專利名稱：人食管癌細胞ezrin基因上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因表達調(diào)控，具體地說，涉及人食管癌細胞ezrin基因上游的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。
背景技術(shù)：
食管癌是我國常見惡性腫瘤，其發(fā)病機制尚不明確。我們最近的研究結(jié)果顯示，ezrin基因是食管癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因之一。eznn基因又稱VIL2，定位于染色體6q25.2～q26，人類ezrin基因DNA長度約為24kb，含13個外顯子，cDNA長度為1761bp，其表達產(chǎn)物Ezrin蛋白是ERM(ezrin-radixin-moesin)家族成員之一，主要參與細胞中細胞骨架與胞膜之間的連接，具有維持細胞形態(tài)和運動、連接黏附分子及調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能。越來越多的證據(jù)表明Ezrin調(diào)控腫瘤發(fā)展。轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移腫瘤細胞系及組織樣品中基因表達的對比結(jié)果顯示，來自嚙齒動物乳腺、人胰腺和結(jié)腸的癌轉(zhuǎn)移細胞中Ezrin的表達顯著提高；同時，Ezrin在多種人類腫瘤中強烈表達，這些腫瘤包括骨肉瘤、黑色素瘤、星細胞瘤、胰腺癌、肺癌、子宮內(nèi)膜癌等；進一步的研究顯示抑制Ezrin蛋白能消除鼠科動物橫紋肌肉瘤和骨肉瘤細胞，Ezrin很可能是惡性腫瘤的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子。目前的研究主要集中在Ezrin蛋白的功能、細胞中與Ezrin蛋白相互作用的分子及其作用機制，而關(guān)于ezrin基因的上游轉(zhuǎn)錄表達調(diào)控機制的研究，尚未見報道。
在真核生物中，一個典型的基因，其上游是一段核心啟動子的DNA序列，包括距轉(zhuǎn)錄起始位點約-40到+50范圍內(nèi)的DNA序列，核心啟動子結(jié)合RNA聚合酶II(Pol II)及其輔助因子(基本轉(zhuǎn)錄機構(gòu))，定位轉(zhuǎn)錄起始位點并控制轉(zhuǎn)錄方向，對細胞內(nèi)相鄰近的或遠距離的激活因子和抑制因子作出應(yīng)答。多數(shù)情況下，核心啟動子并不直接調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。緊靠核心啟動子的上游是一段調(diào)控性啟動子，它是位于核心啟動子周圍、轉(zhuǎn)錄起始位點幾百個堿基對以內(nèi)的DNA區(qū)域。位于基因上游或下游或位于內(nèi)含子中、距離轉(zhuǎn)錄起始位點較遠的一段調(diào)控區(qū)域是增強子序列或負調(diào)控元件。序列特異性DNA結(jié)合蛋白與調(diào)控性啟動子、增強子和負調(diào)控元件的結(jié)合控制著轉(zhuǎn)錄機制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種人食管癌細胞ezrin基因上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，確定人ezrin基因的增強子和負調(diào)控元件。
本發(fā)明的另一個目的在于提供含有上述基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的載體。
本發(fā)明的進一步目的在于提供含有上述載體的宿主細胞。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明利用分子生物學(xué)軟件對人食管癌細胞ezrin基因翻譯起始位點(翻譯起始位點ATG位于+135～+137)前的上游序列(-1759～+134)進行了分析，發(fā)現(xiàn)這一區(qū)域的平均GC含量為70.15％，存在CpG島和20多個潛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，提示在人食管癌中ezrin基因表達調(diào)控存在多種因素，從中找出關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域或調(diào)控元件，對闡明人食管癌細胞中ezrin基因的表達調(diào)控機制有重要意義。
本發(fā)明中，含有人食管癌細胞ezrin基因上游的序列命名為EZ1.759，其長度為1893bp，核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，保留了ezrin基因上游-1759～+134之間的片段，為翻譯起始位點前的一段序列，在SEQ ID NO1中，+1為轉(zhuǎn)錄起始位點。
本發(fā)明提供的人食管癌細胞ezrin基因上游負調(diào)控元件之一，其長度為212bp，核苷酸序列如SEQ ID NO2所示，保留了ezrin基因上游-1102～-891之間的片段。
本發(fā)明提供的人食管癌細胞ezrin基因另一負調(diào)控元件，其長度為329bp，核苷酸序列如SEQ ID NO5所示，保留了ezrin基因上游-1102～-774之間的片段。
本發(fā)明提供的人食管癌細胞ezrin基因上游增強子之一，其長度為117bp，核苷酸序列如SEQ ID NO3所示，保留了ezrin基因上游-890～-774之間的片段。
本發(fā)明提供的人食管癌細胞ezrin基因另一增強子，其長度為77bp，核苷酸序列如SEQ ID NO4所示，保留了ezrin基因上游-773～-697之間的片段。
為了鑒別ezrin基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，需要對人ezrin基因上游區(qū)域進行缺失分析。在一項缺失分析中，利用嵌套缺失技術(shù)，控制外切核酸酶III(ExoIII)的消化時間，使ezrin基因上游從5’端-1759處開始逐漸截短，得到一系列以ezrin基因上游不同長度片段為啟動子的真核細胞表達質(zhì)粒，利用螢火蟲熒光素酶報告基因，檢測這些質(zhì)粒在人食管癌細胞EC109中的轉(zhuǎn)錄活性。為減少細胞培養(yǎng)微環(huán)境所造成的誤差，以表達海腎熒光素酶的質(zhì)粒pRL-TK作為內(nèi)參照，與上述嵌套缺失質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染EC109細胞，測定螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶的酶活性，用二者的比值，即相對熒光素酶活性表示目的序列的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果顯示ezrin基因上游-1324～-696之間的區(qū)域是一個重要的轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控區(qū)，-146～-32之間的區(qū)域是另一個重要的轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控區(qū)。
為了進一步鑒別ezrin基因上游-1324～-696區(qū)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，在以ezrin基因上游-1324～+134序列為啟動子的真核細胞表達質(zhì)粒上對-1102～-774之間329bp片段進行刪除，結(jié)果質(zhì)粒的相對熒光素酶活性提高，顯示-1102～-774片段有抑制轉(zhuǎn)錄活性作用，存在轉(zhuǎn)錄負調(diào)控元件。另外，對-1102～-697區(qū)域進行分段PCR擴增，連接至含SV40啟動子的質(zhì)粒上，相對熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示，ezrin基因上游-1102～-891和-1102～-774片段有轉(zhuǎn)錄抑制作用，-890～-774和-773～-697片段有轉(zhuǎn)錄增強作用。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明首次鑒定了人食管癌細胞ezrin基因啟動子，構(gòu)建了一系列用于檢測ezrin基因上游序列轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的真核表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞瞬時表達，確定了ezrin基因上游序列在人食管癌細胞中的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。本發(fā)明對研究Ezrin在腫瘤細胞中的表達調(diào)控機制以及以Ezrin為靶點的臨床治療具有重要意義。將有助于從分子水平上探索食管癌的發(fā)病機制，為食管癌的防治提供新的理論依據(jù)。


圖1為以ezrin基因上游序列為啟動子的重組質(zhì)粒構(gòu)建流程圖；圖2為ezrin基因上游序列5’端嵌套缺失質(zhì)粒的構(gòu)建流程圖；圖3為ezrin基因上游序列5’端嵌套缺失質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果；圖4為以ezrin基因上游序列為增強子或負調(diào)控元件的重組質(zhì)粒構(gòu)建流程圖；圖5為以ezrin基因上游序列為增強子的重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果；圖6為ezrin基因上游5’端嵌套缺失質(zhì)粒在EC109細胞中的相對熒光素酶活性分析；圖7為ezrin基因上游刪除部分片段的重組質(zhì)粒在EC109細胞中的相對熒光素酶活性分析；圖8為以ezrin基因上游序列為增強子或負調(diào)控元件的重組質(zhì)粒在EC109細胞中的相對熒光素酶活性分析；其中，圖3中，M1為DNA Marker DL2000；M2為DNA Marker100bp ladder；1～12為嵌套缺失質(zhì)粒；13為對照質(zhì)粒pGL3-Basic。
圖5中，M1為DNA Marker DL2000；M2為DNA Marker 100bpladder；1為pGL3-Promoter；2為pGLP/-1102～-891；3為pGLP/-890～-774；4為pGLP/-773～-697；5為pGLP/-1102～-774。
圖6中，(a)為ezrin基因上游序列(-1759～-32)系列缺失重組質(zhì)粒(在pGL3-Basic載體上)的模式圖；(b)為對應(yīng)缺失子的相對熒光素酶活性。實驗被重復(fù)3次，在此顯示來自3次實驗中有代表性的數(shù)據(jù)，誤差線代表標準差。
圖7中，(a)為刪除ezrin基因上游部分序列的重組質(zhì)粒(在pGL3-Basic載體上)的模式圖；(b)為對應(yīng)質(zhì)粒的相對熒光素酶活性。實驗被重復(fù)3次，在此顯示來自3次實驗中有代表性的數(shù)據(jù)，誤差線代表標準差。
圖8中，ezrin基因上游序列分段擴增片段構(gòu)建在載體pGL3-Promoter上，質(zhì)粒的相對熒光素酶活性測定實驗被重復(fù)3次，在此顯示來自3次實驗中有代表性的數(shù)據(jù)，誤差線代表標準差。
具體實施例方式
實施例1 含有ezrin基因上游序列的真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建1、人ezrin基因上游序列(-1759～+134)的克隆文獻發(fā)表的人ezrin基因序列翻譯起始位點ATG位于+135～+137，據(jù)此設(shè)計并合成了用于擴增人ezrin基因翻譯起始密碼子上游1893bp片段的一對引物F1和R1，所述引物序列如下F15’-CGGGGTACC-1759AGTGAATGCTGTTGCTGCTCGTCTGGAAG-3’(下劃線為Kpn I位點)R15’-CCCAAGC+134TTTCGGTTTCTGGTGAGTATCCTCGATCCC-3’(下劃線為Hind III位點)應(yīng)用此對引物，從人食管癌細胞EC109基因組DNA中經(jīng)PCR擴增出與預(yù)期一致的約1.9kb的DNA片段。回收所擴增的目的片段，Kpn I/Hind III雙酶切后，與經(jīng)Kpn I/Hind III雙酶切的載體pGL3-Basic(Promega公司)連接。pGL3-Basic為螢火蟲熒光素酶報告基因前不含啟動子的表達載體。測序結(jié)果證明人ezrin基因上游-1759～+134之間的序列已定向克隆至螢火蟲熒光素酶基因的上游，該序列命名為EZ1.759，重組質(zhì)粒命名為pEZ1.759。重組質(zhì)粒的構(gòu)建流程如圖1所示。
人食管癌細胞ezrin基因上游序列EZ1.759的測序結(jié)果見SEQ IDNO1。與GenBank已知序列比較，核苷酸相同性為99.79％。
2、以pEZ1.759為基礎(chǔ)的ezrin基因上游序列5’端嵌套缺失載體的構(gòu)建StuI位于ezrin基因上游的-1447處，該內(nèi)切酶可使DNA形成平滑末端，進一步被外切核酸酶ExoIII降解；Kpn I為載體pGL3-Basic上酶切位點，該內(nèi)切酶可使DNA形成3’末端突出片段，不被ExoIII降解。將質(zhì)粒pEZ1.759經(jīng)StuI/Kpn I雙酶切，再經(jīng)ExoIII酶切。取不同反應(yīng)時間的酶切后產(chǎn)物，用S1核酸酶切除單鏈DNA，Klenow補平末端，T4 DNA連接酶使片段自連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，進行抗性篩選及測序，得到一系列ezrin基因上游序列從5’端逐漸截短的真核表達質(zhì)粒，重組質(zhì)粒的構(gòu)建流程參見圖2。由質(zhì)粒pGL3-Basic的上、下游測序引物RVprimer3和GLprimer2組成一對引物，對重組質(zhì)粒進行PCR鑒定，結(jié)果見圖3。所有構(gòu)建的重組質(zhì)粒通過測序驗證。
3、用于鑒定ezrin基因增強子或負調(diào)控元件的重組質(zhì)粒的構(gòu)建限制性內(nèi)切酶Pst I有兩個酶切位點分別位于ezrin基因上游的-1102和-773，質(zhì)粒pEZ1.324經(jīng)Pst I酶切，回收大片斷，T4 DNA連接酶使片段自連，即得到去除eznn基因上游-1102～-773之間329bp片段的重組質(zhì)粒pEZ1.324D。所刪除的序列見SEQ ID NO5。
設(shè)計引物對ezrin基因上游-1102～-697之間的序列進行分段擴增，將不同長度的擴增片段用BamH I/Sal I雙酶切，再與經(jīng)BamH I/SalI雙酶切的載體pGL3-Promoter(Promega公司)連接，構(gòu)建用于檢測ezrin基因增強子或負調(diào)控元件的重組質(zhì)粒(見表1)。pGL3-Promoter為螢火蟲熒光素酶報告基因前含SV40啟動子的真核表達載體。該重組質(zhì)粒的整個構(gòu)建流程如圖4所示，重組質(zhì)粒用BamH I/Sal I進行雙酶切鑒定，結(jié)果見圖5。所述引物序列如下F2(下劃線為BamH I位點)5’-CGCGGATCC-1102CTGCAGGCGCCGGGTGAGGCGTGC-3’F3(下劃線為BamH I位點)5’-CGCGGATCC-890TCCCCTCAGGTCTCTCCCGAAGGAAACGCG-3’F4(下劃線為BamH I位點)5’-CGCGGATCC-773CTGCAGCCGCGGGGCAACGGTTGCT-3’R2(下劃線為Sal I位點)5’-ACGCGTCGAC-891CCCGGCGCCGAGGGGAAGGTCGC-3’R3(下劃線為Sal I位點)5’-ACGCGTCGAC-774TCACAACCGTCAAGCCTTTGAGAAACTCTTTCAAAAACTGCAACCGC-3’R4(下劃線為Sal I位點)
5’-ACGCGTCGAC-697GCTGCCAGGAAGCCCGTGAGAAGCCGAG-3’表1 以ezrin基因上游序列為增強子或負調(diào)控元件的重組質(zhì)粒的構(gòu)建

實施例2 細胞培養(yǎng)、DNA轉(zhuǎn)染和人食管癌細胞ezrin基因上游序列活性分析用QIAprep Spin Miniprep Kit提取需轉(zhuǎn)染的實驗質(zhì)粒、對照質(zhì)粒pGL3-Basic和內(nèi)參照質(zhì)粒pRL-TK，測定其含量和純度。取上述表達螢火蟲熒光素酶的實驗質(zhì)粒和對照質(zhì)粒用Buffer EB(10mmol/LTris·Cl，pH 8.5)稀釋至100ng/μl，表達海腎熒光素酶的內(nèi)參照質(zhì)粒pRL-TK用Buffer EB稀釋至20ng/μl。將實驗質(zhì)粒與內(nèi)參照質(zhì)粒按50∶1混合，即1μg∶20ng(10μl∶1μl)。
人食管癌細胞EC109進行常規(guī)傳代培養(yǎng)，接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔0.5ml。24h后細胞滿度達50％～60％時即可用于轉(zhuǎn)染。
轉(zhuǎn)染方法如下在超凈工作臺中，取7ml玻璃離心管若干支，做好標記，加入70.5μl含12.5mmol/L HEPES的199基礎(chǔ)培養(yǎng)液和4.5μl Fugene6轉(zhuǎn)染試劑(Roche公司)，渦旋1sec，室溫下放置5min。再加入相應(yīng)的質(zhì)?；旌弦?6.5μl，空白管中加入16.5μl Buffer EB，渦旋1sec，室溫下放置15min。將24孔板做好標記，每個樣品設(shè)3個平行孔，每孔加入28μl轉(zhuǎn)染液，輕輕搖勻，于37℃ 5％ CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h，收獲細胞，進行雙熒光素酶報告基因的檢測。實驗被重復(fù)3次。
雙熒光素酶報告基因的檢測采用Promega公司的Dual-LuciferaseReporter Assay System進行分析。將轉(zhuǎn)染有目的DNA的貼壁細胞用1×PBS洗滌一次，去盡殘液，加入100μl新鮮配制的1×PLB，室溫下，搖床上劇烈振蕩15min以裂解細胞。取20μl上述細胞裂解液加入含100μl LARII溶液的1.5ml離心管中，測定熒火蟲熒光素酶活性，再向同一離心管中加入100μl新鮮配制的1×STOP液，測定海腎熒光素酶(內(nèi)參照)活性，根據(jù)TD20/20型照度計配制的軟件計算出各組相對熒光強度(螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶)，以此代表相對熒光素酶活性。各組實驗數(shù)據(jù)均計算平均值及標準差，用x±s。應(yīng)用SPSS14.0統(tǒng)計軟件對各組實驗數(shù)據(jù)之間是否有顯著性差異進行t檢驗。
1、ezrin基因上游序列轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的鑒定ezrin基因上游序列(-1759～-32)從5’端嵌套缺失質(zhì)粒(在pGL3-Basic載體上)的模式圖及對應(yīng)缺失子的相對熒光素酶活性見圖6，組間差異顯著性分析見表2。
表2 ezrin基因上游序列5’端嵌套缺失質(zhì)粒的相對熒光素酶活性

在人食管癌細胞中，ezrin基因翻譯起始密碼子上游的1893bp序列具有明顯的轉(zhuǎn)錄活性。質(zhì)粒pEZ1.759和pEZ1.324組間相對熒光素酶活性差異沒有顯著性(P＞0.05)，pEZ1.324和pEZ0.696組間相對熒光素酶活性差異有高度顯著性(P＜0.01)，pEZ0.696和pEZ0.213組間、pEZ0.696和pEZ0.146組間以及pEZ0.213和pEZ0.146組間相對熒光素酶活性差異均無顯著性(P＞0.05)，pEZ0.146和pEZ0.032組間相對熒光素酶活性差異有高度顯著性(P＜0.01)。當ezrin基因上游序列從-1759截短至-1324以及從-696截短至-146時，轉(zhuǎn)錄活性無明顯變化，說明ezrin基因上游在-1759～-1324之間和-696～-146之間的DNA序列對轉(zhuǎn)錄活性無明顯影響，為非轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控區(qū)。當ezrin基因上游序列從-1324截短至-696時，轉(zhuǎn)錄活性下降39.1％，但與對照質(zhì)粒pGL3-Basic相比較轉(zhuǎn)錄活性仍然很高，顯示在這一區(qū)域有影響轉(zhuǎn)錄活性的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，很可能存在ezrin基因增強子序列。當ezrin基因上游序列從-146截短至-32時，轉(zhuǎn)錄活性下降94.0％，接近對照質(zhì)粒pGL3-Basic，說明在這一區(qū)域有顯著影響轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，為ezrin基因調(diào)控性啟動子區(qū)。
2、ezrin基因上游增強子或負調(diào)控元件的鑒定刪除ezrin基因上游部分序列的重組質(zhì)粒(在pGL3-Basic載體上)的模式圖及對應(yīng)的相對熒光素酶活性見圖7，組間差異顯著性分析見表3。
表3.刪除ezrin基因上游部分序列的重組質(zhì)粒的相對熒光素酶活性

質(zhì)粒pEZ1.324和pEZ0.890組間相對熒光素酶活性差異沒有顯著性(P＞0.05)。pEZ1.324和pEZ1.324D組間的相對熒光素酶活性差異有顯著性(P＜0.05)，在pEZ1.324基礎(chǔ)上刪除-1102～-774之間的序列反而使轉(zhuǎn)錄活性提高，提示在-1102～-774之間序列可能對轉(zhuǎn)錄有負調(diào)控作用。pEZ0.890和pEZ0.696組間的相對熒光素酶活性差異有高度顯著性(P＜0.01)，刪除-890～-697之間序列的使轉(zhuǎn)錄活性下降，提示-890～-697之間序列對轉(zhuǎn)錄活性有增強作用。
為了進一步分析ezrin基因上游片段-1102～-891、-890～-774、-773～-697和-1102～-774對轉(zhuǎn)錄活性的影響，利用PCR方法克隆上述片段，將目的片段連接至質(zhì)粒pGL3-Promoter上構(gòu)建重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒pGLP/-1102～-891為在質(zhì)粒pGL3-Promoter上連接有ezrin基因上游片段-1102～-891，其它質(zhì)粒命名與此類似。利用相對熒光素酶活性來分析這些DNA片段對轉(zhuǎn)錄活性的抑制或增強作用。實驗結(jié)果見圖8和表4。
表4 ezrin基因上游序列對轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控作用

連接有ezrin基因上游片段的質(zhì)粒(pGLP/-1102～-891，pGLP/-890～-774，pGLP/-773～-697，pGLP/-1102～-774)與對照質(zhì)粒pGL3-Promoter相比較，組間的相對熒光素酶活性差異有顯著性或高度顯著性(P＜0.05或P＜0.01)。可以看出，將-1102～-697之間的DNA序列分為3個區(qū)段，-1102～-891之間的片段使相對熒光素酶活性降低33.5％，對轉(zhuǎn)錄活性有抑制作用；-890～-774之間的片段使相對熒光素酶活性升高13.1％，對轉(zhuǎn)錄活性有弱的增強作用；-773～-697之間的片段使相對熒光素酶活性升高63.9％，對轉(zhuǎn)錄活性有增強作用。而-1102～-774片段使相對熒光素酶活性降低14.6％，表現(xiàn)出對轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用，這與前面的實驗結(jié)果相一致，即質(zhì)粒pEZ1.324在刪除-1102～-774之間的序列時相對熒光素酶活性升高。
綜上，可以確定ezrin基因上游-1102～-697之間長406bp的DNA序列為重要的轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控區(qū)。-1102～-891之間212bp片段為ezrin基因負調(diào)控元件；-890～-774之間117bp片段為ezrin基因弱增強子序列；-773～-697之間77bp片段為ezrin基因增強子序列。
人食管癌細胞ezrin基因上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件序列表SEQUENCE LISTING<110>汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院<120>人食管癌細胞ezrin基因上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件<130>
<160>1<170>Patent In version 3.2<210>1<211>1893<212>DNA<213>人食管癌細胞(HUMAN ESOPHAGEAL CANCER CELLS)<400>1-1759 AGTGAATGCT GTTGCTGCTC GTCTGGAAGC CAGACGTTGA GAACCCCTTC-1709 TAGAGTGAGC TCTCCCGCAG CAAATTCTAC TGGCCCCCAA AGTATGTGTT-1659 TTGTGTGTCT TAAAAATTTG TTGAGAACCA TTAGCAAAAA AACAAACAAA-1609 AAAACTTAAT TCCTAGAATT CCAGAGAAAT CCCATGGAGC TTTTTGCCAG-1559 TCACGTCAAG AGAGGCCACA AACGTGCCAC TTAACCAGAG CTTCGGAAAG-1509 GCGGCGGCTG GGCCGGCCAC GTGCACCGAG ACTCGGGGCC AGGTGCAGCC-1459 GCCCCAGGGC CGAGGCCTCG GAACTGGCCC CCGGTCCCGG CCCCAAGCGG-1409 TCCAGCGATT CCCCCAAGCC GTCCGCCCCT CCAGATTTAT TTACGTTTTC-1359 CTGACTTCCC CCTGCCCGCT GTGGGACAAA CAGCCTCCCC ACTTGCATCT-1309 GCGAGGGGAG TAGCGCGCAC TTCCGCCAAG TTCCGCCCCC ACCCAGCCCG-1259 AGGCCCGGCT GCCGCCATCT TGCGGGGGGC GCACCTCACA GGTCGGGAGC-1209 TGGGCGGGAA GGGGCGTGGT CCCGGGACCC GCCCCGCCGG GGCTTTTGGG-1159 AGCGCGGGCA GCGAGCGCAC TCGGCGGACG CAAGGGCGGC GGGGAGCACA-1109 CGGAGCACTG CAGGCGCCGG GTGAGGCGTG CGGCGGCCGG GGTCGGGACG-1059 GGGGTTCTGG GCGGGGGGTT CCTGGTGGAG GGCCCGGGCG GGCGGCGGGG-1009 TTCGGCGGCA GGTGCGGCGG GCAGCCTAGG GGGCGCGGCG CGGGGTTCTC-959 GCCCGGCACC CCCGGGGCAG GTGGAGCTGA GCCGGCCCGC GGCCCCGCGA-909 CCTTCCCCTC GGCGCCGGGT CCCCTCAGGT CTCTCCCGAA GGAAACGCGG-859 AGCCTGGGTG CCTGGGCGCC GTCCCTCGGC GGCTCCCGAG CGGTTGCAGT-809 TTTTGAAAGA GTTTCTCAAA GGCTTGACGG TTGTGACTGC AGCCGCGGGG-759 CAACGGTTGC TACACAAAGT GAAACTTGCC GAGTGCTCGG CTTCTCACGG-709 GCTTCCTGGC AGCCCCGGGA AGTTCCTCGG CGGACCCCGA GCCCGCGCCC-659 CCTCTCCACG GATCCCTCCC CAGCGAGTGC CCCCCCGCCC GCCCTGTGCC-609 CCCTCTCCCC TGACCCCTCC CTGTCGGGTG CCCCGCGGGC TCGCGCTGGC-559 TGTCCTGGGA CTCCTTCCTC CTAGGTGTTC CTCCTGCCCC TCGCCCTCTC-509 TCTCCCAGGC GCGCGCTCCC TCTCCCCGGG CCTTTCCCCG CCGGGTATCC-459 CTGGGCCCGC GCCCCGTCTT CTCCGCCTCT CTCCGCTGGG TGCACCTCGA-409 GTGTCCCCCA GACCCCTCCC CGCCCGGCCG GCGCTCTCTC CCCTGACCCT-359 CCTGGCCGAG TGTTCCCCGG GGCCCGCGCC CCCTCCCCCC GATCCTCCCC-309 ACTGAGTGTT CCCCCTGCCC TCTCTCTCCC GGGCCTGCGC CCCCCACCAG-259 CCCCTTCATG CTGGGGGTCC CCTGGGTGCG CACCCCCTCT CCTCGGACCC-209 ACCCCCAACT GGGGGGCACC TCCAGTGCCC GCCGGCTGCC CCTTGGGCGC-159 GCGCCCCCGC TCTCGGGCGC CTCCTCGCCG GGGGCCCGGC CCGGCCCCGC-109 CCCGCCCGTG CCCCCTCCCC ATGCCCGCAG TGCTGGGCGG GGCGCTGACT-59 CACCCGGGCC CGGGCTGGCC GGTTCTTAAG CGGCAGCGCG CTGCGGGCGC-9CGAGTGTCGG GCGCGGCAGG AGGACGAGGC AGGGCGGGCG GGCGCTCTAA+42 GGGTTCTGCT CTGACTCCAG GTTGGGACAG CGTCTTCGCT GCTGCTGGAT+92 AGTCGTGTTT TCGGGGATCG AGGATACTCA CCAGAAACCG AAA<210>2<211>212<212>DNA<213>人食管癌細胞(HUMAN ESOPHAGEAL CANCER CELLS)<400>2-1102 CTGCAGGCGC CGGGTGAGGC GTGCGGCGGC CGGGGTCGGG ACGGGGGTTC-1052 TGGGCGGGGG GTTCCTGGTG GAGGGCCCGG GCGGGCGGCG GGGTTCGGCG-1002 GCAGGTGCGG CGGGCAGCCT AGGGGGCGCG GCGCGGGGTT CTCGCCCGGC-952 ACCCCCGGGG CAGGTGGAGC TGAGCCGGCC CGCGGCCCCG CGACCTTCCC-902 CTCGGCGCCG GG<210>3<211>117<212>DNA<213>人食管癌細胞(HUMAN ESOPHAGEAL CANCER CELLS)
人食管癌細胞ezrin基因上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件序列表<400>3-890 TCCCCTCAGG TCTCTCCCGA AGGAAACGCG GAGCCTGGGT GCCTGGGCGC-840 CGTCCCTCGG CGGCTCCCGA GCGGTTGCAG TTTTTGAAAG AGTTTCTCAA-790 AGGCTTGACG GTTGTGA<210>4<211>77<212>DNA<213>人食管癌細胞(HUMAN ESOPHAGEAL CANCER CELLS)<400>4-773 CTGCAGCCGC GGGGCAACGG TTGCTACACA AAGTGAAACT TGCCGAGTGC-723 TCGGCTTCTC ACGGGCTTCC TGGCAGC<210>5<211>329<212>DNA<213>人食管癌細胞(HUMAN ESOPHAGEAL CANCER CELLS)<400>5-1102 CTGCAGGCGC CGGGTGAGGC GTGCGGCGGC CGGGGTCGGG ACGGGGGTTC-1052 TGGGCGGGGG GTTCCTGGTG GAGGGCCCGG GCGGGCGGCG GGGTTCGGCG-1002 GCAGGTGCGG CGGGCAGCCT AGGGGGCGCG GCGCGGGGTT CTCGCCCGGC-952 ACCCCCGGGG CAGGTGGAGC TGAGCCGGCC CGCGGCCCCG CGACCTTCCC-902 CTCGGCGCCG GGTCCCCTCA GGTCTCTCCC GAAGGAAACG CGGAGCCTGG-852 GTGCCTGGGC GCCGTCCCTC GGCGGCTCCC GAGCGGTTGC AGTTTTTGAA-802 AGAGTTTCTC AAAGGCTTGA CGGTTGTGA<210>6<211>
<212>DNA<213>引物<400>6F15’-CGGGGTACCAGTGAATGCTGTTGCTGCTCGTCTGGAAG-3’R15’-CCCAAGCTTTCGGTTTCTGGTGAGTATCCTCGATCCC-3’<210>7<211>
<212>DNA<213>引物<400>7F25’-CGCGGATCCCTGCAGGCGCCGGGTGAGGCGTGC-3’F35’-CGCGGATCCTCCCCTCAGGTCTCTCCCGAAGGAAACGCG-3’F45’-CGCGGATCCCTGCAGCCGCGGGGCAACGGTTGCT-3’R25’-ACGCGTCGACCCCGGCGCCGAGGGGAAGGTCGC-3’R35’-ACGCGTCGACTCACAACCGTCAAGCCTTTGAGAAACTCTTTCAAAAACTGCAACCGC-3’R45’-ACGCGTCGACGCTGCCAGGAAGCCCGTGAGAAGCCGAG-3’
權(quán)利要求
1.一種人食管癌細胞ezrin基因上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，其核苷酸序列選自下組(1)SEQ ID NO2所示的核苷酸序列，(2)SEQ ID NO3所示的核苷酸序列，或(3)SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的人食管癌細胞ezrin基因上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，其特征在于含有至少一個控制ezrin基因表達的調(diào)控元件。
3.一種載體，它含有權(quán)利要求1所述的人食管癌細胞ezrin基因上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。
4.如權(quán)利要求3所述的載體，其特征在于，它還含有所述的人食管癌細胞ezrin基因上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件可操作地連接的外源基因。
5.如權(quán)利要求4所述的載體，其特征在于，所述外源基因是報告基因。
6.一種宿主細胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的載體。
7.如權(quán)利要求6所述的宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞是哺乳動物細胞。
8.如權(quán)利要求7所述的宿主細胞，其特征在于，所述哺乳動物細胞是人的細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因表達調(diào)控，公開了一種人食管癌細胞ezrin基因的上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)。本發(fā)明首次將ezrin基因上游序列插入含報告基因的載體構(gòu)建了一系列真核表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞瞬時表達，確定了人ezrin基因上游序列在食管癌細胞中的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，包括負調(diào)控元件和增強子序列。本發(fā)明對研究Ezrin在腫瘤細胞中的表達調(diào)控機制以及以Ezrin為靶點的臨床治療具有重要意義。將有助于從分子水平上探索食管癌的發(fā)病機制，為食管癌的防治提供新的理論依據(jù)。
文檔編號C12N15/85GK1966685SQ20061012368
公開日2007年5月23日 申請日期2006年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月21日
發(fā)明者許麗艷, 高書穎, 李恩民 申請人:汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院