一種用于結(jié)腸彎曲菌快速分型的引物及方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物分子分型領(lǐng)域，具體涉及一種用于結(jié)腸彎曲菌快速分型的引物及方法。本發(fā)明提供的用于結(jié)腸彎曲菌快速分型的引物，包括15對結(jié)腸彎曲菌引物。本發(fā)明提供的用于結(jié)腸彎曲菌快速分型的引物具有更好的分型能力和更高的分辨指數(shù)，可以對結(jié)腸彎曲菌進(jìn)行更精確的分型。此外，本發(fā)明提供的用于結(jié)腸彎曲菌快速分型的方法具有操作簡便快捷、穩(wěn)定性和可重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，可以有效的輔助結(jié)腸彎曲菌感染疾病的臨床診斷，是一種較為理想的結(jié)腸彎曲菌分型方法。
【專利說明】
一種用于結(jié)腸彎曲菌快速分型的引物及方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于微生物分子分型領(lǐng)域，具體涉及一種用于結(jié)腸彎曲菌快速分型的引物 及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 彎曲菌屬于革蘭氏陰性短桿菌，是一類重要的食源性人獸共患病原菌，其廣泛分 布于自然界及家畜、家禽的腸道內(nèi)。自1973年Dekeyser和Butzler從急性腸炎患者奠便分離 得到彎曲菌并首次確定其致病性以來，已至少發(fā)現(xiàn)了 16種不同類型的彎曲菌，其中空腸彎 曲菌(Campylobacter jejuni)和結(jié)腸彎曲菌(Campylobacter coli)是彎曲菌感染中最常 見的兩個菌種，約占 99%以上，其中80-90%為空腸彎曲菌，5-10%為結(jié)腸彎曲菌，其它常見 的彎曲菌還有海歐彎曲菌(Campylobacter lari)、胎兒彎曲菌(Campylobacter fetus)和 烏普薩拉彎曲菌(Campylobacter upsaliensis)等。
[0003] 雖然彎曲菌在食物中不容易生長繁殖，但是，它引起發(fā)病的感染劑量很低，大約攝 入400-500cfu便可引發(fā)腸道感染，這對禽肉食品安全和人類健康造成了嚴(yán)重的威脅。而且 經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸彎曲菌的帶菌率比空腸彎曲菌的帶菌率更高，其中高達(dá)50 %的陽性樣品 中同時污染了多株不同型的結(jié)腸彎曲菌。因此，結(jié)腸彎曲菌的檢測對臨床診斷具有十分重 要的意義。
[0004] 中國專利CN102268479B公開了一種檢測結(jié)腸彎曲菌的引物、探針及方法和試劑 盒，該檢測方法是通過設(shè)計(jì)結(jié)腸彎曲菌的實(shí)時熒光定量PCR引物和探針，從而特異性的檢測 出結(jié)腸彎曲菌。但是，該檢測方法僅可以檢測出結(jié)腸彎曲菌，不能對結(jié)腸彎曲菌進(jìn)行進(jìn)一步 的分型，無法滿足臨床診斷的需求。
[0005] 目前，結(jié)腸彎曲菌的基因分型研究主要集中在脈沖場凝膠電泳（Pulsed field gel electrophoresis，PFGE)、限制性片段長度多態(tài)性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(Random amplified polymorphic DNAJAFO) 等。PFGE方法分辨力高，重復(fù)性好，是目前所有分型方法中的金標(biāo)準(zhǔn)，但是其耗時長，費(fèi)用 高，且對設(shè)備具有較高的要求。RFLP技術(shù)是采用標(biāo)準(zhǔn)的通用引物，能最大限度的擴(kuò)增鞭毛基 因的保守序列，經(jīng)酶切電泳，根據(jù)條帶的不同可以區(qū)分不同的基因型，但是該方法分辨力不 高，檢測周期相對較長。RAH)技術(shù)是使用一系列具有10個堿基左右的單鏈隨機(jī)引物，對全基 因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測其多態(tài)性，雖然該方法具有成本低，速度快，易于操作的優(yōu)點(diǎn)， 但是其重復(fù)性較差，而且受模板純度、PCR儀器及操作者等多種因素的影響。
[0006] 擴(kuò)增基因間片斷多態(tài)性(Amplified intergenic locus polymorphism，AILP)技 術(shù)作為一種最新的分子分型技術(shù)在2005年建立。AILP技術(shù)對細(xì)菌分型僅需知道該菌種的全 基因組或部分基因組序列，粗提DNA即可做為PCR擴(kuò)增的模板，該技術(shù)操作簡便，在保證分型 結(jié)果具有較好的穩(wěn)定性、可重復(fù)性和較高分辨率的同時可以大大節(jié)約時間與成本。但是，目 前，尚未見有利用AILP技術(shù)對結(jié)腸彎曲菌進(jìn)行基因分型的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于結(jié)腸彎曲菌快速分型的引物及方法，以彌補(bǔ)現(xiàn)有 結(jié)腸彎曲菌分型技術(shù)中的不足。
[0008] 本發(fā)明提供了一種用于結(jié)腸彎曲菌快速分型的引物，包括以下15對結(jié)腸彎曲菌引 物：針對murD基因的上游引物CCF1:5 ' -GGACCCGACTAACCCTACG-3 '（SEQ ID N0· 1)和下游引 物CCR1:5 ' -GGAGCGAATAGAAGTGAGCAT-3 '（ SEQ ID N0 · 2);針對tpx基因的上游引物(^?2:5'-ATTTACAGGAGCAGCAGGAT-3 '（SEQ ID N0 · 3)和下游引物CCR2:5 ' -CCAATGGGGCTACTTTCTT-3 ' (SEQ ID N0.4);針對proB基因的上游引物CCF3:5'-CCCATCACTCACCCCACTA-3'（SEQ ID N0.5)和下游引物CCR3: 5'-ATTTGTCCACCCATTTTGC-3'（SEQ ID N0.6);針對ybjZ基因的上 游引物CCF4 : 5 ' -ATGGTTTTAGGTGGTTGGG-3 '（ SEQ ID N0 · 7 )和下游引物(^尺4:5'-TGTTTTCGGTTCATTTGGA-3'（SEQ ID N0.8);針對 msrA 基因的上游引物(^卩5:5'_ GCAGATGACAACGAAGAAGTG-3 '（SEQ ID N0 · 9)和下 3'（SEQIDN0·10)針對purB基因的上游引物CCF6:5'-AGCCATTACAGCACTTACACC-3'（SEQID N0· 11)和下游引物CCR6:5 '-AGGCAAAACAAAACAGACAAA-3 '（SEQ ID N0 · 12);針對moeA-3基因 的上游引物CCF7:5'-ATAGCGGCAGAGTGGTAAGG-3'（SEQ ID Ν0· 13)和下游引物CCR7:5'_ GGAGCGGGAAACGAGATT-3'（SEQ ID NO · 14 );針對 mpg基因的上游弓| *CCF8:5'_ ATAGCAAACTCGCACATTCTT-3 '（ SEQ ID N 0 · 1 5 )和下游弓| *CCR8:5'_ AAAACACCCTTTACAACCTCA-3'（SEQ ID NO. 16);針對 rplW 基因的上游引物(^卩9:5'_ GTATGGATTGTGGGGTAGCA-3 '（SEQ ID NO · 17)和下游引物CCR9:5 ' -AGTAAAGAGCGGTTGGGTG-3 ' (SEQIDN0·18);針對proP基因的上游引物CCF10:5'-TCTTGCGGTTGGTTATTTATT-3'（SEQID NO · 19)和下游引物CCR10:5 ' -GACCTGGACCCTCTTTGCT-3 '（ SEQ ID NO · 20);針對typA基因的 上游引物CCF11:5 ' -CGGTTACCTTGTTACGACTTC-3 '（ SEQ ID NO · 21)和下游引物0：1?11:5'-TCCCAGTTCGGATTGTTCT-3'（SEQ ID N0.22);針對 mutY 基因的上游引物(^卩12:5'-GGAGATGGCTGAGTGGTCG-3'（SEQ ID 勵.23)和下游引物(：0?12:5'-八八(：1'1'7^(：1'111^611^6八1'-3'（SEQ ID N0.24);針對glnP基因的上游引物CCF13:5'-CGGCATAGGAGGTTCTGG-3'（SEQ ID NO · 25)和下游引物CCR13:5 ' -GACCCTTTCGTCTAGTGGC-3 '（ SEQ ID NO · 26);針對rluD基因的 上游引物CCF14:5'-GAGTCCTGCTAAATCCACCA-3'（SEQIDN0·27)和下游引物CCR14 :5'-AGTCCAAAATACCCATAAACAA-3'（SEQ ID N0.28);針對typA基因的上游引物0^15:5'-GGTAAACAGTCGGGAGGGA-3'（SEQIDN0·29)和下游引物CCR15 :5'-CGTCGTCAAGAGGGAAACAA-3'（SEQ ID NO.30)。
[0009 ]進(jìn)一步地，所述結(jié)腸彎曲菌的上游引物與下游引物的濃度比為1:1。
[0010] 進(jìn)一步地，所述murD靶基因間隔片斷的長度為117bp，tpx靶基因間隔片斷的長度 為465bp，pr〇B靶基因間隔片斷的長度為760bp，yb jZ靶基因間隔片斷的長度為1155bp，msrA 靶基因間隔片斷的長度為1306bp，pUrB靶基因間隔片斷的長度為1638bp，m〇eA-3靶基因間 隔片斷的長度為1910bp，mpg靶基因間隔片斷的長度為2210bp，rplW靶基因間隔片斷的長度 為2777bp，pr 〇P靶基因間隔片斷的長度為3251bp，typA靶基因間隔片斷的長度為212bp， mutY靶基因間隔片斷的長度為263bp，glnP靶基因間隔片斷的長度為838bp，rluD靶基因間 隔片斷的長度為922bp，typA靶基因間隔片斷的長度為967bp。
[0011]另外，本發(fā)明還提供了一種用于結(jié)腸彎曲菌快速分型的方法，包括如下步驟：
[0012 ] si應(yīng)用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取待測標(biāo)本中的細(xì)菌基因組DNA;
[0013 ] S2以待測標(biāo)本中的細(xì)菌基因組DNA為模板，采用權(quán)利要求1所述的15對結(jié)腸彎曲菌 引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0014] S3將所得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。
[0015] 進(jìn)一步地，所述步驟S1中待測標(biāo)本中的細(xì)菌基因組DNA提取后的濃度為10-200ng/ μ1〇
[0016] 進(jìn)一步地，所述步驟S2中的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括:階段1:94°C 5min;階段2:94°C 3〇8;階段3:521€3〇8;階段4:72 1€21^11;階段5:721€71^11;階段2至階段4循環(huán)35次 ;在4°(：貯 存。
[0017]除此之外，本發(fā)明還提供了所述的用于結(jié)腸彎曲菌快速分型的引物在制備用于快 速分型結(jié)腸彎曲菌試劑盒中的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明提供的用于結(jié)腸彎曲菌快速分型的方法:是利用結(jié)腸彎曲菌全基因組核酸 序列基因間隔片斷中相似度較低的基因間隔區(qū)域?yàn)榘行蛄?，根?jù)所有引物間的退火溫度差 在3 °C以內(nèi)，PCR產(chǎn)物長度為100-3500bp，分別設(shè)計(jì)出15對結(jié)腸彎曲菌引物。使用這15對結(jié)腸 彎曲菌引物分別對待測菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，依據(jù)所有擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后呈現(xiàn)條帶 的數(shù)目及位置的多態(tài)性可達(dá)到對結(jié)腸彎曲菌分型的目的。
[0019] 本發(fā)明提供的用于結(jié)腸彎曲菌快速分型方法的結(jié)果判定方法是:對PCR產(chǎn)物的瓊 脂糖凝膠電泳圖的條帶數(shù)目和產(chǎn)物DNA片段長度進(jìn)行分析，對于不同株的結(jié)腸彎曲菌15組 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖完全一致的判斷為相同的基因型。
[0020] 本發(fā)明提供的用于結(jié)腸彎曲菌快速分型的引物具有更好的分型能力和更高的分 辨指數(shù)，可以對結(jié)腸彎曲菌進(jìn)行更精確的分型。將本發(fā)明提供的15對結(jié)腸彎曲菌引物采用 相同的擴(kuò)增反應(yīng)條件，可一次性完成15個不同引物對的PCR反應(yīng)，觀察凝膠電泳圖呈現(xiàn)條帶 的數(shù)目及位置可達(dá)到對結(jié)腸彎曲菌的分型，該方法具有操作簡便快捷、特異性好和準(zhǔn)確度 高的優(yōu)點(diǎn)，可以有效的輔助結(jié)腸彎曲菌感染疾病的臨床診斷。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明提供的用于結(jié)腸彎曲菌快速分型 的引物具有更好的分型能力和更高的分辨指數(shù)，可以對結(jié)腸彎曲菌進(jìn)行更精確的分型。此 外，本發(fā)明提供的用于結(jié)腸彎曲菌快速分型的方法具有操作簡便快捷、特異性好的優(yōu)點(diǎn)，可 以有效的輔助結(jié)腸彎曲菌感染疾病的臨床診斷，是一種較為理想的結(jié)腸彎曲菌分型方法。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定 本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在 不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
[0023]實(shí)施例1、引物
[0024] 本發(fā)明提供的用于結(jié)腸彎曲菌快速分型的引物。
[0025] 表1本發(fā)明提供的引物
[0027]
[0028] 實(shí)施例2、結(jié)腸彎曲菌各靶基因間隔片斷的長度
[0029]本發(fā)明提供的murD靶基因間隔片斷的長度為117bp，tpx靶基因間隔片斷的長度為 465bp，proB靶基因間隔片斷的長度為760bp，yb jZ靶基因間隔片斷的長度為1155bp，msrA靶 基因間隔片斷的長度為1306bp，pUrB靶基因間隔片斷的長度為1638bp，m 〇eA-3靶基因間隔 片斷的長度為1910bp，mpg靶基因間隔片斷的長度為2210bp，rplW祀基因間隔片斷的長度為 2777bp，pr 〇P靶基因間隔片斷的長度為3251bp，typA靶基因間隔片斷的長度為212bp，mutY 靶基因間隔片斷的長度為263bp，glnP靶基因間隔片斷的長度為838bp，rluD靶基因間隔片 斷的長度為922bp，typA靶基因間隔片斷的長度為967bp。
[0030]表2結(jié)腸彎曲菌各靶基因間隔片斷的長度

[0032]實(shí)施例3、一種用于結(jié)腸彎曲菌決速分型的方法 [0033] 1、結(jié)腸彎曲菌基因組DNA的提?。?br>[0034] 取待測的44株結(jié)腸彎曲菌，分別在血瓊脂平板培養(yǎng)基上密集劃線，置于5%02、 10 % % N2的微需氧條件下，37 °C增菌培養(yǎng)24-48h后，刮取培養(yǎng)基上全部菌落至2ml ddH2〇中，禍旋振蕩混勾后再于lOOOOrpm離心2min，棄其上清液，按照Takara公司的細(xì)菌基 因組DNA小量純化試劑盒進(jìn)行操作，分別提取44株結(jié)腸彎曲菌基因組DNA，提取后的DNA濃度 為10-200ngAU。所得的基因組DNA在檢測前于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0035] 2、待測菌株不同基因間隔片斷的PCR擴(kuò)增：
[0036] 以本發(fā)明實(shí)施例1提供的結(jié)腸彎曲菌基因分型的15對結(jié)腸彎曲菌引物，分別對44 株待測菌株中的15個靶基因間隔片斷進(jìn)行PCR擴(kuò)增：
[0037] 2.1、擴(kuò)增體系為25μ1:在PCR反應(yīng)管中分別加入反應(yīng)液22μ1，其組成均包括:2.5μ llOXTaq DNA Polymerase Buffer,0.5μ1 lOmM dNTPs,0.15yl 5U/yl Taq DNA Polymerase，17.85μ1 ddH2〇和ΙμL待檢模板;然后再于相應(yīng)管中分別加入10μΜ的兩條引物 各1·5μ1;
[0038] 2.2、將上述各PCR管混勻稍離心后置于PCR儀上進(jìn)行以下反應(yīng)：①94°C預(yù)變性 5min，②94°C變性30s，③52°C退火30s，④72°C延伸2min，⑤72°C延伸7min，其中②-④步循 環(huán)35次。
[0039] 3、PCR產(chǎn)物的電泳檢測：
[0040]將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，取3μ1擴(kuò)增產(chǎn)物與0.5μ1上樣緩沖液混勻后點(diǎn)樣 于含0.5mg/L GoldView的1.5%瓊脂糖凝膠孔中，100V電泳45min后置于凝膠成像系統(tǒng)中成 像，觀察PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶情況，以實(shí)施例2的靶基因間隔片斷的長度進(jìn)行結(jié)果判斷。結(jié)果如 表3所示：
[00411表3 44株結(jié)腸彎曲菌PCR產(chǎn)物及基因型
[0043]
[0044] 如表3所示:0代表沒有出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物，1代表擴(kuò)增產(chǎn)物長度與靶基因間隔片斷預(yù)期 長度相同，la-lh分別代表擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶為1條，但產(chǎn)物長度與靶基因間隔片斷預(yù)期長 度不相同，且相互之間也不相同。2a_2i分別代表擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶為2條，其中一個條帶呈 現(xiàn)的序列長度與靶基因間隔片斷預(yù)期長度相同，另一個條帶呈現(xiàn)的序列長度互不相同。3a_ 3d分別代表擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶為3條，其中一個條帶呈現(xiàn)的序列長度與靶基因間隔片斷預(yù) 期長度相同，另外兩個條帶呈現(xiàn)的序列長度各不相同。4a代表擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶為4條，其 中一個條帶呈現(xiàn)的序列長度與靶基因間隔片斷預(yù)期長度相同，另外三個條帶呈現(xiàn)的序列長 度各不相同。
[0045] 4、擴(kuò)增產(chǎn)物的基因測序鑒定：
[0046] 對出現(xiàn)電泳條帶的菌株，采用上述方法重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系按比例擴(kuò)大至 50ul，將PCR產(chǎn)物全部點(diǎn)樣進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳后切取凝膠上的條帶，按照Takara公 司的DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行操作，分別回收所有PCR產(chǎn)物。將純化的PCR產(chǎn)物分別與pGEM-T克隆質(zhì)粒用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. col iDH5a，挑取白色菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，增 菌后送廣州英駿生物技術(shù)有限公司測序。按照表3的結(jié)果所示，將顯示為1的PCR產(chǎn)物測序結(jié) 果與美國國立衛(wèi)生研究院GenBank數(shù)據(jù)庫(DNA序列數(shù)據(jù)庫）中的基因序列進(jìn)行比對，結(jié)果與 相應(yīng)的靶基因間隔片斷序列完全相同。將表3中顯示為其它相同字符的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果分 組比對，同源性均達(dá)100%。顯示了本發(fā)明提供的結(jié)腸彎曲菌引物的準(zhǔn)確性。
[0047] 5、AILP基因分型能力的比較：
[0048]根據(jù)前期基因分型金標(biāo)準(zhǔn)PFGE分型的結(jié)果，待測的44株結(jié)腸彎曲菌分為27個基因 型，如表3所示，根據(jù)表3中瓊脂糖凝膠電泳圖的條帶數(shù)目和產(chǎn)物DNA片段長度，44株菌株中， 15組PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖完全一致的判斷為相同的基因型。
[0049]本發(fā)明提供的AILP分型方法可將44株結(jié)腸彎曲菌菌株分為40個基因型，其中CC7 和CC9，CC20和CC21，CC28和CC29，CC35和CC36分別為相同的型，其它菌株型別均不同。而 PFGE分型方法將這44株菌株分為27個基因型，其中型別相同的菌株有CC1、CC3和CC4，CC7、 CC8、CC9 和 0：10,0：14、0：15、0：16、0：17和0：19,0：20、0：21、0：24、0：25和0：26,0：28和0：29， CC39和CC40，CC43和CC44，CC35和CC36。表明了本發(fā)明提供的基因分型方法分型能力遠(yuǎn)優(yōu)于 PFGE方法。
[0050] 6、AILP基因分型的分辨指數(shù)：
[0051 ]米用Hunter-Gaston分辨指數(shù)（Hunter-Gaston discriminatory index，HGDI)評 價(jià)AILP基因分型對結(jié)腸彎曲菌菌株的分辨能力，公式如下：
[0053] 其中，N為實(shí)驗(yàn)菌株總數(shù)，S代表不同基因型的數(shù)目，nj代表第j個基因型的菌株數(shù)。
[0054] 采用上述公式分別計(jì)算本發(fā)明提供的結(jié)腸彎曲菌基因分型檢測引物組所對應(yīng)的 15個靶基因間隔位點(diǎn)、各種不同位點(diǎn)組合及PFGE基因分型的分辨指數(shù)，并綜合分析分型個 數(shù)和分辨指數(shù)兩個指標(biāo)，從每類位點(diǎn)個數(shù)相同的組合中選出最優(yōu)的位點(diǎn)組合，如表4所示。
[0055] 表4不同位點(diǎn)組合及PFGE基因分型分辨能力比較
[0056]
[0057] 由表4可知，本發(fā)明提供的結(jié)腸彎曲菌基因分型檢測引物組所對應(yīng)的15個位點(diǎn)可 將44株結(jié)腸彎曲菌分為40個基因型，分型指數(shù)為0.996;表4第3行所示的9個位點(diǎn)也可將44 株空腸彎曲菌分為40個基因型，分型指數(shù)同為0.996;表3第4-10行所示的2-8個位點(diǎn)可將 44株空腸彎曲菌分為13-39個基因型，分型指數(shù)為0.883-0.995;單個位點(diǎn)呈現(xiàn)多態(tài)性最好 的是proP，分型指數(shù)為0.681。證明本發(fā)明提供的AILP分型檢測引物組分辨指數(shù)極高，最低 優(yōu)選4對引物對應(yīng)的4個位點(diǎn)就可實(shí)現(xiàn)與PFGE分型相同甚至更高的分辨指數(shù)。。
[0058] 7、AILP基因分型檢測重復(fù)性的評價(jià)：
[0059]將待測44株結(jié)腸彎曲菌的AILP基因分型試驗(yàn)分別由不同的操作者使用不同的PCR 儀重復(fù)3次，結(jié)果與表3顯示的結(jié)果完全一致。證明本發(fā)明提供的分型方法具有很好的穩(wěn)定 性和重復(fù)性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于結(jié)腸彎曲菌快速分型的引物，其特征在于，包括以下15對結(jié)腸彎曲菌引物： 針對murD基因的上游引物CCFl: 5 ' -GGACCCGACTAACCCTACG-3 '和下游引物CCRl: 5 ' -GGAGCGAATAGAAGTGAGCAT-3 ' ；針對tpx基因的上游引物CCF2:5 ' -AITTACAGGAGCAGCAGGAT-3 ' 和下游引物CCR2 : 5 ' -CCAATGGGGCTACTTTCTT-3 ' ；針對proB基因的上游引物CCF3 : 5 ' -CCCATCACTCACCCCACTA-3 ' 和下游引物CCR3:5 ' -ATTTGTCCACCCATTTTGC-3 ' ；針對yb jZ基因的 上游引物 CCF4:5 ' -ATGGTTTTAGGTGGTTGGG-3 ' 和下游引物 CCR4:5 ' -TGTTTTCGGTTCATTTGGA-3 ' ；針對msrA基因的上游引物CCF5:5 ' -GCAGATGACAACGAAGAAGTG-3 ' 和下游引物CCR5:5 ' -CGTGAAAAGCCTGTGAATAAA-3 ' ；針對purB基因的上游引物CCF6:5 ' -AGCCATTACAGCACTTACACC-3 ' 和下游引物CCR6:5 ' -AGGCAAAACAAAACAGACAAA-3 ' ；針對moeA-3基因的上游引物CCF7:5 ' -ATAGCGGCAGAGTGGTAAGG-3 ' 和下游引物CCR7:5 ' -GGAGCGGGAAACGAGATT-3 ' ；針對mpg基因的 上游引物CCF8:5'-ATAGCAAACTCGCACATTCTT-3'和下游引物CCR8:5'_ AAAACACCCTTTACAACCTCA-3 ' ；針對rplW基因的上游引物CCF9:5 ' -GTATGGATTGTGGGGTAGCA-3 ' 和下游引物CCR9:5 ' -AGTAAAGAGCGGTTGGGTG-3 ' ；針對proP基因的上游引物CCFlO: 5 ' -TCTTGCGGTTGGTTATTTATT-3 ' 和下游引物CCRlO: 5 ' -GACCTGGACCCTCTTTGCT-3 ' ；針對typA基 因的上游引物CCFl I : 5 ' -CGGTTACCTTGTTACGACTTC-3 ' 和下游引物CCRl 1 : 5 ' -TCCCAGTTCGGATTGTTCT-3 ' ；針對mutY基因的上游引物CCFl2:5 ' -GGAGATGGCTGAGTGGTCG-3 ' 和下游引物CCR12:5'-AACTTTTACTTCGGGTTGGAT-3' ；針對glnP基因的上游引物CCF13:5'-CGGCATAGGAGGTTCTGG-3'和下游引物CCR13:5'-GACCCTTTCGTCTAGTGGC-3' ；針對rluD基因的 上游引物(^卩14:5'-6八61'(：(^6(^八八八1'(：〇八(：〇八-3'和下游引物(：〇1?14 :5'-AGTCCAAAATACCCATAAACAA-3' ；針對typA基因的上游引物CCF15:5' -GGTAAACAGTCGGGAGGGA-3 ' 和下游引物CCRl5:5 ' -CGTCGTCAAGAGGGAAACAA-3 '。2. 如權(quán)利要求1所述的用于結(jié)腸彎曲菌快速分型的引物，其特征在于，所述結(jié)腸彎曲菌 的上游引物與下游引物的濃度比為1:1。3. 如權(quán)利要求1所述的用于結(jié)腸彎曲菌快速分型的引物，其特征在于，所述murD靶基因 間隔片斷的長度為117bp，tpx靶基因間隔片斷的長度為465bp，pr 〇B靶基因間隔片斷的長度 為760bp，ybjZ靶基因間隔片斷的長度為1155bp，msrA靶基因間隔片斷的長度為1306bp， purB靶基因間隔片斷的長度為1638bp，m〇eA-3靶基因間隔片斷的長度為1910bp，mpg靶基因 間隔片斷的長度為2210bp，rplW靶基因間隔片斷的長度為2777bp，pr 〇p靶基因間隔片斷的 長度為3251bp，typA靶基因間隔片斷的長度為212bp，mutY靶基因間隔片斷的長度為263bp， glnP靶基因間隔片斷的長度為838bp，rluD靶基因間隔片斷的長度為922bp，typA靶基因間 隔片斷的長度為967bp。4. 一種用于結(jié)腸彎曲菌快速分型的方法，其特征在于，包括如下步驟： Sl應(yīng)用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取待測標(biāo)本中的細(xì)菌基因組DNA; S2以待測標(biāo)本中的細(xì)菌基因組DNA為模板，采用權(quán)利要求1所述的15對結(jié)腸彎曲菌引物 分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增； S3將所得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。5. 如權(quán)利要求4所述的用于結(jié)腸彎曲菌快速分型的方法，其特征在于，所述步驟Sl中待 測標(biāo)本中的細(xì)菌基因組DNA提取后的濃度為10-200ngAU。6. 如權(quán)利要求4所述的用于結(jié)腸彎曲菌快速分型的方法，其特征在于，所述步驟S2中的 PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括：階段1:94°C 5min;階段2 :94°C 30s ;階段3 : 52 °C30s ;階段4: 72°C 2min;階段5:72 °C 7min;階段2至階段4循環(huán)35次;在4 °C貯存。7.如權(quán)利要求1所述的用于結(jié)腸彎曲菌快速分型的引物在制備用于快速分型結(jié)腸彎曲 菌試劑盒中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/04GK105886623SQ201610272807
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月27日
【發(fā)明人】畢水蓮, 羅永文
【申請人】廣東藥學(xué)院