNA；S2：將提取得到的DNA采用亞硫酸氫鹽試劑進行處理；S3：以處理后的DNA為模板，采用引物探針組合物和內(nèi)參基因的內(nèi)參引物及內(nèi)參探針進行PCR擴增。人源樣本選自細胞系、組織切片、活檢組織、石蠟包埋的組織、唾液、痰液、支氣管液、胃液、體液、糞便、結(jié)腸流出物、尿、血漿、血清、全血和從血液中分離的細胞中的一種或多種。具體地，S1采用DNA提取試劑提取人源樣本(如血漿)的DNA包括如下步驟：(1)取1～5ml血漿，加入相同體積的裂解緩沖液，再加入終濃度為10～500mg/L的蛋白酶K和0.01～10μg/mlCarrierRNA，震蕩混勻，55℃溫育10～30min；(2)加入100μl磁珠，振蕩孵育0.5～1小時；(3)用磁分離器吸附磁珠，丟棄上清溶液；(4)加入0.5～2ml清洗緩沖液A重懸磁珠，震蕩清洗1min；(5)用磁分離器吸附磁珠，丟棄上清；(6)加入0.5～2ml清洗緩沖液B重懸磁珠，震蕩清洗1min；(7)用磁分離器吸附磁珠，丟棄上清溶液；(8)10000rpm快速離心1min，用磁分離器吸附磁珠，去除殘余上清溶液；(9)將裝有磁珠的離心管開蓋放置在55℃的金屬浴上，晾干3～10min；(10)加入50～500ul洗脫緩沖液重懸磁珠，放置在65℃金屬浴上，震蕩洗脫10min；(11)用磁分離器吸附磁珠，取出含有目的DNA的緩沖液，定量DNA，做好標(biāo)記；(12)洗脫后的DNA存放于4℃冰箱待用，或者保存于-20℃冰箱長期保存。具體地，S2將提取得到的DNA采用亞硫酸氫鹽試劑進行處理包括如下步驟：(1)配制亞硫酸氫鹽緩沖液，用重亞硫酸鈉、亞硫酸銨等配制1～12M緩沖液，根據(jù)DNA含量，可以選用不同濃度亞硫酸氫鹽緩沖液；(2)配制保護緩沖液，用氧自由基清除劑的一種或者多種配制濃度0.01～5M保護緩沖液，濃度及組分取決于DNA含量及所用樣本類型；(3)將100μlDNA溶液(DNA含量10pg～10μg)、200μl亞硫酸氫鹽緩沖液和50μl保護液混合，震蕩混合均勻；(4)熱循環(huán)：95℃5min，50℃30min，95℃5min，50℃2h，95℃5min，50℃5h，4℃；(5)將0.5～5mlDNA結(jié)合緩沖液加入到亞硫酸氫鹽處理后的DNA溶液中，再加入20～200μl磁珠，震蕩孵育30min～1h；(6)用磁分離器吸附磁珠，丟棄上清溶液；(7)加入0.5～2ml清洗緩沖液A重懸磁珠，震蕩清洗1min；(8)用磁分離器吸附磁珠，丟棄上清；(9)加入0.5～2ml清洗緩沖液B重懸磁珠，震蕩清洗1min；(10)用磁分離器吸附磁珠，丟棄上清溶液。(11)10000rpm快速離心1min，用磁分離器吸附磁珠，去除殘余上清溶液；(12)將裝有磁珠的離心管放置在55℃的金屬浴上，開蓋晾干3～10min；(13)加入50～500μl洗脫緩沖液重懸磁珠，放置在65℃金屬浴上，震蕩洗脫10min；(14)用磁分離器吸附磁珠，取出含有目的DNA的緩沖液，定量DNA，做好標(biāo)記。具體地，S3以處理后的DNA為模板，采用引物探針組合物和內(nèi)參基因的內(nèi)參引物及內(nèi)參探針進行PCR擴增。檢測基因為p16、CDH1、MGMT、RARB和RNF180基因，內(nèi)參基因為ACTB和/或GSTP1。引物探針組合物甲用于檢測p16基因核酸序列的甲基化，引物探針組合物乙用于檢測CDH1基因核酸序列的甲基化，引物探針組合物丙用于檢測MGMT基因核酸序列的甲基化，引物探針組合物丁用于檢測RARB基因核酸序列的甲基化，引物探針組合物戊用于檢測RNF180基因核酸序列的甲基化。DNA甲基化標(biāo)志物基因(p16、CDH1、MGMT、RARB和RNF180基因)的探針和內(nèi)參基因(ACTB、GSTP1基因)的探針5'端報告熒光基團為FAM、JOE、TET、HEX、Cy3、TexasRed、Rox和Cy5中的一種或多種；甲基化基因的探針和內(nèi)參基因的探針3'端的猝滅基團為BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL中一種或多種；甲基化基因的封閉引物3'端修飾集團為C3Spacer、C6Spacer、inverted3'end中的一種或多種。熒光定量PCR擴增反應(yīng)體系的終濃度組成為：1～10×PCR緩沖液、0.1～1mMdNTPs、0.1～1μM目的基因檢測引物、0.1～1μM目的基因熒光探針、0.1～1μM目的基因封閉引物、0.1～1μM內(nèi)參基因引物、0.1～1μM內(nèi)參基因熒光探針、0.001～2ng/μl模板DNA、0.01～0.10U/μl熱啟動TaqDNA聚合酶。dNTPs中包括10mMdATP、10mMdCTP、10mMdTTP和10mMdGTP，PCR緩沖液中包含Tris-HCl、氯化鉀、硫酸銨和氯化鎂。熒光定量PCR擴增反應(yīng)的具體過程為：92～97℃預(yù)變性5～35分鐘，再進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增階段，92～97℃變性10～30s，50～65℃退火延伸10～60s，并進行40～55個循環(huán)。p16、CDH1、MGMT、RARB和RNF180基因的甲基化情況是潛在的胃癌(尤其是早期胃癌)診斷、預(yù)后評估及療效監(jiān)測的有意義的臨床指標(biāo)。本發(fā)明對于深入了解早期胃癌的發(fā)病機制，認(rèn)識其發(fā)生發(fā)展規(guī)律，提高我國早期胃癌診治水平具有重要的價值，也為尋求新的早期胃癌靶向治療策略奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明提供的試劑盒，可以應(yīng)用于診斷胃癌，為多發(fā)性胃癌的診斷提供了一條快速、可靠、準(zhǔn)確的新途徑，為療效觀察、微小殘留病的動態(tài)觀察提供依據(jù)，本發(fā)明將在醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。本發(fā)明的技術(shù)方案中，可以將p16、CDH1、MGMT、RARB或RNF180基因單獨進行甲基化檢測而進行胃癌篩查，也可以將p16、CDH1、MGMT、RARB和RNF180基因結(jié)合在一起進行胃癌篩查，通過將分別檢測p16基因、CDH1基因、MGMT基因、RARB基因和RNF180基因及其片段的甲基化核酸序列聯(lián)合使用，使得胃癌檢測的靈敏度和特異性提高，尤其是靈敏度顯著提高。單獨檢測p16的靈敏度為76％及以上、CDH1的靈敏度為77.67％及以上、MGMT的靈敏度為67.33％及以上、RARB的靈敏度為62％及以上，RNF180的靈敏度為72％及以上，當(dāng)五個標(biāo)志物基因聯(lián)合檢測時，靈敏度能提高到96％。本發(fā)明能夠根據(jù)實時熒光定量PCR的循環(huán)閾值(Ct)來快速、便捷地判斷樣本是否陽性，提供了一種可以用于快速、準(zhǔn)確的檢測胃癌的試劑盒。本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。附圖說明圖1為本發(fā)明實施例五中檢測血漿中p16基因的ROC曲線；圖2為本發(fā)明實施例五中檢測血漿中CDH1基因的ROC曲線；圖3為本發(fā)明實施例五中檢測血漿中MGMT基因的ROC曲線；圖4為本發(fā)明實施例五中檢測血漿中RARB基因的ROC曲線；圖5為本發(fā)明實施例五中檢測血漿中RNF180基因的ROC曲線；圖6為本發(fā)明實施例五中檢測血漿中聯(lián)合檢測p16、CDH1、MGMT、RARB和RNF180基因的ROC曲線；具體實施方式下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述。以下實施例僅用于更加清楚地說明本發(fā)明的技術(shù)方案，因此只是作為示例，而不能以此來限制本發(fā)明的保護范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，數(shù)據(jù)為三次重復(fù)實驗的平均值或平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。實施例一：DNA提取DNA提取試劑由裂解緩沖液、清洗緩沖液和洗脫緩沖液組成，見表1；裂解緩沖液由蛋白變性劑、去垢劑、pH緩沖劑和核酸酶抑制劑組成；蛋白變性劑為：鹽酸胍(購自sigma公司)；去垢劑為：Tween20(購自sigma公司)；pH緩沖劑為：Tris-HCl(購自阿拉丁公司)；核酸酶抑制劑為：EDTA(購自sigma公司)。表1DNA提取所用試劑本實施例以血漿樣本(購自北京301醫(yī)院)為例，提取血漿循環(huán)腫瘤DNA，提取方法包括如下步驟：(1)取1ml血漿，加入相同體積的裂解緩沖液，再加入蛋白酶K和CarrierRNA，使其終濃度分別為100mg/L和1μg/ml，震蕩混勻，55℃溫育30min；(2)加入100μl磁珠，振蕩孵育1小時；(3)用磁分離器吸附磁珠，丟棄上清溶液；(4)加入1ml清洗緩沖液A重懸磁珠，震蕩清洗1min；(5)用磁分離器吸附磁珠，丟棄上清；(6)加入1ml清洗緩沖液B重懸磁珠，震蕩清洗1min；(7)用磁分離器吸附磁珠，丟棄上清溶液；(8)10000rpm快速離心1min，用磁分離器吸附磁珠，去除殘余上清溶液；(9)將裝有磁珠的離心管開蓋放置在55℃的金屬浴上，晾干10min；(10)加入100ul洗脫緩沖液重懸磁珠，放置在65℃金屬浴上，震蕩洗脫10min；(11)用磁分離器吸附磁珠，取出含有目的DNA的緩沖液，定量DNA，做好標(biāo)記；(12)洗脫后的DNA存放于4℃冰箱待用，或者保存于-20℃冰箱長期保存。實施例二：亞硫酸氫鹽處理DNA亞硫酸氫鹽處理DNA是采用亞硫酸氫鹽試劑進行處理，亞硫酸氫鹽試劑由亞硫酸氫鹽緩沖液和保護緩沖液組成；亞硫酸氫鹽緩沖液為亞硫酸氫鈉(購自Sigma公司)和水的混合液體；保護緩沖液為氧自由基清除劑對苯二酚(購自sigma公司)和水的混合液體。蛋白變性劑為鹽酸胍(購自sigma公司)；pH緩沖劑為Tris-HCl(購自阿拉丁公司)；核酸酶抑制劑為EDTA(購自sigma公司)。本實施例試劑配方見表2。表2亞硫酸氫鹽處理DNA所用試劑本實施例二以實施例一提取得到的DNA為處理對象，采用亞硫酸氫鹽處理DNA，具體方法包括：(1)配制亞硫酸氫鹽緩沖液，稱取1g亞硫酸氫鈉粉末，加水配制成3M緩沖液。(2)配制保護緩沖液，稱取1g對苯二酚試劑，加水配置成0.5M保護緩沖液。(3)將100μlDNA溶液(DNA含量100ng)、200μl亞硫酸氫鹽緩沖液和50μl保護液混合，震蕩混合均勻。(4)熱循環(huán)：95℃5min，50℃30min，95℃5min，50℃2h，95℃5min，50℃5h，4℃。(5)將1mlDNA結(jié)合緩沖液加入到亞硫酸氫鹽處理后的DNA溶液中，再加入50μl磁珠，震蕩孵育1h。(6)用磁分離器吸附磁珠，丟棄上清溶液。(7)加入0.5ml清洗緩沖液A重懸磁珠，震蕩清洗1min。(8)用磁分離器吸附磁珠，丟棄上清。(9)加入0.5ml清洗緩沖液B重懸磁珠，震蕩清洗1min。(10)用磁分離器吸附磁珠，丟棄上清溶液。(11)10000rpm快速離心1min，用磁分離器吸附磁珠，去除殘余上清溶液。(12)將裝有磁珠的離心管放置在55℃的金屬浴上，開蓋晾干10min。(13)加入50μl洗脫緩沖液重懸磁珠，放置在65℃金屬浴上，震蕩洗脫10min。(14)用磁分離器吸附磁珠，取出含有目的DNA的緩沖液，定量DNA，做好標(biāo)記。實施例三：熒光定量PCR檢測DNA甲基化本實施例檢測基因為p16、CDH1、MGMT、RARB和RNF180基因，內(nèi)參基因為ACTB。內(nèi)參基因ACTB的內(nèi)參引物對為序列表的序列46所示DNA和序列表的序列47所示DNA組成的引物對；內(nèi)參基因ACTB的內(nèi)參探針的核苷酸序列如序列表的序列48所示。本實施例是采用實施例二經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理后的DNA為模板進行PCR擴增。熒光定量PCR擴增反應(yīng)體系的終濃度組成為：1×PCR緩沖液(購自NEB公司)、0.5mMdNTPs(購自NEB公司)、0.5μM目的基因檢測引物、0.2μM目的基因熒光探針、1μM目的基因封閉引物、0.3μM內(nèi)參基因引物、0.3μM內(nèi)參基因熒光探針、2ng/μl模板DNA、0.10U/μl熱啟動TaqDNA聚合酶(購自NEB公司)。引物和探針均購自上海生工公司，dNTPs中包括10mMdATP、10mMdCTP、10mMdTTP和10mMdGTP，PCR緩沖液中包含50mMTris-HCl、20mM氯化鉀、10mM硫酸銨和2mM氯化鎂。熒光定量PCR擴增反應(yīng)的具體過程為：95℃預(yù)變性10分鐘，再進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增階段，95℃變性10s，60℃退火延伸60s，并進行50個循環(huán)。待測DNA樣品、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品和無模板對照均進行3個復(fù)孔(平行樣)檢測，PCR儀孔板加樣布局見下表。表中PC代表陽性質(zhì)控品(PositiveControl)，NC代表陰性質(zhì)控品(NegativeControl)，NTC代表無模板對照(Notemplatecontrol)，S代表檢測樣本(sample)。表3PCR反應(yīng)加樣布局表123456789101112APCPCPCS6S6S6BNCNCNCS7S7S7CNTCNTCNTCS8S8S8DS1S1S1S9S9S9ES2S2S2S10S10S10FS3S3S3S11S11S11GS4S4S4S12S12S12HS5S5S5S13S13S13實施例四：引物、探針封和閉引物篩選對于p16、CDH1、MGMT、RARB和RNF180基因，可以設(shè)計很多套引物和探針的組合，而每一套探針引物組合的性能可能存在差別，所以需要通過實驗進行篩選。DNA甲基化標(biāo)志物基因的探針和內(nèi)參基因的探針5'端報告熒光基團為FAM、JOE、TET、HEX、Cy3、TexasRed、Rox、Cy5中的一種或多種；甲基化基因的探針和內(nèi)參基因的探針3'端的猝滅基團為BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL中一種或多種。甲基化基因的封閉引物3'端修飾集團為C3Spacer、C6Spacer、inverted3'end中的一種或多種。本發(fā)明使用HeavyMethyl的方法檢測基因甲基化，所以除了設(shè)計普通Taqman引物和探針外，還設(shè)計了封閉引物，封閉引物3’-OH引入化學(xué)修飾，DNA聚合酶無法擴增，因此用封閉引物結(jié)合到樣本中沒有發(fā)生甲基化的模板上，阻止其擴增，提高檢測反應(yīng)的特異性。本實施例中，用人工處理的甲基化和非甲基化模板對p16、CDH1、MGMT、RARB和RNF180基因的引物和探針進行篩選。具體步驟如下：設(shè)計p16、CDH1、MGMT、RARB和RNF180的各種引物和探針，只要其分別能等同于、互補于或雜交于序列表的序列1所示、序列表的序列2所示、序列表的序列3所示、序列表的序列4所示和序列表的序列5所示的序列的至少15個核苷酸及其互補序列；再用人工合成的甲基化和非甲基化核酸序列做為模板驗證引物和探針的有效性；最后通過PCR擴增結(jié)果篩選出以下10套最佳的引物和探針組合：引物和探針組1(擴增甲基化p16基因)引物1：SEQIDNO6:5’-AGTAGCGTTCGTATTTTTTTTATTCG-3’引物2：SEQIDNO7:5’-AAAAACAACATAAAACCTTCGACT-3封閉引物：SEQIDNO8:5’-ATTTTTTTTATTTGATTTTGGGTTGTGGTTGTGGT-C3-3’探針：SEQIDNO9:FAM-5’-CTAACCACGACCGCGACCCGAAATCG-BHQ1-3’引物和探針組2(擴增甲基化p16基因)引物1：SEQIDNO10:5’-CGTCGTTCGTTGTTTGTTTTTT-3’引物2：SEQIDNO11:5’-AACTAACTAATCACCAAAA-3’封閉引物：SEQIDNO12:5’-GTTTGTTTTTTTTTTTTTTGTAGTTGTTGAGTGTATGTG-C3-3’探針：SEQIDNO13:FAM-5’-CGAACCGCGTACGCTCGACGACTACG-BHQ1-3’引物和探針組3(擴增甲基化CDH1基因)引物1：SEQIDNO14:5’-GTGGGCGGGTCGTTAGTTTC-3’引物2：SEQIDNO15:5’-CGCTAATTAACTAAAAATTCACCTACCG-3’封閉引物：SEQIDNO16:5’-AATTCACCTACCAACCACAACCAATCAACAACACAAA-C3-3’探針：SEQIDNO17:5’-JOE-TTCGCGTTGTTGATTGG-MGB-3’引物和探針組4(擴增甲基化CDH1基因)引物1：SEQIDNO18:5’-TTTTAGTTCGGTTCGATTCGATCG-3’引物2：SEQIDNO19:5’-CGGCTCCAAAAACCCATAACTAAC-3’封閉引物：SEQIDNO20:5’-TGATTTGATTGTATTTGGTGTTTGTTTTTGTTTGGTGTTTTTG-C3-3’探針：SEQIDNO21:5’-JOE-CGAAAACGCCGAACGAAAACAAACGCCG-BHQ1-3’引物和探針組5(擴增甲基化MGMT基因)引物1：SEQIDNO22:5’-GCGTTTCGACGTTCGTAGGT-3’引物2：SEQIDNO23:5’-CACTCTTCCGAAAACGAAACG-3’封閉引物：SEQIDNO24:5’-TGTTTGTAGGTTTTTGTGGTGTGTATTGTTTGTGAT-C3-3’探針：SEQIDNO25:5’-TexasRed-CGCAAACGATACGCACCGCGA-BHQ2-3’引物和探針組6(擴增甲基化MGMT基因)引物1：SEQIDNO26:5’-GGGTAGCGGCGTTGTCGGAGGATT-3’引物2：SEQIDNO27:5’-CGACGACGCCGAACCTAAAAC-3’封閉引物：SEQIDNO28:5’-TGTTGTTGGAGGATTAGGGTTGGTGTGTTGGTGTTTAGTG-C3-3’探針：SEQIDNO29:5’-TexasRed-CGCATCCTCGCTAAACGCCGACACGCCG-BHQ2-3’引物和探針組7(擴增甲基化RARB基因)引物1：SEQIDNO30:5’-ATGTCGAGAACGCGAGCGATTCG-3’引物2：SEQIDNO31:5’-GCAAAAAGCCTTCCGAATGCGTTC-3’封閉引物：SEQIDNO32:5’-CCAAATACATTCCAAATCCTACCCCAACAATACCCAA-C3-3’探針：SEQIDNO33:5’-Cy5-TTGGGTATCGTCGGGGTA-BHQ3-3’引物和探針組8(擴增甲基化RARB基因)引物1：SEQIDNO34:5’-GGCGAGGCGGTGGGCG-3’引物2：SEQIDNO35:5’-GCAAAAAGCCTTCCGAATGCGTTC-3’封閉引物：SEQIDNO36:5’-TGGTGGGTGGGAGGTGAGTGGGTGTAGGTGGAATATTG-C3-3’探針：SEQIDNO37:5’-Cy5-CGATATTCCGCCTACGCCCGCTCG-BHQ3-3’引物和探針組9(擴增甲基化RNF180基因)引物1：SEQIDNO38：5’-AGTTTTTAGAGTTTGGTTGTTGG-3’引物2：SEQIDNO39：5’-ACCTTTACCTATATCCACGTCC-3’封閉引物：SEQIDNO40：5’-GGTTGTTGGTGGTTGGGAGTGTTGGGATGGGGTGTGAAGTTG-C3-3’探針：SEQIDNO41：5’-FAM-CGACTTCGCGCCCCGTCCCGACGCTCCCG-BHQ1-3’引物和探針組10(擴增甲基化RNF180基因)引物1：SEQIDNO42：5’-CGAGTAGGGTCGTTGGTTGTGG-3’引物2：SEQIDNO43：5’-CGAACTATACCTACAACCCCGAC-3’封閉引物：SEQIDNO44：5’-TGTTGGTTGTGGTGGGTGAGTGTTGGGGTGTTATGTTTG-C3-3’探針：SEQIDNO45：5’-FAM-CGCGACCTCGAACGTAACGCCCCGACG-BHQ1-3’實驗結(jié)果證明引物和探針的設(shè)計是合理的，10組引物和探針均能區(qū)分甲基化和非甲基化模板，分別可以作為檢測p16、CDH1、MGMT、RARB和RNF180基因甲基化的引物和探針，檢測Ct值見表4，其中“No”表示“NoCt”。雖然不同的引物和探針組合效果略有不同，但是以上引物和探針分別適用于p16、CDH1、MGMT、RARB和RNF180基因的甲基化檢測。表4不同組合物檢測甲基化和非甲基化模板的Ct值均值組1組2組3組4組5組6組7組8組9組10甲基化模板35.3235.7637.2836.7737.5637.9336.3436.8534.5434.77非甲基化模板NoNoNoNoNoNoNoNoNoNo采用不同癌癥患者和正常人DNA作為模板進一步篩選引物和探針組合物。將5例胃癌、5例肺癌、2例肝癌和5例正常人的血漿樣本(購自北京301醫(yī)院)采用實施例一的DNA提取方法提取DNA，然后采用實施例二的方法，采用亞硫酸氫鹽處理DNA模板，利用上述10組引物和探針，采用實施例三的方法進行熒光定量PCR實驗。分別測得癌癥樣本和正常人樣本的各種甲基化基因Ct值，具體見表5。表5不同組合物檢測癌癥和正常人樣本的Ct值組1組2組3組4組5組6組7組8組9組10胃癌136.5636.7839.2338.4938.7938.7740.7140.7236.1538.8胃癌237.1337.3138.9939.4138.4238.0840.7139.7737.5837.26胃癌337.2337.4540.1139.5938.738.6539.6940.0138.6338.53胃癌436.2236.5938.4539.3939.1838.2240.2740.8538.6737.59胃癌536.8337.0239.7338.5538.3439.8340.8840.8338.1736.22肺癌143.6545.8846.8647.7447.56NoNo47.14No44.66肺癌246.12No46.43NoNo43.35NoNo47.51No肺癌347.544.4244.1445.7546.2745.3749.4648.35No42.25肺癌4No43.63NoNo43.94No44.61No45.92No肺癌547.6148.944.2244.96No45.06No45.01No43.07肝癌148.3243.6348.38No49.09No44.31No44.77No肝癌247.6148.9No48.23No45.7NoNoNo45.77正常人1No47.56No47.23NoNoNo49.23No47.77正常人2NoNo47.12NoNo48.34NoNo47.81No正常人346.89NoNo49.12NoNo48.23NoNo49.25正常人4No48.65NoNo49.01NoNo47.89NoNo正常人5NoNo48.88NoNo48.36NoNo48.23No從以上癌癥患者和正常人樣本的p16、CDH1、MGMT、RARB和RNF180基因甲基化檢測的Ct值可以看出，以上10組引物和探針對胃癌甲基化DNA有高度擴增，其它癌癥和正常人無擴增或者擴增Ct值大于45。雖然不同組的引物和探針對胃癌樣本的擴增Ct值有些差異，但都明顯區(qū)別于其它癌癥很正常人樣本，因此以上引物組均適用于胃癌早期檢測。在實際應(yīng)用中可采用單組引物和探針檢測目的基因甲基化，也可以兩組或兩組以上聯(lián)合使用。實施例五：試劑盒檢測胃癌、正常人血漿的靈敏度和特異性本實施例采用300例正常人和300例胃癌患者的血漿樣本(購自北京301醫(yī)院)為檢測對象測試我們的胃癌檢測試劑的靈敏度和特異性。采用實施例一的DNA提取方法提取DNA，然后采用實施例二的方法，采用亞硫酸氫鹽處理DNA模板，利用實施例四的探針引物組，采用實施例三的內(nèi)參基因ACTB的內(nèi)參引物和相關(guān)方法進行熒光定量PCR實驗，檢測p16、CDH1、MGMT、RARB和RNF180基因和內(nèi)參基因ACTB，最后得出正常人和胃癌患者樣本的Ct值。檢測p16基因采用的是引物和探針組1，檢測CDH1基因采用的是引物和探針組4，檢測MGMT基因采用的是引物和探針組5，檢測RARB基因采用的是引物和探針組7，檢測RNF180基因采用的是引物和探針組10，內(nèi)參基因ACTB的內(nèi)參引物對為序列表的序列46所示DNA和序列表的序列47所示DNA組成的引物對；內(nèi)參基因ACTB的內(nèi)參探針的核苷酸序列如序列表的序列48所示。根據(jù)p16、CDH1、MGMT、RARB和RNF180各自的ROC曲線，見圖1-5所示，確定各自的Cutoff值為37.4、40.64、40.12、41.07和38.89，即樣本Ct值小于Cutoff值為陽性，樣本Ct值大于Cutoff值為陰性，在此判定標(biāo)準(zhǔn)下單標(biāo)志物的靈敏度最高。將五個標(biāo)志物組合在一起來檢測胃癌，只要有一個基因為陽性，即判定該樣本為陽性，其它視為陰性，ROC曲線見圖6。根據(jù)上述判定標(biāo)準(zhǔn)以及表6的檢測結(jié)果，p16的靈敏度為76％、CDH1的靈敏度為77.67％、MGMT的靈敏度為67.33％、RARB的靈敏度為62％，RNF180的靈敏度為72％，五個標(biāo)志物聯(lián)合檢測時，靈敏度提高到96％，特異性為80％。表6檢測p16、CDH1、MGMT、RARB和RNF180基因甲基化診斷胃癌靈敏度和特異性為了達到不同的預(yù)期用途和目的，本發(fā)明提供的檢測試劑盒，可以通過調(diào)整Cutoff值達到不同的靈敏度和特異性指標(biāo)。在實施例五中，為了提高靈敏度，設(shè)定Cutoff值并不代表本發(fā)明僅能用此為Cutoff值，可以根據(jù)本發(fā)明提供的ROC曲線，選取不同的Cutoff值作為判定標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明提供的技術(shù)方案，通過聯(lián)合利用分別用于檢測p16、CDH1、MGMT、RARB和RNF180基因及其片段的甲基化的核酸序列，使得胃癌檢測的靈敏度和特異性得到了提高，從而保證了檢測結(jié)果的正確性和可靠性。并且，通過利用實時PCR分析血漿樣本中的DNA的方法，能方便地實現(xiàn)針對p16、CDH1、MGMT、RARB和RNF180這五個生物標(biāo)記物的同時檢測，并且能根據(jù)實時PCR的循環(huán)閾值(Ct)值來快速、便捷地判斷樣本是否呈陽性，提供了一種用于無創(chuàng)性的快速癌癥的檢測方法的試劑盒。最后，本申請還公開了至少一組的效果較好的、設(shè)計達到最優(yōu)化的用于檢測p16、CDH1、MGMT、RARB和RNF180基因及其片段是否甲基化的引物和探針組合及其篩選方法，確保檢測效果達到最優(yōu)化。需要注意的是，除非另有說明，本申請使用的技術(shù)術(shù)語或者科學(xué)術(shù)語應(yīng)當(dāng)為本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的通常意義。除非另外具體說明，否則在這些實施例中闡述的部件和步驟的相對步驟、數(shù)字表達式和數(shù)值并不限制本發(fā)明的范圍。在這里示出和描述的所有示例中，除非另有規(guī)定，任何具體值應(yīng)被解釋為僅僅是示例性的，而不是作為限制，因此，示例性實施例的其他示例可以具有不同的值。最后應(yīng)說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求和說明書的范圍當(dāng)中。SEQUENCELISTING<110>北京艾克倫醫(yī)療科技有限公司<120>基于多個基因診斷胃癌患者的實時定量PCR檢測試劑盒<130>1<160>51<170>PatentInversion3.3<210>1<211>2861<212>DNA<213>人（HomoSapiens）<400>1aatttttctctctctctttctctctttctttctttcgacaaagtctcactctgtcaccca60ggctggagtgaagtggctccatctcgctgttcactacaacctcagcctcccgggttcaag120cgattctcctgcctcaacctcccgagtagctgggattacaggcgcctgccaccacccccg180gctactttttgtatttttagtagaggcgaggtttcacctgttggccaggctggtctcgaa240ctcccgacctcaggtgattccccccgccttgatctcccaaagtgaagggattacaaggcg300tgaggcaccgcgcccggccgcttctgaataatttcgatcaaaatttatattcgatattta360ttccaacatacaccacagatttccactgataatccctcctagtaagaaagataagctcca420tccaggtatctgtgaattggaggctaagtagtcccagcacatcttacatttctttaagac480tccctttttatcccaaacgttcgtaaattttgtatctgataaagagcatacttccatcta540atacaaatatgttccccccttcagatcttctcagcattcgagagatctgtacgcgcgtgg600ctcctcattcctcttccttggcttcccaagcccccagggcgtcgccaggaggaggtctgt660gattacaaaccccttctgaaaactccccaggaagcctcccctttttccggagaatcgaag720cgctacctgattccaattcccctgcaaacttcgtcctccagagtcgcccgccatcccctg780ctcccgctgcagaccctctacccacctggatcggcctccgaccgtaactattcggtgcgt840tgggcagcgcccccgcctccagcagcgcccgcacctcctctacccgaccccgggccgcgg900ccgtggccagccagtcagccgaaggctccatgctgctccccgccgccggctccatgctgc960tccccgccgcccgctgcctgctctccccctctccgcagccgccgagcgcacgcggtccgc1020cccaccctctggtgaccagccagcccctcctctttcttcctccggtgctggcggaagagc1080cccctccgaccctgtccctcaaatcctctggagggaccgcggtatctttccaggcaaggg1140gacgccgtgagcgagtgctcggaggaggtgctattaactccgagcacttagcgaatgtgg1200cacccctgaagtcgccccaggttgggtctcccccgggggcaccagccggaagcagccctc1260gccagagccagcgttggcaaggaaggaggactgggctcctccccacctgccccccacacc1320gccctccggcctccctgctcccagccgcgctcccccgcctgccagcaaaggcgtgtttga1380gtgcgttcactctgttaaaaagaaatccgcccccgccccgtttccttcctccgcgataca1440accttcctaactgccaaattgaatcggggtgtttggtgtcatagggaaagtatggcttct1500tcttttaatcataagaaaaagcaaaactattctttcctagttgtgagagccccaccgaga1560atcgaaatcacctgtacgactagaaagtgtccccctaccccctcaacccttgattttcag1620gagcgcggggttcactaagtcagaaaccctagttcaaaggattccttttggagagtcgga1680ctgctctctccttcccctccccttcccctcctgcgtgtaaaacggctgtctggggcaagg1740gtttctcagacgtgtacattgcctggtataagagcagact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