Chka基因在制備食管癌診治產(chǎn)品中的應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了CHKA基因可以作為食管癌早期診斷的分子標志物。本發(fā)明的實驗證明，與正常食管組織相比，食管癌組織中的CHKA基因表達顯著升高，且經(jīng)過RNA干擾實驗證明CHKA能夠影響食管癌細胞的增殖。根據(jù)本發(fā)明的研究成果，可以研發(fā)能夠抑制CHKA基因表達的藥物，從而實現(xiàn)臨床上對于食管癌的預防和治療。
【專利說明】
CHKA基因在制備食管癌診治產(chǎn)品中的應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術領域，具體地涉及CHKA基因在食管癌的診斷、治療中的用途。
【背景技術】
[0002] 食管癌作為一種消化系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴重威脅人們身體健康、影響生活質量。據(jù)流 行病學調查顯示，我國是全球食管癌的高發(fā)地帶，每年因食管癌死亡人數(shù)達15萬余人，位居 世界食管癌死亡人數(shù)的第一位。食管癌的發(fā)生與飲食習慣、致癌物質、疾病、遺傳、環(huán)境等因 素都密切相關。目前，治療食管癌的臨床方法主要有手術療法、放射療法、化療藥物療法、包 括內鏡療法在內的非手術療法等。但食管癌早期診斷困難，且惡性程度高，一經(jīng)診斷，已至 晚期，所以目前食管癌的治療效果和預后仍然很差，5年生存率仍低于30%。隨著分子生物 學在腫瘤病因學研究方面的發(fā)展，人們對食管癌的發(fā)病原因逐步有了新的認識。目前普遍 認為食管癌的發(fā)生涉及多種因素，多種基因，并且在多階段發(fā)揮作用，利用在分子生物手段 對其早期診斷、治療及預防具有重要意義。

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種可用于食管癌早期診斷的分子標志物。相比現(xiàn)有的食 管癌的診斷方法，使用基因標志物來診斷食管癌的具有及時性、特異性和靈敏性，從而使患 者在疾病早期就能知曉疾病風險，針對風險高低，采取相應的預防和治療措施。
[0004] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：
[0005] 本發(fā)明提供了檢測CHKA基因表達的產(chǎn)品在制備診斷食管癌的工具中的應用。
[0006] 進一步，所述檢測CHKA基因表達的產(chǎn)品包括檢測CHKA基因 mRNA水平的產(chǎn)品、和/或 檢測CHKA蛋白水平的產(chǎn)品。
[0007] 進一步，所述檢測CHKA基因表達的產(chǎn)品包括:通過RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢 測、原位雜交或芯片檢測CHKA基因表達以診斷食管癌的產(chǎn)品。
[0008] 進一步，所述用RT-PCR診斷食管癌的產(chǎn)品至少包括一對特異擴增CHKA基因的引 物;所述用實時定量PCR診斷食管癌的產(chǎn)品至少包括一對特異擴增CHKA基因的引物;所述用 免疫檢測診斷食管癌的產(chǎn)品包括:與CHKA蛋白特異性結合的抗體;所述用原位雜交診斷食 管癌的產(chǎn)品包括:與CHKA基因的核酸序列雜交的探針;所述用芯片診斷食管癌的產(chǎn)品包括： 蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括與CHKA蛋白特異性結合的抗體，基因芯片包括與 CHKA基因的核酸序列雜交的探針。
[0009] 所述用實時定量PCR診斷食管癌的產(chǎn)品至少包括的一對特異擴增CHKA基因的引物 如SEQIDN0·3和SEQIDN0·4所示。
[0010] 所述檢測CHKA基因表達的產(chǎn)品可以是檢測CHKA基因表達的試劑、也可以是包含所 述試劑的試劑盒、芯片、試紙等，也可以是使用所述試劑的高通量測序平臺。
[0011] 所述診斷食管癌的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺；高 通量測序平臺是一種特殊的診斷食管癌的工具，隨著高通量測序技術的發(fā)展，對一個人的 基因表達譜的構建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正常人群的基因表達譜， 容易分析出哪個基因的異常與疾病相關。因此，在高通量測序中獲知CHKA基因的異常與食 管癌相關也屬于CHKA基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護范圍之內。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種診斷食管癌的工具，所述工具包括檢測CHKA基因表達的試 劑;所述試劑包括檢測CHKA基因 mRNA的引物和/或探針、檢測CHKA蛋白的抗體。
[0013] 所述工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺。
[0014] 其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白質芯片;所述基因芯片包括固相載體以及固定 在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測CHKA基因轉錄水平的針對 CHKA基因的寡核苷酸探針;所述蛋白質芯片包括固相載體以及固定在固相載體的CHKA蛋白 的特異性抗體;所述基因芯片可用于檢測包括CHKA基因在內的多個基因（例如，與食管癌相 關的多個基因）的表達水平。所述蛋白質芯片可用于檢測包括CHKA蛋白在內的多個蛋白質 (例如與食管癌相關的多個蛋白質）的表達水平。通過將多個與食管癌的標志物同時檢測， 可大大提高食管癌診斷的準確率。
[0015] 其中，所述試劑盒包括基因檢測試劑盒和蛋白免疫檢測試劑盒;所述基因檢測試 劑盒包括用于檢測CHKA基因轉錄水平的試劑;所述蛋白免疫檢測試劑盒包括CHKA蛋白的特 異性抗體。進一步，所述試劑包括使用RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢測、原位雜交或芯片方 法檢測CHKA基因表達水平過程中所需的試劑。優(yōu)選度，所述試劑包括針對CHKA基因的引物 和/或探針。根據(jù)CHKA基因的核苷酸序列信息容易設計出可以用于檢測CHKA基因表達水平 的引物和探針。
[0016] 所述試紙包括檢測CHKA基因表達的試劑。
[0017] 所述高通量測序平臺包括檢測CHKA基因表達的試劑。
[0018] 與CHKA基因的核酸序列雜交的探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其它衍 生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結合，任 何長度都可以。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個堿基長度。同樣，所述探針的長 度可長至60、80、100、150、300個堿基對或更長，甚至整個基因。由于不同的探針長度對雜交 效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個堿基對，最長一般不超過 30個堿基對，與目的核苷酸序列互補的長度以15-25個堿基對最佳。所述探針自身互補序列 最好少于4個堿基對，以免影響雜交效率。
[0019] 進一步，所述CHKA蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述CHKA蛋白 的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾(例如，，嵌合抗體、scFv、Fab、F (ab'）2、Fv等。只要所述片段能夠保留與CHKA蛋白的結合能力即可。用于蛋白質水平的抗體 的制備時本領域技術人員公知的，并且本發(fā)明可以使用任何方法來制備所述抗體。
[0020] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述檢測CHKA基因 mRNA的引物包括SEQ ID N0.3和 SEQ ID NO.4所示的引物對。
[0021 ]本發(fā)明還提供了CHKA基因和/或其表達產(chǎn)物的抑制劑在制備治療食管癌的藥物中 的應用。所述抑制劑包括抑制CHKA基因表達的試劑、和/或抑制CHKA基因表達產(chǎn)物的試劑。 [0022] 進一步，所述抑制CHKA基因表達的試劑包括抑制基因轉錄的試劑、抑制基因翻譯 的試劑;所述抑制CHKA基因表達產(chǎn)物的試劑包括抑制CHKA基因 mRNA的試劑、抑制CHKA蛋白 的試劑。所述抑制CHKA基因 mRNA的試劑包括抑制mRNA穩(wěn)定性的試劑、抑制mRNA翻譯活性的 試劑。所述抑制CHKA蛋白的試劑包括抑制CHKA蛋白穩(wěn)定性的試劑、抑制CHKA蛋白活性的試 劑、抑制CHKA蛋白功能的試劑。
[0023] 進一步，抑制CHKA基因 mRNA的試劑包括針對CHKA基因 mRNA的雙鏈核糖核酸;抑制 CHKA蛋白功能的試劑包括CHKA抗原蛋白的腫瘤疫苗、抑制CHKA蛋白功能的抗體。所述抗體 可以是多克隆抗體，或是單克隆抗體。
[0024] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述針對CHKA基因 mRNA的雙鏈核糖核酸是siRNA。為 了確保CHKA基因能夠被高效剔除或沉默，根據(jù)CHKA基因的mRNA序列設計了 s iRNA特異性片 段。siRNA的設計根據(jù)已發(fā)表的通用設計原則（Elbashir et.al 2001，Schwarz et.al 2003,Khvorova et.al 2003,Reynolds et.al 2004,Hsieh et.al 2004,Ui-Tei et.al 2004)，通過在線工具完成設計，該在線工具為：siRNASelectionProgram of Whitehead Institute(BingbingYuan et.al 2004，http://jura·wi.mit·edu/bioc/siRNAext/)和 BLOCK-iTTM RNAi Designer ofINVITR0GEN(winner of the 2004Frost&Sul1ivan Excellence in Research Award，https ://rnaidesigner · invitrogen · com/sirna/) 〇為了 進一步提高siRNA片斷的有效性，綜合兩個在線設計工具的優(yōu)點來設計用于篩選的siRNA片 斷。最后，通過同源性比對(NCBI BLAST)來過濾siRNA序列，以提高siRNA片斷的特異性并減 少RNAi干擾的脫靶效應。
[0025] 優(yōu)選地，所述siRNA的序列如SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示。
[0026] 本發(fā)明還提供了一種用于治療食管癌的藥物組合物，所述藥物組合物包括上面所 述的CHKA基因和/或其表達產(chǎn)物的抑制劑。
[0027] 本發(fā)明的藥物組合物還包括藥學上可接受的載體，其中該載體可為賦形劑、稀釋 劑、增稠劑、填充劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑、油脂或非油脂的基劑、表面活性劑、懸浮劑、膠 凝劑、輔助劑、防腐劑、抗氧化劑、穩(wěn)定劑、著色劑或香料其中之一或兩者以上的混合。
[0028] 本發(fā)明的藥物組合物可用于制造治療食管癌的藥劑。
[0029] 本發(fā)明的藥物組合物首選應用于哺乳動物，其中該哺乳動物優(yōu)選為人類病患。
[0030] 本發(fā)明的藥物組合物可例如以口服、注射等方式給予至該人類病患體內。
[0031 ]本發(fā)明的藥物組合物還可與其他治療食管癌的藥物聯(lián)用，多種藥物聯(lián)合使用可以 大大提到治療的成功率。
[0032]在本發(fā)明的上下文中，"CHKA基因"包括CHKA基因以及CHKA基因的任何功能等同物 的多核苷酸。CHKA基因包括與目前國際公共核酸序列數(shù)據(jù)庫GeneBank中CHKA基因（NC_ 000011.10)DNA序列具有70%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列；
[0033] 優(yōu)選地，CHKA基因的編碼序列包括以下任一一種DNA分子：
[0034] (1)序列表中SEQ ID N0· 1所不的DNA序列；
[0035] (2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白質的DNA序列；
[0036] (3)與（1)或(2)限定的DNA序列具有70%、優(yōu)選地，90%以上同源性，且編碼相同功 能蛋白質的DNA分子。
[0037]在本發(fā)明的具體實施方案中，所述CHKA基因的編碼序列是SEQ ID NO. 1所示的DNA 序列。
[0038] 在本發(fā)明的上下文中，CHKA基因表達產(chǎn)物包括CHKA蛋白以及CHKA蛋白的部分肽。 所述CHKA蛋白的部分肽含有與食管癌相關的功能域。
[0039 ] "CHKA蛋白"包括CHKA蛋白以及CHKA蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括 CHKA蛋白保守性變異蛋白質、或其活性片段，或其活性衍生物，等位變異體、天然突變體、誘 導突變體、在高或低的嚴緊條件下能與CHKA的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白質。
[0040]優(yōu)選地，CHKA蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白質：
[0041] (1)由序列表中SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0042] (2)將SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且與SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID N0.2所示的氨 基酸序列衍生的蛋白質。取代、缺失或者添加的氨基酸的個數(shù)通常為1-50個，較佳地1-30 個，更佳地1-20個，最佳地1-10個。
[0043] (3)與SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性(又稱為序列同一性）， 更優(yōu)選地，與SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列至少約90%至95%的同源性，常為96%、97%、 98 %、99 %同源性的氨基酸序列構成的多肽。
[0044]在本發(fā)明的具體實施方案中，所述CHKA蛋白是具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序 列的蛋白質。
[0045] 通常，已知的是，一個蛋白質中一個或多個氨基酸的修飾不會影響蛋白質的功能。 本領域技術人員會認可改變單個氨基酸或小百分比的氨基酸或對氨基酸序列的個別添加、 缺失、插入、替換是保守修飾，其中蛋白質的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白質。提供功能相 似的氨基酸的保守替換表是本領域公知的。
[0046] 通過添加一個氨基酸或多個氨基酸殘基修飾的蛋白質的例子是CHKA蛋白的融合 蛋白。對于與CHKA蛋白融合的肽或者蛋白質沒有限制，只要所得的融合蛋白保留CHKA蛋白 的生物學活性即可。
[0047]本發(fā)明的CHKA蛋白也包括對SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列的非保守修飾，只要 經(jīng)過修飾的蛋白質仍然能夠保留CHKA蛋白的生物學活性即可。在此類修飾蛋白質中突變的 氨基酸數(shù)目通常是10個或者更少，例如6個或者更少，例如3個或者更少。
[0048]在本發(fā)明的上下文中，"診斷食管癌"既包括判斷受試者是否已經(jīng)患有食管癌、也 包括判斷受試者是否存在患有食管癌的風險。
[0049] 在本發(fā)明的上下文中，"治療食管癌"從疾病的狀態(tài)變化來分，可以包括疾病的緩 解、疾病的完全治愈，還包括用于評價疾病的治療效果。
[0050] 本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：
[0051] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了CHKA基因表達與食管癌相關，通過檢測受試者組織中CHKA的表 達，可以判斷受試者是否患有食管癌、或者判斷受試者是否存在患有食管癌的風險，從而指 導臨床醫(yī)師給受試者提供預防方案或者治療方案。
[0052]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種新的分子標記物-CHKA基因，相比傳統(tǒng)的檢測手段，基因診斷更 及時、更特異、更靈敏，能夠實現(xiàn)食管癌的早期診斷，從而降低食管癌的死亡率。
【附圖說明】
[0053]圖1顯示利用基因芯片檢測CHKA基因在食管癌組織與正常食管組織中的表達情 況；
[0054] 圖2顯示利用Western blot檢測CHKA蛋白在食管癌組織與正常食管組織中的表達 情況；
[0055] 圖3顯示利用QPCR檢測s iRNA對CHKA基因的干擾效率；
[0056] 圖4顯示利用Western blot檢測siRNA對CHKA蛋白表達的影響；
[0057]圖5顯示抑制CHKA蛋白功能對食管癌細胞增殖的影響。
[0058]具體的實施方式
[0059] 下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件，例如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?New York:Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0060] 實施例1 CHKA基因的差異表達 [0061 ] 1、實驗材料：
[0062]食管癌組織為醫(yī)院胸外科手術切除的標本，正常食管組織為胃鏡室鏡下取出的標 本，手術切除的食管腫瘤組織離體后立即取材，取材時均佩戴一次性無菌手套，應用高壓滅 菌的手術刀片切取。
[0063]所有病例均經(jīng)病理確診。包括食管癌組織40例，正常食管組織30例。其中食管鱗癌 34例，食管腺癌6例。以正常食管組織作為對照組。所有患者術前均病理證實，術前均未行放 療、化療等治療，且無其他部位的腫瘤等。所有組織均在手術半小時內液氮保存后，移入-80 度冰箱凍存。
[0064] 2、食管癌組織和正常食管組織的RNA的獲取
[0065] 使用Tr i ζ ο 1-步法提取食管癌組織和正常食管組織的總RNA，通過Nano drop ND-1000讀取260nm和280nm處的吸光度值(A)測定RNA溶液的純度。經(jīng)1 %甲醛變性瓊脂糖凝膠 電泳，紫外透射光下觀察，檢測RNA的完整性。
[0066] 3、基因芯片雜交及掃描
[0067] 總RNA經(jīng)線性化擴增后，cy3-UTP標記，熒光標記后的cRNAs采用RNEASY Mini Kit 純化，用Amhion的RNA Fragmentation Reagents對標記好的cRNAs進行片段化處理。采用美 國Agilent公司的人全基因表達譜芯片(4x 44K基因），在芯片雜交爐中65°C雜交17h，然后 洗脫、染色，最后用Agilent DNA MicroarrayScanner掃描儀掃描。
[0068] 4、芯片數(shù)據(jù)處理與分析
[0069] 雜交后的芯片經(jīng)芯片掃描儀讀取數(shù)據(jù)點后，將數(shù)據(jù)導入分析軟件，對于兩組比值 的自然對數(shù)絕對值大于2.0或小于0.5的基因作為差異表達基因。
[0070] 5、統(tǒng)計學處理
[0071] 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，組間差異比較采用單因素方差分析法，P〈 0.05差異有顯著性意義。
[0072] 6、結果
[0073] 結果顯示(如圖1所示），與正常食管組織相比，食管癌組織中CHKA基因的mRNA水平 顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P〈〇.05)。
[0074]實施例2CHKA蛋白的差異表達 [0075] 1、研究對象同實施例1。
[0076] 2、提取組織總蛋白
[0077] 按照EpiQuik組織/細胞總蛋白提取試劑盒的說明書進行蛋白提取的操作。
[0078] 3、Western blot檢測
[0079] 將提取的蛋白定量進行SDS-PAGE電泳，之后進行轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、 顯色。
[0080] 4、統(tǒng)計學處理
[0081 ]將蛋白條帶的灰度值使用Image J軟件進行分析，以β-actin為內參，將CHKA蛋白 條帶的灰度值進行歸一化處理。結果數(shù)據(jù)都是以平均值±標準差的方式來表示，采用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當P〈0.05時具有統(tǒng) 計學意義。
[0082] 5、結果
[0083]結果如圖2所示，與正常食管組織相比，食管癌組織中CHKA蛋白的表達水平顯著增 加，差異具有統(tǒng)計學意義(P〈〇. 05)。
[0084] 實施例3抑制CHKA基因表達
[0085] l、siRNA 設計合成
[0086] 針對 CHKA 的 siRNA 序列：
[0087] siRNAl-CHKA：
[0088] 正義鏈為5'-AUUCUUCAGUAUCUAAUCGCC-3'（SEQ ID N0.7);
[0089] 反義鏈為5'-CGAUUAGAUACUGAAGAAUUA-3'（SEQ ID N0.8)，
[0090] siRNA2-CHKA：
[0091] 正義鏈為5'-AUGAAAUGUAGCCAUUUUCUC-3'（SEQ ID N0.9);
[0092] 反義鏈為5'-GAAAAUGGCUACAUUUCAUGG-3'（SEQ ID N0.10)，
[0093] siRNA3-CHKA：
[0094] 正義鏈為5'-AAGAUAUUACCUUCUUGACAG-3'（SEQ ID N0.11);
[0095] 反義鏈為5'-GUCAAGAAGGUAAUAUCUUGU-3'（SEQ ID N0.12)
[0096] 以上s i RNA序列與陰性對照s i RNA序列（s i RNA-NC)均由上海吉瑪制藥技術有限公 司提供：
[0097] 2、食管癌細胞的培養(yǎng)與轉染
[0098] 2.1細胞培養(yǎng)
[0099]食管癌細胞系ECA109接種于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中、將其放置于37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，待細胞達80 %融合時，用0.25 %胰蛋白酶消化傳代。
[0100] 2.2細胞轉染
[0101] 將食管癌細胞按1 X 104/孔接種到24孔細胞培養(yǎng)板中，在37°C、5%C02培養(yǎng)箱中細 胞培養(yǎng)24h，轉染按照脂質體轉染試劑2000(購自于Invitrogen公司）的說明書轉染，實驗分 為、陰性對照組和實驗組(20nM)，其中，陰性對照組siRNA與CHKA基因的序列無同源性，濃度 為20nM/孔，同時分別轉染。
[0102] 2、利用QPCR實驗檢測s iRNA的干擾效率。
[0103] 2.1提取細胞總RNA利用常規(guī)方法進行操作。
[0104] 2.2逆轉錄
[0105] 利用TAKARA公司的逆轉錄試劑盒進行RNA的逆轉錄。
[0106] 2.3QPCR
[0107] (1)引物設計
[0108] 根據(jù)Genbank中CHKA基因和GAPDH基因的編碼序列設計QPCR擴增引物，由上海生工 生物工程技術服務有限公司合成。具體引物序列如下：
[0109] CHKA 基因：
[0110] 正向引物為5'-TTGCTTGAATCTACTCCAT-3'（SEQ ID N0.3);
[0111] 反向引物為5'-CTGTAATTGTAACTGCTGTAT-3'（SEQ ID N0.4),
[0112] GATOH 基因：
[0113] 正向引物為5'-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3'（SEQ ID N0.5);
[0114] 反向引物為5'-GGTGGAATCATATTGGAACA-3'（SEQ ID N0.6)。
[0115] (2)按照表1配制PCR反應體系：
[0116] 其中，SYBR Green聚合酶鏈式反應體系購自Invitrogen公司。
[0117] 表1PCR反應體系
[0119] (3)PCR反應條件：95°C10min，（95°C15s，60°C40s)*40個循環(huán)。以SYBR Green作為 熒光標記物，在Light Cycler熒光定量PCR儀上進行PCR反應，通過融解曲線分析和電泳確 定目的條帶，△△ CT法進行相對定量。
[0120] 2.4統(tǒng)計學方法
[0121]實驗都是按照重復3次來完成的，結果數(shù)據(jù)都是以平均值土標準差的方式來表示， 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，干擾CHKA基因表達組與對照組之間的差異采用 t檢驗，認為當P〈0.05時具有統(tǒng)計學意義。
[0122] 2.5 結果
[0123] 結果如圖3所示，與s i RNA2-CHKA、s i RNA3-CHKA相比，s i RNA1 -CHKA能夠更有效的抑 制CHKA基因的表達，差異具有統(tǒng)計學意義(P〈0.05)，使用siRNAl-CHKA進行后續(xù)的實驗。
[0124] 3、Western blot實驗檢測siRNAl-CHKA的干擾效率
[0125] 步驟同實施例2。
[0126] 結果如圖4所示，與轉染s iRNA-NC組相比，轉染s iRNA 1 -CHKA的細胞中CHKA蛋白的 含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P〈〇.05)。
[0127] 實施例4CHKA基因的表達對食管癌細胞增殖能力的測定
[0128] 使用Cell Counting kit-8(cck-8)試劑盒用于檢測食管癌細胞增殖 [0129] 1、步驟
[0130]按照前面實施例的方法進行食管癌細胞的培養(yǎng)和轉染，細胞分為二個實驗組：
[0131] 組1:轉染siRNA-NC細胞組；
[0132] 組2:轉染siRNAl-CHKA 細胞組。
[0133] 轉染24h后，以2.5 X105/ml密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每個實驗組設計三復 孔，每孔加入1〇μ1的CCK-8溶液，37°C，5 %⑶2培養(yǎng)箱中孵育4h;然后按照試劑盒說明，選擇 450nm波長，在酶標儀上測定各孔吸光度值(0D值）。
[0134] 2、統(tǒng)計學方法
[0135] 實驗都是按照重復3次來完成的，結果數(shù)據(jù)都是以平均值土標準差的方式來表示， 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當P〈0.05時具 有統(tǒng)計學意義。
[0136] 3、結果
[0137] 結果如表2所示，與轉染siRNA-NC組相比，轉染siRNAl-CHKA細胞組細胞增殖緩慢， 差異具有統(tǒng)計學意義(P〈〇.05)。上述實驗結果表明，CHKA基因表達促進了食管癌細胞的增 殖。
[0138] 表2食管癌細胞0D值
[0140] 實施例5食管癌細胞抗體中和實驗
[0141] 1、步驟：
[0142] 將食管癌細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔2*103個細胞/孔/200μ1，細胞貼壁 后進行如下處理：
[0143] 實驗組1(對照組）：食管癌細胞中加入無關單抗(1:50);
[0144] 實驗組2:食管癌細胞中加入抗人CHKA單抗(1:50)。
[0145] 將細胞在37°C、5%⑶2培養(yǎng)箱孵育24小時后，加入3H-TdR(lyCi/孔），再培養(yǎng)24小 時，收集細胞，加液體閃爍液，β計數(shù)儀檢測cpm值。
[0146] 2、統(tǒng)計學方法
[0147] 實驗都是按照重復3次來完成的，結果數(shù)據(jù)都是以平均值土標準差的方式來表示， 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當P〈0.05時具 有統(tǒng)計學意義。
[0148] 3、結果
[0149] 結果如圖5所示，相比于對照組，加入抗人CHKA單抗的細胞組細胞增殖減緩。上述 實驗結果表明，抑制CHKA蛋白的功能可以抑制食管癌細胞增殖。
[0150] 上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應當指出，對于本 領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進 和修飾，這些改進和修飾也將落入本發(fā)明權利要求的保護范圍內。
【主權項】
1. 檢測CHKA基因表達的產(chǎn)品在制備診斷食管癌的工具中的應用。2. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述產(chǎn)品包括:通過RT-PCR、實時定量PCR、 免疫檢測、原位雜交、芯片或高通量測序平臺檢測CHKA基因表達以診斷食管癌的產(chǎn)品;所述 用RT-PCR診斷食管癌的產(chǎn)品至少包括一對特異擴增CHKA基因的引物;所述用實時定量PCR 診斷食管癌的產(chǎn)品至少包括一對特異擴增CHKA基因的引物;所述用免疫檢測診斷食管癌的 產(chǎn)品包括:與CHKA蛋白特異性結合的抗體;所述用原位雜交診斷食管癌的產(chǎn)品包括:與CHKA 基因的核酸序列雜交的探針;所述用芯片診斷食管癌的產(chǎn)品包括:蛋白芯片和基因芯片；其 中，蛋白芯片包括與CHKA蛋白特異性結合的抗體，基因芯片包括與CHKA基因的核酸序列雜 交的探針。3. 根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于，所述用實時定量PCR診斷食管癌的產(chǎn)品至 少包括的一對特異擴增CHKA基因的引物如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示。4. 一種診斷食管癌的工具，其特征在于，所述工具包括檢測CHKA基因表達的試劑;所述 試劑包括檢測CHKA基因 mRNA的引物和/或探針、檢測CHKA蛋白的抗體。5. 根據(jù)權利要求4所述的工具，其特征在于，所述檢測CHKA基因 mRNA的引物包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物對。 6. CHKA基因和/或其表達產(chǎn)物的抑制劑在制備治療食管癌的藥物中的應用。7. 根據(jù)權利要求6所述的應用，其特征在于，所述抑制劑包括抑制CHKA基因表達的試 劑、和/或抑制CHKA基因表達產(chǎn)物的試劑。8. 根據(jù)權利要求7所述的應用，其特征在于，所述抑制CHKA基因表達產(chǎn)物的試劑包括抑 制針對CHKA基因的siRNA、和/或CHKA蛋白的抗體。9. 根據(jù)權利要求8所述的應用，其特征在于，所述針對CHKA基因的siRNA序列如SEQ ID NO .7和SEQ ID NO .8所示。10. -種用于治療食管癌的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包括權利要求6-9中任一項所述的抑制劑。
【文檔編號】A61K45/00GK105886625SQ201610274496
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月28日
【發(fā)明人】楊承剛, 宋宏濤, 王曉云
【申請人】北京泱深生物信息技術有限公司