一種增強(qiáng)外源基因表達(dá)的豬的ucoe調(diào)控元件片段的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種增強(qiáng)外源基因表達(dá)的豬的UC0E調(diào) 控元件片段。
【背景技術(shù)】
[0002] 染色體開放兀件（ubiquitouschromatinopeningelement，UC0E)能改變?nèi)旧w 結(jié)構(gòu)使其保持轉(zhuǎn)錄活性，這一元件主要包括位點(diǎn)控制區(qū)（locuscontrolregions,LCR)和 UCOE兩種類型。LCR只能在幾種特定的組織內(nèi)參與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。而UCOE在廣泛的 組織內(nèi)都能調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。在結(jié)構(gòu)組成上，那些包含看家基因的雙向轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子且被 豐富的無甲基化CpG島圍繞的基因組區(qū)域，因?yàn)槟軌蚪o予轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定高水平的表達(dá)，被定 義為UC0E。在調(diào)控基因表達(dá)時(shí)UC0E與組織特異性和整合位點(diǎn)無關(guān)，它能夠改變異染色質(zhì)結(jié) 構(gòu)使其活化處于開放狀態(tài)，進(jìn)而使基因始終保持轉(zhuǎn)錄而不沉默。調(diào)控元件UC0E的應(yīng)用有可 能使一系列載體的轉(zhuǎn)基因表達(dá)得以改善。
[0003] 現(xiàn)有研究一般認(rèn)為造成轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率低的主要因素之一是轉(zhuǎn)錄沉默，這通常與 整合位點(diǎn)周圍染色質(zhì)濃縮、CpG島的DNA序列甲基化以及組蛋白去乙?；@三個(gè)因素有關(guān)。 如果要使外源基因在宿主生物細(xì)胞中高效表達(dá)必須保證整合到動(dòng)物染色體中的表達(dá)載體 周圍的染色質(zhì)環(huán)境處于一個(gè)開放和活躍轉(zhuǎn)錄的狀態(tài)，不受表觀遺傳學(xué)修飾及其他生物學(xué)效 應(yīng)的影響。其次是選用調(diào)控成分如核基質(zhì)/核骨架附著區(qū)（S/MARs)、染色質(zhì)開放元件、啟動(dòng) 子、增強(qiáng)子等能實(shí)現(xiàn)目的基因在組織中高效、特異地表達(dá)。
[0004] 目前在轉(zhuǎn)基因技術(shù)中有兩個(gè)非常重要的應(yīng)用。一是快速生產(chǎn)重組蛋白，用于分子 生物化學(xué)基礎(chǔ)研究、藥物開發(fā)以及臨床應(yīng)用前研究。例如在治療學(xué)方面通過利用UC0E可 以控制常見的細(xì)胞因子受體Y鏈基因（IL2RG)的表達(dá)，并且證實(shí)這種調(diào)控對(duì)小鼠X-連鎖 SCID表型疾病有治療效果。另一種是能更快、更易識(shí)別那些可以大規(guī)模生產(chǎn)穩(wěn)定高水平的 治療學(xué)蛋白質(zhì)的克隆細(xì)胞系。例如利用調(diào)控元件UC0E的CpG島篩選能產(chǎn)生大量促紅細(xì)胞 生成素的CH0克隆細(xì)胞系(促紅細(xì)胞生成素屬于蛋白質(zhì)藥物，被廣泛用于治療腎功能衰竭， 以及化療引起的貧血等)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種豬的UC0E調(diào)控元件片段，能夠促進(jìn)或增強(qiáng)外源基因 在宿主細(xì)胞穩(wěn)定高效表達(dá)，為解決轉(zhuǎn)基因中出現(xiàn)基因沉默的問題提出了新的辦法和解決途 徑。
[0006] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下。
[0007] -種增強(qiáng)外源基因表達(dá)的豬的UC0E調(diào)控元件片段，長(zhǎng)度為957bp，該調(diào)控元件片 段的喊基序列如序列表所不。
[0008] 所述UC0E調(diào)控元件片段在外源蛋白表達(dá)方面的應(yīng)用，可以增強(qiáng)外源蛋白的表達(dá)。
[0009] 所述增強(qiáng)外源蛋白表達(dá)，是通過構(gòu)建重組質(zhì)粒表達(dá)載體pCpG-Mini-GFP-UCOE，轉(zhuǎn) 染HEK293T細(xì)胞，增強(qiáng)GFP表達(dá)。
[0010] 本發(fā)明以人的1. 5kbUC0E片段作為對(duì)照，利用酶切方法和RT-PCR方法將豬UC0E 片段分割成不同長(zhǎng)度的片段，構(gòu)建不同表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染J1EK293T細(xì)胞，通過實(shí)時(shí)熒光定量 PCR和Westernblot技術(shù)檢測(cè)報(bào)告基因GFP的相對(duì)表達(dá)量篩選出最佳的能夠增強(qiáng)外源基因 表達(dá)的UC0E片段序列，即本發(fā)明所請(qǐng)求保護(hù)的基因序列。
[0011] 本發(fā)明將篩選后的豬的957bpUC0E片段插入pCpG-Mini-GFP重組質(zhì)粒進(jìn)一步驗(yàn) 證UC0E片段功能。而選用該重組質(zhì)粒進(jìn)行UC0E功能驗(yàn)證是因?yàn)樗嬖谝韵乱恍﹥?yōu)勢(shì)，首 先該質(zhì)粒的真核部分是通過Nhel和Ncol雙酶切pCpGfree-mcs得到，而且報(bào)告基因GFP通 過Nhel和Ncol插入此真核部分，此部分還包括一個(gè)含0 -珠蛋白的MAR序列，它能夠使得 外源基因形成一個(gè)獨(dú)立的染色質(zhì)環(huán)，免受周圍異染色質(zhì)及位置效應(yīng)的影響，增強(qiáng)外源基因 的表達(dá)。其次，該質(zhì)粒的原核部分是在親本質(zhì)粒minicircle的attB位點(diǎn)和attP位點(diǎn)設(shè) 計(jì)引物擴(kuò)增得到的。選用minicircle質(zhì)粒的原核部分作為改造質(zhì)粒的一部分的原因是由 于親本質(zhì)粒minicircle通過①C31整合酶與I-Scel限制性內(nèi)切酶共同作用，在attB位點(diǎn) 和attP位點(diǎn)發(fā)生重組，可以得到minicircle微環(huán)質(zhì)粒。與常規(guī)質(zhì)粒相比，該微環(huán)質(zhì)粒小 且不含細(xì)菌的質(zhì)粒骨架，將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞中時(shí)可以降低免疫應(yīng)答風(fēng)險(xiǎn)并能消除異染色質(zhì) 使外源基因在體內(nèi)長(zhǎng)期高效表達(dá)。上述得到的真核部分和原核部分進(jìn)行重組得到新型重組 質(zhì)粒pCpG-Mini-GFP，它具有這兩部分的所有優(yōu)點(diǎn)。957bpUC0E片段插入此重組質(zhì)粒后，通 過阿拉伯糖誘導(dǎo)得到微環(huán)質(zhì)粒pCpG-Mini-GFP-UCOE，轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，通過實(shí)時(shí)熒光定 量PCR和Westernblot技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)微環(huán)質(zhì)粒pCpG-Mini-GFP-UCOE的GFP的表達(dá)量確實(shí) 高于對(duì)照組pCpG-Mini-GFP微環(huán)質(zhì)粒。這就進(jìn)一步驗(yàn)證了篩選后的UC0E片段能增強(qiáng)外源 基因的表達(dá)。
[0012] 綜上，本發(fā)明所提供的豬的UC0E片段具有材料易得、來源廣泛的優(yōu)勢(shì)，在增強(qiáng)外 源基因表達(dá)作用方面效果明顯，為基因工程的推廣應(yīng)用、研究開發(fā)提供了較好的研究基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0013] 圖1為豬UC0E調(diào)控元件示意圖，其中1是位于2個(gè)Nsil酶切位點(diǎn)的片段1，長(zhǎng)度 為4125bp;2是位于2個(gè)Notl酶切位點(diǎn)的片段2,長(zhǎng)度為1591bp;3是位于Nsil和Notl酶 切位點(diǎn)的片段3,長(zhǎng)度為1317bp;8是位于Nsil和Notl酶切位點(diǎn)的片段8,長(zhǎng)度為1217bp; 4是位于2個(gè)Xbal酶切位點(diǎn)的片段4,長(zhǎng)度為1897bp;9是位于Nsil和Xbal酶切位點(diǎn)的片 段9,長(zhǎng)度為377bp;10是位于Nsil和Xbal酶切位點(diǎn)的片段10,長(zhǎng)度為1851bp;5是位于 Nsil和EcoRI酶切位點(diǎn)的片段5,長(zhǎng)度為2773bp;13是位于Nsil和EcoRI酶切位點(diǎn)的片段 13,長(zhǎng)度為1352bp;6是位于Notl和Xbal酶切位點(diǎn)的片段6,長(zhǎng)度為957bp;14是位于Notl 和Xbal酶切位點(diǎn)的片段14,長(zhǎng)度為634bp; 11是位于Xbal和EcoRI酶切位點(diǎn)的片段11，長(zhǎng) 度為499bp;7是位于Notl和EcoRI酶切位點(diǎn)的片段7,長(zhǎng)度為1456bp;12是位于Notl和 EcoRI酶切位點(diǎn)的片段12,長(zhǎng)度為135bp; 圖2為豬肝臟組織基因組DNA的電泳圖； 圖3為pGEM-T-sUC0E質(zhì)粒的構(gòu)建，其中A是sUCOE的PCR擴(kuò)增圖，B是pGEM-T-sUC0E質(zhì)粒經(jīng)Mlul酶切的鑒定圖，M是MarkerIV; 圖4為pi號(hào)質(zhì)粒的構(gòu)建，其中A是pGEM-T-sUCOE質(zhì)粒經(jīng)Nsil酶切的電泳圖，B是 pDrive5-GFP-2質(zhì)粒經(jīng)Nsil酶切的電泳圖，C是pi號(hào)質(zhì)粒經(jīng)EcoRI酶切的鑒定圖；其中Ml是MarkerIV，M2 是MarkerV; 圖5為p2號(hào)質(zhì)粒的構(gòu)建，其中A是sUCOE經(jīng)Notl酶切的電泳圖，B是pDrive5-GFP-2 質(zhì)粒經(jīng)Notl酶切的電泳圖，C是p2號(hào)質(zhì)粒經(jīng)PvuII酶切的鑒定圖，其中Ml是DL5000,M2 是MarkerlV; 圖6為p3號(hào)質(zhì)粒的構(gòu)建，其中A是sUC0E3的PCR擴(kuò)增圖，B是sUC0E3經(jīng)Nsil和Notl雙酶切的電泳圖，C中1是pDrive5-GFP-2質(zhì)粒經(jīng)Nsil和Notl雙酶切的電泳圖，D中1是 P3號(hào)質(zhì)粒經(jīng)Xbal酶切的鑒定圖；M是DL5000 ; 圖7為p4號(hào)質(zhì)粒的構(gòu)建，其中A中1是pGEM-T-sUCOE質(zhì)粒經(jīng)Xbal酶切的電泳圖，A中2是pDrive5-GFP-2質(zhì)粒經(jīng)Xbal酶切的電泳圖，B是p4號(hào)質(zhì)粒經(jīng)NotI酶切的鑒定，M是 DL5000 ； 圖8為p5號(hào)質(zhì)粒的構(gòu)建，其中A中1是sUCOE經(jīng)Nsil和EcoRI雙酶切的電泳圖，A中 2是pDrive5-GFP-2質(zhì)粒經(jīng)Nsil和EcoRI雙酶切的電泳圖，B中1是p5號(hào)質(zhì)粒經(jīng)Xbal酶 切的鑒定圖；M是DL5000 ; 圖9為p6號(hào)質(zhì)粒的構(gòu)建，其中A中1是sUCOE經(jīng)Xbal酶切的電泳圖，A中2是pDrive5-GFP_2質(zhì)粒經(jīng)Notl和Xbal雙酶切的電泳圖，B中1是p6號(hào)質(zhì)粒經(jīng)PvuII酶切的 鑒定圖；M是DL5000 ; 圖10為P7號(hào)質(zhì)粒的構(gòu)建，其中A中1是sUCOE經(jīng)EcoRI酶切的電泳圖，A中2是pDrive5-GFP-2質(zhì)粒經(jīng)NotI和EcoRI雙酶切的電泳圖，B中1是p7號(hào)質(zhì)粒經(jīng)PvuII酶切的 鑒定圖；M是DL5000 ; 圖11為P8號(hào)質(zhì)粒的構(gòu)建，其中A是SUC0E8的PCR擴(kuò)增圖，B中1是SUC0E8經(jīng)Nsil和Notl雙酶切的電泳圖，C中1是p8號(hào)質(zhì)粒經(jīng)Smal酶切的鑒定圖；M是DL5000 ; 圖12為p9號(hào)質(zhì)粒的構(gòu)建，其中A是SUC0E9的PCR擴(kuò)增圖，B是pDrive5-GFP-2