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生物防治的制作方法

文檔序號(hào):467284閱讀:1675來(lái)源:國(guó)知局
生物防治的制作方法
【專(zhuān)利摘要】提供的是一種適于在節(jié)肢動(dòng)物雄性生殖系中條件表達(dá)效應(yīng)物基因的節(jié)肢動(dòng)物雄性生殖系基因表達(dá)系統(tǒng)。所述系統(tǒng)包括第一表達(dá)單元,所述第一表達(dá)單元包含效應(yīng)物基因和與其可操作連接的用于其的啟動(dòng)子;和第二表達(dá)單元。所述第二單元包含轉(zhuǎn)錄因子的編碼序列和可操作連接于其的上游調(diào)控元件,所述轉(zhuǎn)錄因子能夠作用于第一表達(dá)單元中的啟動(dòng)子上以驅(qū)動(dòng)所述效應(yīng)物基因的表達(dá)。所述上游調(diào)控元件包括轉(zhuǎn)錄因子的啟動(dòng)子;和臨近轉(zhuǎn)錄因子編碼序列起始位點(diǎn)的5’UTR。上游調(diào)控元件驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄因子足量表達(dá),從而轉(zhuǎn)錄因子蛋白轉(zhuǎn)而在減數(shù)分裂前驅(qū)動(dòng)效應(yīng)物基因的轉(zhuǎn)錄。還提供的是所述系統(tǒng)例如在生物防治和質(zhì)量控制方法中的用途。
【專(zhuān)利說(shuō)明】生物防治 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種能夠在節(jié)肢動(dòng)物,特別是昆蟲(chóng)中提供不育的,但競(jìng)爭(zhēng)性的精子的 表達(dá)系統(tǒng),以及其在所述節(jié)肢動(dòng)物的生物防治(群體控制),質(zhì)量控制和性選擇的方法中的 用途。
[0002] 引言
[0003] 經(jīng)濟(jì)重要的,對(duì)于世界的某些部分起初是本地的蟲(chóng)害,現(xiàn)在通過(guò)國(guó)際貿(mào)易和人的 活動(dòng)廣泛分布。此種害蟲(chóng)發(fā)展為巨大的群體并且在世界范圍內(nèi)對(duì)水果和蔬菜產(chǎn)生破壞性侵 染??赡艿目刂品椒ㄊ菑V泛的,包括誘餌噴灑,直接噴灑殺蟲(chóng)劑,生物防治,病蟲(chóng)害綜合治理 (IPM)方法和不育昆蟲(chóng)技術(shù)(sterileinsecttechnique,SIT)(Malacrida等人,2007)。然 而,目前的防治方法,絕大多數(shù)依賴(lài)于化學(xué)殺蟲(chóng)劑的使用。直接或誘餌噴灑二者都具有由于 蜜蜂的減少導(dǎo)致授粉減少的能力,和使動(dòng)物或人中毒的能力。另一方面,SIT是環(huán)境友好, 物種特異的害蟲(chóng)防治方法。其依賴(lài)于大量不育雄性的大量飼養(yǎng)、絕育和釋放,所述不育雄性 與野生的雌性交配,引起后代中野生群體的減少(Dyck等人,2005 ;Knipling,1955)。如果 將足夠的不育雄性釋放足量時(shí)間,目標(biāo)群體將瓦解。
[0004] SIT依賴(lài)于輻射以絕育目標(biāo)害蟲(chóng)物種,但這對(duì)釋放的昆蟲(chóng)具有負(fù)面影響(Alphey, 2002 ;Alphey,2007 ;Alphey等人,2007)。輻射影響昆蟲(chóng)的所有細(xì)胞,不僅是配子,并且因此 對(duì)釋放的昆蟲(chóng)一定程度的損害不可避免,可能對(duì)其性能具有負(fù)面影響(例如壽命或交配競(jìng) 爭(zhēng)性)。輻射-絕育需要在發(fā)育晚期進(jìn)行,限制了對(duì)釋放的選擇。而且,輻射儀器相對(duì)大和 昂貴(獲得或運(yùn)行),并趨向于產(chǎn)生對(duì)于一些方案可能不利的集中程度。最后,由于有關(guān)這 些儀器中放射性同位素的大量存在的安全性考慮,已經(jīng)是SIT計(jì)劃至今的主要支柱的基于 同位素的輻射器變得越發(fā)不受歡迎。
[0005] 特別是對(duì)于蚊子,過(guò)去已經(jīng)嘗試了輻射的備選方案。這些包括化學(xué)絕育和通過(guò) 使用細(xì)胞質(zhì)不相容性(cytoplasmicincompatibility(CI,由沃爾巴克體(Wolbachia)誘 導(dǎo)))絕育,但這些各個(gè)具有其自身的缺點(diǎn)。化學(xué)不育劑傾向于為毒性或誘變化合物,導(dǎo)致 對(duì)工人和環(huán)境安全的問(wèn)題。基于沃爾巴克體(Wolbachia)的系統(tǒng)依賴(lài)于自然環(huán)境中缺乏任 何相當(dāng)?shù)奈譅柊涂梭w(Wolbachia)感染的雌性(其可能不是這樣的),并且還需要不釋放此 種雌性;此種嚴(yán)格的雌雄分離可能難以實(shí)現(xiàn)??梢酝ㄟ^(guò)使用重組DNA方法克服這和其它與 目前的SIT相關(guān)的其它問(wèn)題(Morrison等人,2010 ;Franz&Robinson,2011)。
[0006] 已經(jīng)建議了輻射-絕育的轉(zhuǎn)基因備選方案,稱(chēng)為攜帶顯性致死因子昆蟲(chóng)的釋放 (RIDL:(Alphey,2002 ;Alphey,2007;Alphey和Andeasen,2002;Alphey等人,2010;Alphey等人,2007 ;Alphey和Thomas, 1999 ;Thomas等人,2000)。在該系統(tǒng)中,改造昆蟲(chóng)以攜帶顯 性可抑制致死基因或遺傳系統(tǒng)。將這些釋放到野外;野生昆蟲(chóng)和經(jīng)遺傳獲得RIDL基因或構(gòu) 建體拷貝的RIDL昆蟲(chóng)之間交配的后代將傾向于死亡??梢栽O(shè)計(jì)RIDL系統(tǒng)以殺滅經(jīng)遺傳獲 得它的所有后代或僅一個(gè)性別。還可以設(shè)計(jì)以殺滅發(fā)育的特定階段的受影響的昆蟲(chóng);在一 些物種,例如一些蚊子(Phuc等人,2007)中,這可以具有顯著的優(yōu)勢(shì)。已經(jīng)在很多害蟲(chóng)物 種中構(gòu)建了RIDL系統(tǒng)(例如Fu等人,2007 ;Gong等人,2005 ;Phuc等人,2007)。可以在W0 01/39599中找到RIDL系統(tǒng)方面的進(jìn)一步信息。
[0007] 我們的雌性致死RIDL技術(shù)(雌性-特異RIDL,fsRIDL)在分離性別方面高度有 效,甚至有時(shí)差不多1〇〇%有效,并且成功地在實(shí)驗(yàn)室、溫室和半現(xiàn)場(chǎng)(semi-field)實(shí)驗(yàn)中 測(cè)試。RIDL可由在有或無(wú)輻射的情況下使用以產(chǎn)生有效產(chǎn)物。
[0008] 盡管事實(shí)上該技術(shù)對(duì)于許多害蟲(chóng)上的SIT實(shí)施提供相當(dāng)大的優(yōu)勢(shì),比如果蠅; 地中海果蠅(Ceratitiscapitata),橄欖果蠅(Bactroceraoleae)和墨西哥按實(shí)蠅 (Anastrephaludens),鱗翅目(Lepidoptera);紅鈴麥蛾(Pectinophoragossypiella) 和菜蛾(Plutellaxylostella)和蚊子;埃及伊蚊(Aedesaegypti)和白紋伊蚊(Aedes albopictus),并且可以各自被使用,在某些市場(chǎng)中,輻射仍然可以是絕育方法。這是因?yàn)椋?在至今描述的雌性-特異的RIDL株中,F(xiàn)1雄性是完全可存活的并且雌性在幼蟲(chóng)期(即卵 孵化后)被消除。此外,通過(guò)提供遺傳絕育(或賦予遺傳絕育的特性)將顯著緩解常規(guī)途 徑和公眾接受度。雄性中的遺傳絕育會(huì)有利地增強(qiáng)我們目前的"雌性致死"(fs-RIDL)株。
[0009] 因此,在本領(lǐng)域中存在在雄性中提供類(lèi)似于SIT方法中的輻射效果的遺傳絕育手 段,而無(wú)放射的個(gè)體中相關(guān)的健康降低的表達(dá)系統(tǒng)的需求。
[0010] Crisanti等人,(Catteruccia等人,2009;Windbichler等人,2007;Windbichler 等人,2008)已開(kāi)發(fā)出核酸內(nèi)切酶(Ipp〇-l,也稱(chēng)為I-Ppol)連接于組成型結(jié)構(gòu)基因,0-2微 管蛋白的啟動(dòng)子的表達(dá)系統(tǒng)。本文中描述的其中該系統(tǒng)的許多問(wèn)題,尤其是在達(dá)到其目的 方面,實(shí)驗(yàn)總體上不成功。然而,對(duì)遺傳絕育效果的時(shí)機(jī)能夠發(fā)揮一定程度的控制也將是特 別有用的。該控制在Crisanti系統(tǒng)中不存在。
[0011] 例如,人們可能想要允許在實(shí)驗(yàn)室中飼養(yǎng)攜帶表達(dá)系統(tǒng)的個(gè)體,但還想要系統(tǒng)在 需要時(shí),比如在釋放時(shí)或釋放前/后立即,激活或引發(fā)。換句話(huà)說(shuō),人們可能想要在特定點(diǎn) 抑制系統(tǒng)的效果和/或誘導(dǎo)它。
[0012] 簡(jiǎn)言之,希望這種表達(dá)系統(tǒng)包括對(duì)表達(dá)系統(tǒng)的效果發(fā)揮控制的手段。此種控制常 被稱(chēng)為"條件性,"從而包括該控制的系統(tǒng)為條件系統(tǒng)。條件表達(dá)系統(tǒng)例如在昆蟲(chóng)中(但不 是在目前的遺傳絕育情況下)已知。在任何情況下,這些條件系統(tǒng)不適于雄性生殖系表達(dá)。 事實(shí)上,為了利用存在的條件系統(tǒng),比如雙重tet系統(tǒng),人們不能簡(jiǎn)單地將它們包括在更大 的雄性生殖系表達(dá)系統(tǒng)中。在雄性生殖系如此操作,對(duì)效應(yīng)物(設(shè)計(jì)在所述生殖系實(shí)現(xiàn)遺 傳絕育)的控制表達(dá)無(wú)用。其原因復(fù)雜,但集中于由減數(shù)分裂引起的獨(dú)特條件。
[0013] 盡管這樣,我們意外地開(kāi)發(fā)了用于在雄性生殖系中表達(dá)的合適系統(tǒng)。該系統(tǒng)能夠 提供就所述系統(tǒng)在生殖系中的表達(dá)產(chǎn)生不能形成可成活受精卵的精子這方面而言的遺傳 絕育。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn),可以利用條件系統(tǒng)比如tet的使用,但需要整個(gè)表達(dá)系統(tǒng)的顯著全面 檢查。我們發(fā)現(xiàn)的系統(tǒng)巧妙地重復(fù)了SIT方法中的輻射效果,這是極為有利的。實(shí)質(zhì)上,其 允許產(chǎn)生雄性不育昆蟲(chóng),而不采取使動(dòng)物虛弱的輻射的使用。
[0014] 因此,我們展示了一種節(jié)肢動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng),其包含通過(guò)可以使能夠誘導(dǎo)條件遺傳 絕育,本文有時(shí)稱(chēng)為"精子致死性"的其它調(diào)節(jié)區(qū)域用于條件系統(tǒng)的合適效應(yīng)物。然而,將 理解優(yōu)選的目的不是殺死精子本身或甚至阻止其生產(chǎn),反而是產(chǎn)生不能傳遞其遺傳信息的 精子。然而,相反地,所述精子能夠與野生型精子競(jìng)爭(zhēng)或使受精卵不可成活(即阻止可成活 受精卵的形成)。
[0015] 這通過(guò)提供條件的,和優(yōu)選可抑制的,雄性不育解決上述問(wèn)題,其通過(guò)允許產(chǎn)生從 不能使卵受精以產(chǎn)生可成活受精卵或胚胎(其能夠發(fā)展為不育成體)的意義上是缺陷的, 但仍然能夠進(jìn)入或與卵接觸以這種方式來(lái)排斥其它精子的精子起作用。
[0016] 可以在GB2404382A,GB2355459A,JP2008067678A,W02009/016627A, W02008/134068A,WCBlack等人(TrendsinParasitology,362-370,第 27 卷,2011),C Barreau等人(Development,1897-1902,第 135 卷,2008),GFu等人(ProcNatlAcadSci USA,4550-4554,第 107 卷,2010)和TAnt等人(BMCBiology,51,第 10 卷,2012)中找到進(jìn) 一步技術(shù)背景信息。
[0017] 發(fā)明概述
[0018] 因此,在第一個(gè)方面,本發(fā)明提供一種適于在節(jié)肢動(dòng)物雄性生殖系中條件表達(dá)效 應(yīng)物基因的節(jié)肢動(dòng)物雄性生殖系基因表達(dá)系統(tǒng),所述系統(tǒng)包含:
[0019] -第一表達(dá)單元,所述第一表達(dá)單元包含效應(yīng)物基因和可操作連接于其的用于其 的啟動(dòng)子;
[0020] -第二表達(dá)單元,所述第二表達(dá)單元包含轉(zhuǎn)錄因子的編碼序列和可操作連接于其 的上游調(diào)控元件,所述轉(zhuǎn)錄因子能夠作用于第一表達(dá)單元中的啟動(dòng)子以驅(qū)動(dòng)效應(yīng)物基因的 表達(dá),所述上游調(diào)控元件包括:
[0021] -轉(zhuǎn)錄因子的啟動(dòng)子;和
[0022] -臨近轉(zhuǎn)錄因子編碼序列翻譯起始位點(diǎn)的5'UTR;
[0023] 所述上游調(diào)控元件驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄因子的足量表達(dá),從而所述轉(zhuǎn)錄因子蛋白轉(zhuǎn)而在減數(shù) 分裂前驅(qū)動(dòng)效應(yīng)物基因的轉(zhuǎn)錄。
[0024] 所述轉(zhuǎn)錄因子優(yōu)選為轉(zhuǎn)錄激活劑,比如tTA,GAL4或其變體。所述效應(yīng)物優(yōu)選為核 酸內(nèi)切酶,最優(yōu)選為3-鋅指核酸酶。第一表達(dá)單元的啟動(dòng)子優(yōu)選為最小啟動(dòng)子。第二表達(dá) 單元中上游調(diào)控元件的啟動(dòng)子最優(yōu)選自topi,aly或0-2微管蛋白(B2T)或其同源物。所 述同源物優(yōu)選為在所述系統(tǒng)要表達(dá)于其中在目標(biāo)節(jié)肢動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的同源物。該啟動(dòng)子是雄 性生殖系啟動(dòng)子,即其在雄性生殖系中作用于或激活轉(zhuǎn)錄。第二表達(dá)單元的上游調(diào)控元件 中的5'UTR優(yōu)選為來(lái)自hsp83,優(yōu)選來(lái)自地中海果蠅(Medfly)或hsp83的同源物的5'UTR, 特別是來(lái)自在目標(biāo)節(jié)肢動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的hsp83同源物(即所述系統(tǒng)要表達(dá)于其中的同源物) 的5'UTR。備選地,所述5'UTR可以是來(lái)自B2T或其同源物的5'UTR,條件是所述5'UTR 被修改以去除或改善野生型中包含的轉(zhuǎn)錄延遲信號(hào)的效果,特別是如果與B2T啟動(dòng)子組合 使用時(shí)。
[0025] 所述第一或第二表達(dá)單元還可以包含增強(qiáng)子。第一和第二表達(dá)單元啟動(dòng)子之一或 二者,尤其是最小啟動(dòng)子,可以考慮進(jìn)一步包括增強(qiáng)子。
[0026] 可以在相同構(gòu)建體內(nèi)分開(kāi)或一起提供所述表達(dá)單元。如果分開(kāi),那么所述表達(dá)系 統(tǒng)可以包含分開(kāi)的多個(gè)構(gòu)建體。所述一個(gè)構(gòu)建體或多個(gè)構(gòu)建體優(yōu)選為質(zhì)粒。所述質(zhì)粒可以 包含轉(zhuǎn)座子。所述轉(zhuǎn)座子可以轉(zhuǎn)而包含轉(zhuǎn)座元件。轉(zhuǎn)座子的實(shí)例可以包括piggyBac轉(zhuǎn)座 子。
[0027] 表達(dá)效應(yīng)物基因的條件性質(zhì)是其可以由使用者控制或否則受外界因素影響。此種 因素可以是環(huán)境因素比如溫度(例如在使用Gal4_UAS系統(tǒng)的情況中),但最優(yōu)選為化學(xué)實(shí) 體,比如四環(huán)素或其類(lèi)似物??梢栽趯?shí)驗(yàn)室控制溫度,并且可以設(shè)想可以利用日或季節(jié)進(jìn)程 中的溫度改變。然而,在一些實(shí)施方案中,這不是優(yōu)選的,因?yàn)槿藗兛赡芟M@得更精細(xì)程 度的控制。在此種情況下,特別優(yōu)選所述系統(tǒng)從為誘導(dǎo)型的和最優(yōu)選為可抑制的意義上是 條件性的。
[0028] 誘導(dǎo)型系統(tǒng)是已知的,例如可以使用GAL4-UAS設(shè)置,其中轉(zhuǎn)錄因子是GAL4并且第 一表達(dá)包含(效應(yīng)物基因編碼序列外)GAL4結(jié)合的UAS區(qū)域(CGG-Nn-CCG,其中N可以是 任何堿基),或優(yōu)選為其寡聚物。如果第二表達(dá)單元中的上游調(diào)控元件包含合適啟動(dòng)子和 5'UTR,那么Gal4轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄可以通過(guò)提供例如作用于Gal4轉(zhuǎn)錄因子的啟動(dòng)子(直接 或間接,即引起轉(zhuǎn)錄被誘導(dǎo))的肽或激素被誘導(dǎo)。
[0029] 在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)例中,所述系統(tǒng)可以是誘導(dǎo)型系統(tǒng),其中誘導(dǎo)通過(guò)提供化學(xué)實(shí) 體,如四環(huán)素或包括多西環(huán)素的其類(lèi)似物中一種發(fā)生。在此種情況下,可以使用rtTA("反組 tTA")作為轉(zhuǎn)錄因子,例如,從而rtTA僅在四環(huán)素類(lèi)似物比如多西環(huán)素的在在下結(jié)合DNA。 rtTA描述于W0 2001/059088等中。在此情況下,提供四環(huán)素(即在飲食中)或類(lèi)似物比如 多西環(huán)素將允許rtTA轉(zhuǎn)錄因子在本系統(tǒng)中作用于第一表達(dá)單元并以此誘導(dǎo)本效應(yīng)物基因 的表達(dá)。
[0030] 然而,優(yōu)選所述系統(tǒng)是可抑制的。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)例是第二表達(dá)單元中的轉(zhuǎn)錄因子 是tTA或其變體(tTAV,tTAV2,tTAV3等)。這些結(jié)合DNA除非四環(huán)素(Tc),或適當(dāng)類(lèi)似物 存在。四環(huán)素將阻斷tTA的DNA-結(jié)合,從而在tTA和第一表達(dá)單元的增強(qiáng)子之間不存在相 互作用,因此,效應(yīng)物基因不轉(zhuǎn)錄。因此,如公知的(參見(jiàn)例如本文提及的我們的RIDL發(fā) 表),可以將四環(huán)素提供在飲食中直到需要去抑制(即去除或緩解抑制)表達(dá)效應(yīng)物基因的 時(shí)候。在缺失四環(huán)素(或類(lèi)似物比如多西環(huán)素)的情況下,比如野外釋放后或在切換實(shí)驗(yàn) 室中飲食時(shí),效應(yīng)物基因表達(dá)。
[0031] 因此,在一些實(shí)施方案中,優(yōu)選所述系統(tǒng)為誘導(dǎo)型,但在其它特別優(yōu)選的實(shí)施方案 中,所述系統(tǒng)是可抑制的。
[0032] 兩個(gè)表達(dá)單元優(yōu)選為雙重(條件的)表達(dá)系統(tǒng)的兩個(gè)部分中的一個(gè)。優(yōu)選的實(shí)例 包括GAL4 :UAS和各種tet系統(tǒng)。在第一種情況中,第二表達(dá)單元的轉(zhuǎn)錄因子優(yōu)選為Gal4, 同時(shí)所述第一表達(dá)單元優(yōu)選包含用于GAL-4結(jié)合的UAS序列。還預(yù)想GAL4的合適變體,t匕 如GAL4-VP16。
[0033] -般而言,表達(dá)單元之一或二者可以包含增強(qiáng)子。然而,特別優(yōu)選所述第一表達(dá)單 元包含增強(qiáng)子。優(yōu)選第二表達(dá)單元的轉(zhuǎn)錄因子是tTA或變體(即當(dāng)本表達(dá)系統(tǒng)使用tet系 統(tǒng)提供條件性)。當(dāng)是這種情況時(shí),那么第一表達(dá)單元優(yōu)選包括tet操縱子(tetO)otetO-微 型啟動(dòng)子(tRE)元件是特別優(yōu)選的。其一起提供第二表達(dá)單元上游調(diào)控元件的啟動(dòng)子和增 強(qiáng)子元件。426-bpTRE啟動(dòng)子含有七個(gè)融合于微型巨細(xì)胞病毒(mini-CMV)啟動(dòng)子tetO18 聚體(參見(jiàn)例如M.Ghosh等人,Mol.CellBiol. 2004, 24 (23) 10193)。
[0034] 盡管雙重系統(tǒng)是優(yōu)選的,其中以分開(kāi)的構(gòu)建體提供第一和第二表達(dá)單元,所述第 一表達(dá)單元和第二表達(dá)單元也可以提供在相同構(gòu)建體或質(zhì)粒上。從而,本系統(tǒng)優(yōu)選為一個(gè) 質(zhì)?;蛴蓛蓚€(gè)質(zhì)粒組成。最優(yōu)選所述兩個(gè)表達(dá)單元作為單個(gè)質(zhì)?;蜉d體轉(zhuǎn)化,從而它們插 入在基因組的相同位點(diǎn)。
[0035] 所述節(jié)肢動(dòng)物優(yōu)選為如下文進(jìn)一步描述的昆蟲(chóng)。雄性生殖系將被理解為包括精 子,從而所述系統(tǒng)能夠在精子中表達(dá)所述效應(yīng)物基因。
[0036] 在至少一些情況下,所述效應(yīng)物賦予或給予父本效應(yīng)致死性,即是"父本效應(yīng)致 死"遺傳系統(tǒng),或是"父本效應(yīng)致死"遺傳系統(tǒng)的部分。在此種系統(tǒng)中,后代(這里采用從精 子進(jìn)入卵的階段,其在昆蟲(chóng)中可以不與膜融合同時(shí))的死亡依賴(lài)于父本的基因型而不是受 精卵(或可能的受精卵)的基因型。因此,例如,在顯性父本效應(yīng)致死系統(tǒng)中,來(lái)自雜合雄性 與(純合)野生型雌性交配的野生型后代中的至少一些將受影響。另外的合子效果當(dāng)然是 可能,并且預(yù)期在本發(fā)明內(nèi)。對(duì)于此效應(yīng)物,一些可能的作用模式是可能的和設(shè)想到的。例 如,在一些實(shí)施方案中,所述效應(yīng)物是或包含核酸酶。從而,通過(guò)我們稱(chēng)為"父本效應(yīng)致死" 實(shí)現(xiàn)不育。這里,將效應(yīng)物表達(dá)(以提供功能核酸酶蛋白)于精子中。這可以導(dǎo)致精子中 DNA受影響,從而受精的胚胎具有降低的存活幾率;實(shí)質(zhì)上,這是父本效應(yīng)致死性可以實(shí)現(xiàn) 所通過(guò)的機(jī)制的優(yōu)選實(shí)例。還可能所述效應(yīng)物蛋白進(jìn)入卵,其中DNA切割也可以發(fā)生。然 而,還預(yù)想到至少一些效應(yīng)物轉(zhuǎn)錄本也可以從精子進(jìn)入卵并且在卵中翻譯。在這兩種情況 中,核酸酶效應(yīng)物可以從而在卵以及精子中發(fā)揮其作用
[0037]所述系統(tǒng)適于表達(dá)效應(yīng)物,但將理解這還可以?xún)?yōu)選被稱(chēng)為'能夠如此表達(dá)'或'適 應(yīng)于在雄性生殖系中表達(dá)效應(yīng)物'。
[0038]所述效應(yīng)物基因?qū)⒃谙挛倪M(jìn)一步描述,但其優(yōu)選為報(bào)道分子,比如標(biāo)記,例如熒光 蛋白比如GFP,YFP等等。然而,所述效應(yīng)物基因更優(yōu)選為核酸酶,其合適實(shí)例在下文提供。 其最優(yōu)選為既是核酸酶又是報(bào)道分子,例如核酸酶_熒光蛋白融合(其優(yōu)選的實(shí)例包括公 知的綠色熒光蛋白或黃色熒光蛋白)。
[0039]本文中述及'是'報(bào)道分子或核酸酶的基因,例如,將理解所述基因包括編碼具有 那種陳述的功能的蛋白的DNA或RNA。
[0040]所述第一表達(dá)單元包含效應(yīng)物基因。它還包含用于其的啟動(dòng)子并且所述啟動(dòng)子可 操作連接于其。所述啟動(dòng)子因此適于驅(qū)動(dòng)效應(yīng)物基因的轉(zhuǎn)錄。如上文提到的,所述第一表 達(dá)單元還可以包含增強(qiáng)子,或至少第二表達(dá)單元的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合區(qū)域或序列(即由所述 轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別)。
[0041]所述第二表達(dá)單元包含轉(zhuǎn)錄因子的編碼序列。其還包含上游調(diào)控元件。這轉(zhuǎn)而可 操作連接于轉(zhuǎn)錄因子的編碼序列,以致它可以驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄。
[0042]所述轉(zhuǎn)錄因子能夠作用于第一表達(dá)單元中的啟動(dòng)子以驅(qū)動(dòng)效應(yīng)物基因的表達(dá),盡 管這當(dāng)然可以通過(guò)增強(qiáng)子,即所述轉(zhuǎn)錄因子可以不直接作用在啟動(dòng)子上,而取而代之的是 通過(guò)增強(qiáng)子。當(dāng)然預(yù)想到其它調(diào)控元件比如對(duì)于5'帽,5'UTR,3'UTR和多聚腺苷酸尾的那 些。
[0043]為了驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄,第二表達(dá)單元的上游調(diào)控元件包含啟動(dòng)子和5'UTR。這 兩種都需要仔細(xì)選擇以提供效應(yīng)物的足量表達(dá)。從而,第二表達(dá)單元(即在上游調(diào)控元件 中)的啟動(dòng)子優(yōu)選為來(lái)自0-2微管蛋白(B2T)的啟動(dòng)子。備選地,并且所述啟動(dòng)子更優(yōu)選 來(lái)自topi或aly。第二表達(dá)單元(即上游調(diào)控元件中)中的5'UTR優(yōu)選為來(lái)自hsp83,例 如來(lái)自地中海果蠅(Medfly)的5'UTR,但其也可以來(lái)自B2T。如果5'UTR和啟動(dòng)子二者都 來(lái)自B2T,則一個(gè)或另一個(gè)必需被修改為翻譯延遲信號(hào)被去除或改善。當(dāng)然述及這些基因時(shí) 包括其同源物。
[0044] 本文將5'UTR定義為與翻譯起始位點(diǎn)(即最低限度地,翻譯的ATG起始位點(diǎn))5' 相鄰(即上游)的序列。其在真核生物中具有約150個(gè)堿基的中值長(zhǎng)度并且優(yōu)選延伸直到 啟動(dòng)子,例如在ATG起始位點(diǎn)上游約50-500個(gè)堿基處。
[0045] 盡管第二表達(dá)單元中框架的主體可以來(lái)自B2T,即使B2T0RF以轉(zhuǎn)錄因子0RF替 代,將理解第二表達(dá)單元的啟動(dòng)子和其5'UTR二者不能都是來(lái)自B2T的那些:至少需要將它 們之一改變以在減數(shù)分裂發(fā)生前提供效應(yīng)物轉(zhuǎn)錄本的足夠積累。如果要使用B2T啟動(dòng)子, 那么B2T5'UTR必需是上文描述的修改/改善的形式,或其可以是來(lái)自hsp83的5'UTR。
[0046] 備選地,如果使用B2T5'UTR,那么所述啟動(dòng)子必需是其它早期作用啟動(dòng)子。所需 要的是對(duì)于第二表達(dá)元件的5'UTR和啟動(dòng)子的選擇必須一起作用以在減數(shù)分裂發(fā)生前允 許效應(yīng)物轉(zhuǎn)錄本的足量積累。
[0047] 備選啟動(dòng)子的優(yōu)選實(shí)例是topi和aly啟動(dòng)子??梢耘c一些5'UTR使用這些啟動(dòng) 子。其序列的實(shí)例在下文提供。
[0048] 當(dāng)對(duì)特定遺傳元件比如啟動(dòng)子,增強(qiáng)子,5'UTR或甚至'來(lái)自'某命名的基因的0RF 進(jìn)行引用時(shí),將理解它實(shí)際上不意為將所述元件從引用的基因去除,其僅意為這是元件的 來(lái)源。描述它的其它方式會(huì)是'源自'。優(yōu)選基因的物種來(lái)源與目標(biāo)物種的來(lái)源相同。換句 話(huà)說(shuō),在想要在地中海果蠅(Medfly)中表達(dá)本效應(yīng)物的情況下,優(yōu)選所述元件源自提到的 基因的地中海果蠅(Medfly)同源物。然而,如果不這樣,貝U果蠅(Drosophila)版本是優(yōu)選 的。
[0049] 事實(shí)上,優(yōu)選偏好的遞降次序是:
[0050]_(最優(yōu)選)來(lái)自目標(biāo)物種(其中效應(yīng)物的表達(dá)是預(yù)想到的);
[0051]-來(lái)自目標(biāo)屬(即來(lái)自相同屬內(nèi)的其它物種);和最后
[0052] _ (最不優(yōu)選)來(lái)自目標(biāo)科。
[0053] 原因是,優(yōu)選的啟動(dòng)子的作用至少可以是跨物種非常良好保守的。例如,果蠅 (Drosophila)啟動(dòng)子可以在地中海果蠅(Medfly)中不工作,因此來(lái)自相同基因的地中海 果蠅(Medfly)同源物的啟動(dòng)子是優(yōu)選的。然而,因?yàn)榫幋a序列是良好保守的,(例如)在給 定節(jié)肢動(dòng)物中鑒定3-2-微管蛋白基因和因此通過(guò)常規(guī)方法鑒定地中海果蠅(Medfly)版 本的合適啟動(dòng)子片段相對(duì)簡(jiǎn)單。
[0054] 通常在mRNA的轉(zhuǎn)錄起始上游1至2kb內(nèi)鑒定合適啟動(dòng)子。盡管在本發(fā)明中該范 圍是優(yōu)選的,一些雄性生殖系啟動(dòng)子可以短并且100_200bp的一段序列也是優(yōu)選的,或者 在mRNA的轉(zhuǎn)錄上游l-2kb窗內(nèi),或甚至mRNA的轉(zhuǎn)錄起始上游的100-200bp的一段序列。
[0055] 就序列保守性而言,關(guān)于5'UTR,應(yīng)用類(lèi)似的考慮,其中最初序列保守性低。因此, 優(yōu)選5'UTR來(lái)自與目標(biāo)節(jié)肢動(dòng)物相同的物種(例如按照上文實(shí)例),如果目標(biāo)是地中海果 蠅(Medfly),那么5'UTR優(yōu)選為來(lái)自相同基因的地中海果蠅(Medfly)同源物的5'UTR(可 如上文討論的通過(guò)參考更高度保守的0RF鑒定)。鑒定和限定5'UTR的一種方式是其(作 為RNA)與編碼相應(yīng)0RF,例如3 -2微管蛋白的序列的5'端連接。
[0056] 在5'UTR和啟動(dòng)子二者的情況下,將很容易被鑒定用于本表達(dá)的序列是否不足 量,因?yàn)閷o(wú)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá),其可以通過(guò)通常方式測(cè)定,或通過(guò)提供將轉(zhuǎn)錄因子0RF連接于 熒光蛋白來(lái)測(cè)試。
[0057] 優(yōu)選地,第二表達(dá)單元的上游調(diào)控元件中的啟動(dòng)子是0-2-微管蛋白啟動(dòng)子。與 本文描述的hsp83 5'UTR組合使用(第二表達(dá)單元的上游調(diào)控元件中)是最優(yōu)選的。
[0058] 還優(yōu)選上游調(diào)控元件中的啟動(dòng)子是topi啟動(dòng)子。為了幫助鑒定topi的同源物, 我們?cè)诖颂峁﹖opi0RF(參見(jiàn)下文)。進(jìn)一步指導(dǎo)在Perzgasga等人(2004)中提供,例如, 其通過(guò)引用并入本文并且描述了來(lái)自黑腹果蠅Orosophilamelanogaster),Drosophila pseudoobscura和岡比亞按蚊(Anophelesgambiae)的topi同源物,后者是特別優(yōu)選的。
[0059] 備選地,優(yōu)選上游調(diào)控元件中的啟動(dòng)子是aly啟動(dòng)子。Aly比topi表示更近的基 因復(fù)制,因此不以如topi-樣寬范圍的物種中的雄性生殖系特異基因存在。盡管如此,在 它存在的情況下,可以通過(guò)參考保守的0RF以與對(duì)于topi相同的方式容易地鑒定。aly0RF 在下文提供。
[0060] 第二表達(dá)單元的轉(zhuǎn)錄因子優(yōu)選為tTA或其變體并且第一表達(dá)單元包含tet操縱子 (tetO)。tTA,tTAV,tTAV2和tTAV3的氨基酸序列在下文給出。
[0061] 因此優(yōu)選第二表達(dá)單元的轉(zhuǎn)錄因子包含編碼tTA或其變體,例如上文給出的那些 的氨基酸序列中任一個(gè)的多核苷酸。如上文描述的,還優(yōu)選所述轉(zhuǎn)錄因子是GAL4或其變體 并且所述第一表達(dá)單元包含GAL4的UAS位點(diǎn)。
[0062] 對(duì)于tTA和Gal4二者,這優(yōu)選包括與所述SEQIDN0S(包括所述變體)中的一個(gè) 在至少50個(gè)殘基上具有(或編碼)至少70%,至少90%或至少95%氨基酸序列'同一性' 或甚至更不嚴(yán)格的'相似性'的任何序列。
[0063] 將理解轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別序列(DNA,例如,轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的序列)的放置,不許在第一 表達(dá)單元內(nèi)并且不在0RF內(nèi)。例如,以tetO和UAS二者,插入在例如ATG起始位點(diǎn)上游幾 千堿基內(nèi)。它們通常置于啟動(dòng)子的幾百個(gè)堿基內(nèi),但可以作用在幾kb外。
[0064] 在任何情況中,優(yōu)選所述啟動(dòng)子是最小啟動(dòng)子。為簡(jiǎn)單起見(jiàn),與增強(qiáng)子一起,可以 將{增強(qiáng)子+最小啟動(dòng)子}僅稱(chēng)為啟動(dòng)子。然后,增強(qiáng)子(轉(zhuǎn)錄激活劑結(jié)合位點(diǎn),例如tetO 或UAS)是定義的啟動(dòng)子的一部分。
[0065] 附圖簡(jiǎn)述
[0066] 現(xiàn)在將參考以下附圖描述本發(fā)明的某些實(shí)施方案,其中:
[0067] 圖1是表示卵孵化率測(cè)定的設(shè)計(jì)的示意圖;
[0068] 圖2顯示開(kāi)和關(guān)四環(huán)素時(shí)0X4282-0X4104雄性不育的百分?jǐn)?shù);
[0069] 圖3顯示開(kāi)和關(guān)四環(huán)素時(shí)0X4282-0X4458雄性不育的百分?jǐn)?shù);
[0070] 圖4顯示開(kāi)和關(guān)四環(huán)素時(shí)0X4353雄性不育的百分?jǐn)?shù);
[0071] 圖5顯示開(kāi)和關(guān)四環(huán)素時(shí)0X4353雌性不育的百分?jǐn)?shù);
[0072] 圖6顯示在0X4718- 〇 1系中可抑制的雄性特異不育;
[0073] 圖7顯示開(kāi)和關(guān)四環(huán)素時(shí)0X4705橄欖果蠅(Olivefly)雄性不育的百分?jǐn)?shù);
[0074] 圖8顯示開(kāi)和關(guān)四環(huán)素時(shí)0X4705雌性不育的百分?jǐn)?shù);
[0075] 圖9顯示0X4466株孵化率測(cè)定;
[0076] 圖10顯示0X4467-E1株孵化率測(cè)定;
[0077] 圖11顯示既攜帶topi-tTAV也攜帶tet〇-Dm-魚(yú)精蛋白-FokI等位基因的埃及伊 蚊(Aedesaegypti)系的孵化率測(cè)定;
[0078] 圖12顯示既攜帶0 2-微管蛋白-tTAV也攜帶tet〇-Ae-魚(yú)精蛋白-FokI等位基 因的埃及伊蚊(Aedesaegypti)系的孵化率測(cè)定;
[0079] 圖13顯示與兩株主要RIDL雌性致死系(0X3864A和0X3647Q)雜交的0X4353株;
[0080] 圖14是0X3866的質(zhì)粒圖;
[0081] 圖15是0X3867的質(zhì)粒圖;
[0082] 圖16是0X3671的質(zhì)粒圖;
[0083] 圖17是0X4112的質(zhì)粒圖;
[0084] 圖18是0X4103的質(zhì)粒圖;
[0085] 圖19是0X4104的質(zhì)粒圖;
[0086] 圖20是0X3831的質(zhì)粒圖;
[0087] 圖21是0X4458的質(zhì)粒圖;
[0088] 圖22是0X4391的質(zhì)粒圖;
[0089] 圖23是0X4286的質(zhì)粒圖;
[0090] 圖24是0X3978的質(zhì)粒圖;
[0091] 圖25是0X4275的質(zhì)粒圖;
[0092] 圖26是0X4254的質(zhì)粒圖;
[0093] 圖27是0X4371的質(zhì)粒圖。
[0094] 發(fā)明詳述
[0095] 術(shù)語(yǔ)'編碼序列'和0RF可以在本文中相互替換使用。
[0096] 如上文解釋的,在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,精子不死亡(如術(shù)語(yǔ)'精子致死性'可 能意味著一些)。作為替代,精子中的某物殺死受精卵。當(dāng)我們使用核酸酶時(shí),這可能對(duì)精 子DNA遺傳損害,但也可能由精子攜帶的RNA或蛋白在受精后具有其效果(實(shí)質(zhì)上,Burt/ Crisanti已經(jīng)提示這點(diǎn)以解釋岡比亞按蚊(An.gambiae)中來(lái)自其X-shredder的雌性以及 雄性胚胎的死亡,參見(jiàn)Windbichler等人2008,在前)。
[0097] 現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)應(yīng)該使用B2T基因(啟動(dòng)子和0RF)并用目的基因代替0RF。然而, 我們發(fā)現(xiàn)這并不導(dǎo)致本文描述類(lèi)型的條件系統(tǒng)。如果將系統(tǒng)做成條件的,我們發(fā)現(xiàn)必須對(duì) 該設(shè)置進(jìn)行顯著改變。一個(gè)問(wèn)題是一旦細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂,轉(zhuǎn)錄關(guān)閉。盡管翻譯仍然能夠 在減數(shù)分裂后的細(xì)胞中發(fā)生,進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄不能發(fā)生(近期由Barreau等人(2008)描述 了一些例外基因的減數(shù)分裂后的轉(zhuǎn)錄,但一般意義上是對(duì)的)。因此,如果想要表達(dá)目的蛋 白(從所述目的基因),比如效應(yīng)物蛋白,那么必須在減數(shù)分裂前有效應(yīng)物基因的足量表達(dá) (以提供相應(yīng)的效應(yīng)物RNA)。由"效應(yīng)物RNA",其意為RNA,例如mRNA,編碼(其當(dāng)翻譯和 任選地翻譯后修飾時(shí),(如果是融合蛋白)切割,和/或折疊)以提供作為效應(yīng)物蛋白行使 功能的氨基酸序列。
[0098] 在本發(fā)明的范圍內(nèi),"足夠"提供轉(zhuǎn)錄本或蛋白涉及與所述轉(zhuǎn)錄本或蛋白的數(shù)量和 時(shí)機(jī)二者。因此,當(dāng)應(yīng)用于效應(yīng)物基因時(shí),其意為本系統(tǒng)確保至少效應(yīng)物蛋白的轉(zhuǎn)錄本在減 數(shù)分裂(時(shí)機(jī))前產(chǎn)生和由此提供足量的所述轉(zhuǎn)錄本以實(shí)現(xiàn)所需蛋白功能。將理解這包括 蛋白表達(dá)中的所有臨時(shí)事件,比如轉(zhuǎn)錄本的任選加工,翻譯轉(zhuǎn)錄本為具有初級(jí)結(jié)構(gòu)和其任 選修飾的氨基酸序列,和提供二級(jí)、三級(jí)和甚至四級(jí)結(jié)構(gòu)(例如在二聚體的情況中)。
[0099] 然而,當(dāng)使用條件系統(tǒng)時(shí),現(xiàn)有技術(shù)系統(tǒng)不能提供要有效的足夠功能效應(yīng)物蛋白。 這主要被認(rèn)為是由于此種條件系統(tǒng)不僅需要轉(zhuǎn)錄和翻譯效應(yīng)物蛋白,而且還需要轉(zhuǎn)錄和翻 譯用作對(duì)效應(yīng)物蛋白的轉(zhuǎn)錄因子(調(diào)控單元)的控制因子蛋白。在減數(shù)分裂前,完全沒(méi)有 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白功能,然后進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄的完整周期的所有步驟另外需要的時(shí)間。換 句話(huà)說(shuō),如果,如這里的情況,所述條件系統(tǒng)使用轉(zhuǎn)錄因子,那么該轉(zhuǎn)錄因子自身需要被轉(zhuǎn) 錄和翻譯以提供功能轉(zhuǎn)錄因子蛋白。該轉(zhuǎn)錄因子蛋白必須隨后轉(zhuǎn)而作用于效應(yīng)物基因(編 碼效應(yīng)物蛋白)的調(diào)控元件,從而在減數(shù)分裂之前在各細(xì)胞中存在效應(yīng)物轉(zhuǎn)錄本的足夠積 累,以在減數(shù)分裂之后在各細(xì)胞中及時(shí)允許效應(yīng)物轉(zhuǎn)錄本翻譯。
[0100] 我們發(fā)現(xiàn)的是僅以編碼轉(zhuǎn)錄因子的0RF代替現(xiàn)有技術(shù)系統(tǒng)中的0RF是全然不夠 的。作為替代,本領(lǐng)域中的B2T啟動(dòng)子區(qū)域也必須被修改或完全替代,從而所述系統(tǒng)可以在 減數(shù)分裂前產(chǎn)生足夠的效應(yīng)物轉(zhuǎn)錄本以在減數(shù)分裂后具有功能(翻譯的)蛋白。因此,在 我們的新條件系統(tǒng)中,需要新上游調(diào)控元件(比如啟動(dòng)子和/或5'UTR)以驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄因子 0RF的表達(dá)。所述新上游調(diào)控元件必須在精子自然發(fā)生中足夠早地作用以產(chǎn)生足夠的轉(zhuǎn)錄 因子功能蛋白,以轉(zhuǎn)而作用于調(diào)控元件,控制效應(yīng)物的表達(dá)并從而在減數(shù)分裂發(fā)生和轉(zhuǎn)錄 關(guān)閉前產(chǎn)生足夠的效應(yīng)物轉(zhuǎn)錄本。在條件系統(tǒng)的情況下能夠?qū)崿F(xiàn)它是本發(fā)明的特定優(yōu)勢(shì)。
[0101] 效應(yīng)物蛋白(即由效應(yīng)物基因編碼的功能蛋白)最優(yōu)選在減數(shù)分裂后對(duì)精子使卵 受精以產(chǎn)生可成活受精卵的能力具有有害效果。
[0102] 所述系統(tǒng)優(yōu)選從其在精子中引起的不育是顯性的意義上為顯性的。這是父本效應(yīng) 致死性的概念的引入點(diǎn),進(jìn)一步參見(jiàn)下文。由優(yōu)選的效應(yīng)物比如核酸酶引起的遺傳不育優(yōu) 選為在雄性中顯性,從而所有來(lái)自雜合雄性的精子都受影響。將理解這不是關(guān)鍵的,因?yàn)槲?們預(yù)期釋放純合雄性,但是是優(yōu)選的。這與如常規(guī)RIDL的情況中的受精卵中顯性是相反 的。在這些現(xiàn)有技術(shù)系統(tǒng)中,一個(gè)拷貝(與精子一起繼承)足以殺死受精卵,當(dāng)然,由攜帶 野生型等位基因的精子(來(lái)自雜合雄性)受精的卵不受影響。
[0103]節(jié)肢動(dòng)物優(yōu)選為昆蟲(chóng)并且在本文對(duì)昆蟲(chóng)和非昆蟲(chóng)節(jié)肢動(dòng)物二者都提供合適實(shí)例。 然而,節(jié)肢動(dòng)物特別優(yōu)選為蚊子,特別是能夠傳染瘧疾或登革熱的物種的,或農(nóng)業(yè)害蟲(chóng),t匕 如果蠅。
[0104]本系統(tǒng)表達(dá)于其中的節(jié)肢動(dòng)物是雄性節(jié)肢動(dòng)物并且表達(dá)發(fā)生在其雄性生殖系細(xì) 胞,特別是性腺,即精巢,精子在那里自然發(fā)生。此外,或備選地,表達(dá)可以在精子自身中發(fā) 生。優(yōu)選,所述表達(dá)發(fā)生在大多數(shù)所述細(xì)胞(即至少50%的所述細(xì)胞)中,但它可以更高, 例如至少80%,至少90%,至少95%或最優(yōu)選99-100%的所述細(xì)胞。
[0105] 因此,所述表達(dá)系統(tǒng)能夠適應(yīng)于或適于在節(jié)肢動(dòng)物的雄性生殖系中表達(dá)基因。這 里由"基因",主要意為蛋白。換句話(huà)說(shuō),該表達(dá)系統(tǒng)的功能是在節(jié)肢動(dòng)物雄性生殖系(生殖 系細(xì)胞)中表達(dá)蛋白。該表達(dá)的時(shí)機(jī)是關(guān)鍵的并且在別處進(jìn)一步討論,但它必須足以使精 子不能讓卵受精以產(chǎn)生可成活受精卵。理想地,所述表達(dá)系統(tǒng)自身是,或包含在,即通過(guò)轉(zhuǎn) 化,能夠在節(jié)肢動(dòng)物雄性生殖系中表達(dá)的質(zhì)粒,轉(zhuǎn)座子或其它轉(zhuǎn)座遺傳元件。因此,所述表 達(dá)系統(tǒng)優(yōu)選為多核苷酸表達(dá)系統(tǒng),優(yōu)選DNA,RNA或二者的混合物。
[0106] 從所述系統(tǒng)表達(dá)優(yōu)選為有條件的。盡管它可以是誘導(dǎo)型的,特別優(yōu)選所述條件性 是可抑制的,從而表達(dá)僅在缺少抑制物的情況下發(fā)生。在誘導(dǎo)型系統(tǒng)中,表達(dá)將僅在誘導(dǎo) 物的存在下發(fā)生。包括在本表達(dá)系統(tǒng)中的特別優(yōu)選的可抑制系統(tǒng)是tet(四環(huán)素)系統(tǒng)或 GAL4/UAS系統(tǒng),二者都在本文進(jìn)一步描述。
[0107]將理解所述啟動(dòng)子能夠節(jié)肢動(dòng)物的雄性生殖系細(xì)胞中表達(dá),即能夠在其中起始轉(zhuǎn) 錄。還將理解,所述啟動(dòng)子可操作連接于本系統(tǒng)的調(diào)控元件和編碼序列。
[0108]其可以是,所述系統(tǒng)包含單條編碼序列或多于一條編碼序列。所述一條或更多條 編碼序列可以以融合連接或分開(kāi)提供。進(jìn)一步編碼序列的合適實(shí)例為標(biāo)記或報(bào)道分子比如 熒光蛋白(例如GFP,EFP,YFP,等),但進(jìn)一步效應(yīng)物也是優(yōu)選的,以提供更好特異性。
[0109] 除具體描述的第二表達(dá)單元的上游調(diào)控元件之外,本系統(tǒng)還可以適當(dāng)包括進(jìn)一步 調(diào)控元件。這些促進(jìn),即使能夠,在節(jié)肢動(dòng)物的雄性生殖系細(xì)胞中表達(dá)。此外,如下文描述 的,所述進(jìn)一步調(diào)控元件促進(jìn)RNA的有絲分裂前加工和翻譯。因此,所述進(jìn)一步調(diào)控元件不 是啟動(dòng)子的部分,但優(yōu)選包括第一表達(dá)單元中的5' UTR和/或第一和第二表達(dá)單元二者中 的3'UTR。因此,這些進(jìn)一步調(diào)控元件可以被認(rèn)為是非翻譯序列,如以第二表達(dá)單元的指定 5' UTR的情況。它們都優(yōu)選包括至少5' UTR或3' UTR的實(shí)質(zhì)部分,但是最優(yōu)選完全5' UTR 或完全3' UTR。最優(yōu)選,提供5' UTR和3' UTR的至少實(shí)質(zhì)部分(并且優(yōu)選二者都是完全 的)。所述調(diào)控元件因此可以包括5'UTR的全部或部分,包括各種調(diào)控序列,其與使RNA序 列(例如最近從DNA轉(zhuǎn)錄的RNA)能夠翻譯的5' UTR內(nèi)關(guān)聯(lián)或在其中發(fā)現(xiàn)。
[0110] 所有本文描述的啟動(dòng)子應(yīng)該優(yōu)選包括特征比如轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。 這些是啟動(dòng)子元件(典型地),不是UTR元件(盡管可以存在重疊)。5'UTR-般具有一些 翻譯起始信號(hào),可能還有RNA穩(wěn)定性,定位,翻譯控制和內(nèi)含子序列(盡管不是必要的)。
[0111] 對(duì)于可以包括5'帽和/或多聚腺苷酸尾的其它進(jìn)一步調(diào)控元件同樣適用。換句話(huà) 說(shuō),理想地,所有這些元件存在于至少實(shí)質(zhì)部分,即足以提供其必要的調(diào)控功能的那個(gè)。技 術(shù)人員將能夠評(píng)估這些調(diào)控元件的全部或部分存在或缺失的情況下是否提供編碼序列的 足量表達(dá),因?yàn)榛疽笫蔷拥南掠喂δ苄浴<夹g(shù)人員能夠評(píng)估精子是否能夠競(jìng)爭(zhēng),這是 有利的。他也能夠容易地鑒定精子是否產(chǎn)生可成活受精卵,這是不利的。如果精子不競(jìng)爭(zhēng), 和/或如果它們確實(shí)產(chǎn)生可成活受精卵,那么效應(yīng)物的表達(dá)水平將需要修正。在本發(fā)明中, 精子(其意為轉(zhuǎn)化的或GM(遺傳修飾的,即攜帶轉(zhuǎn)基因/本表達(dá)系統(tǒng)))優(yōu)選能夠與野生型 精子競(jìng)爭(zhēng)但是不產(chǎn)生可成活受精卵。因此,如果這些中的一個(gè)未實(shí)現(xiàn),尤其是如果產(chǎn)生可成 活受精卵,那么所述系統(tǒng)需要修正。
[0112] 然而,必須銘記在心的是將效應(yīng)物0RF/編碼序列的RNA加工為所述效應(yīng)物轉(zhuǎn)錄本 在減數(shù)分裂前發(fā)生并且以足夠水平積累,從而之后翻譯的和功能性蛋白對(duì)精子使卵受精產(chǎn) 生可成活受精卵的能力具有所需效果。這點(diǎn)另外進(jìn)一步詳細(xì)討論。
[0113] 效應(yīng)物編碼優(yōu)選的核酸酶的情況下,例如,這是有害效果。這在任何點(diǎn)發(fā)生(盡管 明顯在效應(yīng)物轉(zhuǎn)錄本被加工和翻譯等等為功能蛋白之后)。基本需求是在減數(shù)分裂前必須 存在足夠的效應(yīng)物轉(zhuǎn)錄本,因?yàn)檗D(zhuǎn)錄在那一點(diǎn)關(guān)閉。然而,可以設(shè)想所述效應(yīng)物蛋白可以是 有絲分裂后(但是當(dāng)然是減數(shù)分裂后的)功能性的。
[0114] 優(yōu)選地,所有調(diào)控元件是彼此同源的,即源自相同基因。特別優(yōu)選,為了精細(xì)調(diào)節(jié) 表達(dá)水平,所述調(diào)控元件彼此異源,從而例如,3 ' UTR可以源自相對(duì)選擇的5 ' UTR的不同基 因。優(yōu)選所述5'帽和多聚腺苷酸尾與啟動(dòng)子同源,即來(lái)自與啟動(dòng)子相同的基因。
[0115] 因?yàn)樾?yīng)物基因是通常不表達(dá)于雄性節(jié)肢動(dòng)物的生殖系細(xì)胞中的基因,還將理解 調(diào)控元件與所述基因異源(即與編碼序列異源)。在所有這些中,將理解異源指遺傳元件比 如啟動(dòng)子,5' UTR(或其它調(diào)控元件)或編碼序列的來(lái)源,從而它們可以來(lái)自相同生物的不 同基因;來(lái)自不同生物的保守基因;或甚至來(lái)自不同生物的不同(不相關(guān))基因。換句話(huà) 說(shuō),所述元件可以來(lái)自(從源自的意義上,盡管修飾是可預(yù)想的)單個(gè)生物內(nèi)的一系列不同 基因或不同生物的一系列不同基因,具有限制條件是,它們足以在節(jié)肢動(dòng)物雄性生殖系,即 在其性腺或精子中提供必要的表達(dá)水平。尤其,所述編碼序列可以根本不必須來(lái)自節(jié)肢動(dòng) 物,而如果有助于從編碼序列的蛋白表達(dá)的適當(dāng)程度和時(shí)機(jī),特別是有關(guān)減數(shù)分裂前翻譯, 例如所述調(diào)控元件還可以?xún)?yōu)選源自細(xì)菌或病毒。
[0116] 所述編碼序列編碼效應(yīng)物蛋白。如上文提到的,所述編碼序列優(yōu)選為與表達(dá)系 統(tǒng)中的其它元件比如啟動(dòng)子和/或調(diào)控元件異源。同時(shí),表達(dá)系統(tǒng)中的編碼序列將是多 核苷酸,其能夠被轉(zhuǎn)錄為合適的信使RNA(mRNA),其足以隨后被翻譯為功能蛋白。設(shè)想了 RNA的可變剪接,其由內(nèi)含子(剪接控制)序列與剪接體合作調(diào)節(jié)。提供或控制可變剪接 的優(yōu)勢(shì)是其添加調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)的另外水平。對(duì)此的進(jìn)一步指導(dǎo)提供在我們之前的公開(kāi)W0 2007/091099 中。
[0117] 效應(yīng)物蛋白表達(dá)的時(shí)機(jī)和定位對(duì)于本發(fā)明是關(guān)鍵的并在下文進(jìn)一步討論。然而, 將理解效應(yīng)物的功能優(yōu)選對(duì)精子使卵受精以產(chǎn)生可成活受精卵的能力具有有害效果。
[0118] 如本文描述的,雌性感覺(jué)好像她已經(jīng)恰當(dāng)?shù)厥芫?,否則她將尋找進(jìn)一步交配或,實(shí) 質(zhì)上,已經(jīng)可以存在本精子需要競(jìng)爭(zhēng)的其它野生型精子是重要的。然而,如果其一般功能被 顯著損害,比如其"游泳"的能力,精子將不能競(jìng)爭(zhēng)。
[0119] 優(yōu)選的效應(yīng)物對(duì)精子使卵受精以產(chǎn)生可成活受精卵的能力具有有害效果。優(yōu)選, 其誘導(dǎo)或直接引起DNA損害。這個(gè)的特定優(yōu)選實(shí)例為核酸酶,特別是核酸內(nèi)切酶。這些的 進(jìn)一步實(shí)例在下文提供。
[0120] 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng),即能夠或適應(yīng)于起始,效應(yīng)物編碼序列以及其周?chē)恼{(diào)控元件轉(zhuǎn)錄 為RNA。這個(gè)時(shí)機(jī)是關(guān)鍵的并且另外強(qiáng)調(diào)。效應(yīng)物的翻譯可以在減數(shù)分裂之前或之后發(fā)生。
[0121] 效應(yīng)物蛋白具有有害效果,尤其是在減數(shù)分裂后(減數(shù)分裂后)。精子通過(guò)精子自 然發(fā)生從攜帶本表達(dá)系統(tǒng)的雄性生殖系細(xì)胞產(chǎn)生。所述精子因此優(yōu)選攜帶或包含至少一個(gè) 拷貝的效應(yīng)物蛋白,但是優(yōu)選顯著多于一個(gè)拷貝。該有害效果降低精子使卵受精的能力。因 此,本系統(tǒng)在如Horn和Schetelig(Horn,C.,Wimmer,A.E. 2003,Schetelig,M.F.,Handler, M.A. 2012)中公開(kāi)的胚胎特異系統(tǒng)中誘導(dǎo)致死性之前作用良好。強(qiáng)烈優(yōu)選效應(yīng)物使精子具 有足夠的運(yùn)動(dòng)性,從而它們能夠在急于到達(dá)卵的過(guò)程中與普通(即野生型或未轉(zhuǎn)化的)精 子競(jìng)爭(zhēng)。同樣,值得注意的是,精子攜帶一個(gè)拷貝的DNA(編碼效應(yīng)物的基因是關(guān)鍵的。 實(shí)質(zhì)上,這是優(yōu)選的并且是與合子活化的RIDL系統(tǒng)的關(guān)鍵差異,因?yàn)楸鞠到y(tǒng)可以:
[0122] _保證不存在卵孵化;
[0123] _與遺傳性別鑒定組合使用;
[0124]-提供條件性;和
[0125] _純種,合子致死性和抗性。
[0126] 一般而言,受精在雌性生殖道中。在交配過(guò)程中雄性將精子轉(zhuǎn)移,雌性保存它。從 雌性生殖道傳下的成熟卵暴露于該精子并受精。對(duì)于一些物種(地中海果蠅(Medfly),埃 及伊蚊(Aedesaegypti)),雌性典型地僅交配一次并使用儲(chǔ)存的精子用于其所有卵。一些 其它昆蟲(chóng),例如一些蛾,交配更頻繁。
[0127] 然而,特別優(yōu)選效應(yīng)物引起足夠的DNA損害,可成活受精卵不可能形成,例如因?yàn)?由精子提供的單倍體遺傳信息被損害。例如,優(yōu)選精子的DNA在其中具有雙鏈損傷。由使 用核酸內(nèi)切酶導(dǎo)致的該優(yōu)選的實(shí)施方案,其實(shí)例在本文提供。因此,本發(fā)明已開(kāi)始就阻止可 成活受精卵的形成,而不是在一旦形成的受精卵中進(jìn)一步表達(dá)蛋白。這是超過(guò)現(xiàn)有技術(shù),t匕 如RIDL技術(shù)(其中功能受精卵形成并且隨后表達(dá)效應(yīng)物以殺死受精卵)的重要區(qū)別。在 本發(fā)明中,無(wú)可成活受精卵曾經(jīng)形成。
[0128] 因此,優(yōu)選所述受精卵可以從不超過(guò)單細(xì)胞階段。早期昆蟲(chóng)胚胎,例如,在無(wú)細(xì)胞 分裂的情況下分開(kāi)其核,隨后細(xì)胞化,因此一步從1細(xì)胞到> 1000。然而,還優(yōu)選的胚胎僅 未能孵化為幼蟲(chóng)(其是野外所需的特征)。因此,最小需求是,優(yōu)選個(gè)體未能發(fā)展為可成活 成體。
[0129] 因此,可以看出,作為現(xiàn)有技術(shù)的問(wèn)題的解決方案,本發(fā)明提供精子自然發(fā)生過(guò)程 中減數(shù)分裂之前,異源效應(yīng)物蛋白(優(yōu)選核酸內(nèi)切酶)的轉(zhuǎn)錄本的減數(shù)分裂前積累的微妙 平衡作用,從而,減數(shù)分裂后,產(chǎn)生的精子攜帶翻譯的效應(yīng)物序列拷貝,其可以隨后在精子 中產(chǎn)生效果。該效果在受精前發(fā)生,因此有效使精子不育,從而精子是不育的活性精子。這 是本文描述的"精子致死"效果。
[0130] 在減數(shù)分裂時(shí),似乎不存在對(duì)于DNA完整性的強(qiáng)烈檢驗(yàn)點(diǎn)。因此減數(shù)分裂前對(duì)DNA 的損害通常是耐受的。實(shí)質(zhì)上,這可能是輻射所做的:輻射導(dǎo)致各種精子頭部尺寸,同時(shí)頭 部尺寸與DNA含量成比例。該不同DNA含量可以因此源自由于由在減數(shù)分裂前細(xì)胞中輻射 引起的DNA損害導(dǎo)致的減數(shù)分裂時(shí)DNA的不均勻分離。然而,在有絲分裂(通常)中存在強(qiáng) 烈的檢驗(yàn)點(diǎn),因此生殖系干細(xì)胞(GSCs)或精子發(fā)生細(xì)胞中的DNA損害可能阻止功能性(從 使卵受精能力的意義上)精子的發(fā)育。
[0131] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步方面,提供在性腺或精子中表達(dá)效應(yīng)物蛋白的方法。優(yōu) 選地,所述方法包含用本表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化性腺。這方面還涉及轉(zhuǎn)化方法。
[0132] 還提供的是群體控制方法,包括在雄性節(jié)肢動(dòng)物的性腺中通過(guò)本表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)所 述蛋白。本文描述優(yōu)選的節(jié)肢動(dòng)物。
[0133] 本發(fā)明還提供抗性管理的方法?;旧蠈?duì)于任何合子活性RIDL系統(tǒng),包括胚胎活 性的合子活性RIDL系統(tǒng),存在受精卵的基因組中的某物(例如從其母本遺傳獲得的遺傳物 質(zhì))可以阻止或降低想要的致死效果的可能性。關(guān)于RIDL,這將是遺傳的抗性因子。為了 說(shuō)明,抗性因子可以是降低致死效應(yīng)物表達(dá)水平,或降低致死效應(yīng)物的目標(biāo)對(duì)那個(gè)效應(yīng)物 的敏感度的某物。然而,對(duì)于本發(fā)明,當(dāng)使用核酸內(nèi)切酶時(shí),難以預(yù)想那可能怎樣發(fā)生。損 害已經(jīng)完成-使用核酸酶作為實(shí)例,精子DNA受損害并且難以預(yù)見(jiàn)在卵中這可能怎樣糾正, 因此使損害成為永久性的。
[0134] 關(guān)于抗性管理,可以預(yù)見(jiàn)如果我們使用雌性特異的RIDL并且在野外看到抗性產(chǎn) 生的情形。我們可以加入根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng),保持fsRIDL雌雄分離并保持本發(fā)明不育。備 選地,我們可以?xún)H切換本系統(tǒng),然而雌雄分離在一些物種中對(duì)SIT有明顯益處。
[0135] 該抗性管理不是完全全面的-行為抗性仍然可能(如果雌性可以區(qū)別可育和不育 雄性,對(duì)于優(yōu)先交配可育雄性的那些,將存在強(qiáng)烈的選擇,從而避免暴露于受本發(fā)明影響的 精子。已經(jīng)在基于輻射的SIT計(jì)劃中觀察到此種行為抗性,但是僅非常少(我們相信僅知 道存在一個(gè)好的實(shí)例)。該爭(zhēng)論與輻射-絕育的支持者使用的那個(gè)非常類(lèi)似,為了上文概述 的原因爭(zhēng)論精子中的輻射損害對(duì)合子(RIDL)致死的優(yōu)越性。
[0136] 在本方法中,優(yōu)選所述條件系統(tǒng),優(yōu)選本文描述的tet系統(tǒng),用以提供進(jìn)一步程度 的控制。這允許,例如,在實(shí)驗(yàn)室條件下,即在抑制物,比如四環(huán)素的存在下飼養(yǎng)。當(dāng)釋放, 或去除四環(huán)素時(shí),系統(tǒng)的抑制被去除并且效應(yīng)物蛋白從而被表達(dá)。
[0137] 在目前的情況下,雄性不育既用于農(nóng)業(yè),以例如阻止卵孵化,以及也用于疾病控 制,例如控制疾病載體比如蚊子(例如造成瘧疾和登革熱傳播的那些)。因此,本發(fā)明還提 供生物節(jié)制(biocontainment)的方法,所述方法包括在群體中表達(dá)所述系統(tǒng)或向野外釋 放雄性(攜帶所述系統(tǒng))。優(yōu)選的,以可抑制系統(tǒng),所述株變得依賴(lài)于抑制物且不能在野外 建立。
[0138] 本發(fā)明還提供質(zhì)量控制方法,例如,通過(guò)包括報(bào)道分子比如熒光蛋白,優(yōu)選綠色熒 光蛋白(GFP)或本領(lǐng)域已知的任何其它顏色熒光蛋白。這可以是效應(yīng)物蛋白本身,其以轉(zhuǎn) 化標(biāo)記起作用。用作轉(zhuǎn)化標(biāo)記的熒光蛋白的其它實(shí)例包括DsRed,DsRed2和AmCyan。
[0139] 還可以使用分開(kāi)的轉(zhuǎn)化標(biāo)記,包括使用這里描述的那些。這些轉(zhuǎn)化標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄可 以在對(duì)于第一或第二表達(dá)單元的那個(gè)的分開(kāi)的啟動(dòng)子的控制下。此種啟動(dòng)子的實(shí)例包括肌 肉肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子,3xP3,hrIE和hr5IEl。
[0140] 然而,更優(yōu)選地,所述熒光蛋白可以連接于本系統(tǒng)的效應(yīng)物蛋白,從而該報(bào)道蛋白 和其表達(dá)將允許評(píng)估將轉(zhuǎn)基因或其它效應(yīng)物包括在群體中的程度。這具有以下優(yōu)點(diǎn)中的至 少一些:
[0141] (1)如任何此種標(biāo)記,其鑒定轉(zhuǎn)基因的存在,從而可以按照遺傳。標(biāo)記與研究的特 征(例如致死系統(tǒng))連接越緊密,失活一個(gè)但不失活另一個(gè)的突變發(fā)生的可能性越低。盡管 在實(shí)踐中,如果它們(標(biāo)記和轉(zhuǎn)基因)在同樣的DNA片段上,這在任何情況下都極不可能;
[0142] (2)如果從融合的意義上連接,標(biāo)記顯示效應(yīng)物蛋白的表達(dá)。這將允許人審視實(shí) 際表達(dá)。例如,在核酸酶的tet-可抑制表達(dá)的優(yōu)選的例子中,核酸酶融合于熒光報(bào)道分子 會(huì)允許人核實(shí)要釋放的昆蟲(chóng)表達(dá)所述核酸酶。熒光標(biāo)記的存在將告訴你(i)雄性具有至少 一個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)基因;(ii)所述表達(dá)系統(tǒng)從在抑制物缺失的情況下產(chǎn)生效應(yīng)物的表達(dá)的意 義上正確行使功能;(iii)昆蟲(chóng)表達(dá)核酸酶-FP融合(并且因此例如,不是在存在抑制物的 情況下無(wú)意飼養(yǎng));[(iv)假定雄性特異的表達(dá),是雄性];(v)通過(guò)推理它們實(shí)質(zhì)上不育。 在質(zhì)量控制(QC)條款中,這使你比僅知道雄性具有一個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)基因更確定'他們'不 育',其是你從使用連接的(遺傳連鎖的,例如相鄰基因)熒光標(biāo)記所獲得的;
[0143] (3)用高功率的顯微鏡,你可以看到表達(dá)何時(shí)開(kāi)始和蛋白定位在細(xì)胞內(nèi)的哪里。這 是有用的研發(fā)工具并且也用于例如在進(jìn)行的QC中,而且在精子精子間表達(dá)的一致性的情 況下,監(jiān)控一致性,以建立系統(tǒng)今天是否進(jìn)行,它昨天/去年做了什么;和
[0144] (4)就熒光精子而言的進(jìn)一步優(yōu)勢(shì),在下文討論。
[0145] 對(duì)于核酸酶,存在對(duì)切割DNA的明確的功能關(guān)聯(lián),因此如果其不是在核中,就不可 能具有想要的DNA-切割效果。從而,因此還優(yōu)選提供核定位信號(hào)以保證核酸酶定位于核。
[0146] 在進(jìn)一步的方面,在此提供質(zhì)量控制的方法,所述方法包括在目標(biāo)組個(gè)體中誘導(dǎo) 或去抑制本表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)并確定這些個(gè)體是否滿(mǎn)足預(yù)期的標(biāo)準(zhǔn)比如尺寸、數(shù)量、發(fā)育階 段或定位。例如,如果所述系統(tǒng)包括表達(dá)報(bào)道分子比如熒光蛋白為效應(yīng)物或?yàn)槔缛诤系?白的部分之一的工具,那么其中從所述系統(tǒng)表達(dá)被誘導(dǎo)或去抑制的個(gè)體將變得在合適波長(zhǎng) 的光下可見(jiàn)。
[0147] 優(yōu)選本系統(tǒng)包括至少一個(gè)間隔區(qū)。此間隔區(qū)可以有利地位于所述系統(tǒng)的任何本元 件之間。例如,可以在啟動(dòng)子和調(diào)控元件之間和/或調(diào)控元件和編碼序列之間提供間隔區(qū), 從而在這些元件之間提供"緩沖"以保證其正確功能性。因此,所述間隔區(qū)除了分開(kāi)這些元 件之外,不具有基因表達(dá)的功能,盡管它可以任選地包括許多限制性位點(diǎn),如果這被認(rèn)為是 有用的。理想地,它應(yīng)該不包括任何轉(zhuǎn)錄結(jié)合因子位點(diǎn)等,因?yàn)檫@些可能干擾效應(yīng)物的表 達(dá)。
[0148] 還優(yōu)選所述效應(yīng)物可以是融合序列或蛋白的形式,從而,例如,核酸酶融合于標(biāo)記 以致效應(yīng)物的轉(zhuǎn)錄和翻譯也導(dǎo)致標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄和翻譯。這具有顯示將精子暴露于核酸酶的優(yōu) 點(diǎn),熒光蛋白的存在表示核酸酶被表達(dá)??梢栽跓晒怙@微鏡下使用適于特定熒光蛋白的激 發(fā)濾光片觀察熒光蛋白。這些的實(shí)例是我們的株LA4466或LA4467 (LA4466 =PB-hr5IEl-DsRed-A印rot-tGFP-EcoRI和LA4467 =PB-hr5IEl-DsRed-A印rot-tGFP-FokICD)。應(yīng)該注 意,更早期的株隨發(fā)明人LukeAlphey標(biāo)記"LA",但是從那以后,我們隨 申請(qǐng)人:Oxitec采 用了前綴"0X"。因此,對(duì)于個(gè)體株,前綴LA和0X可以相互替換使用。LA4466/0X4466和 LA4467/0X4467二者都是成功融合于熒光表達(dá)的核酸酶功能的實(shí)例。
[0149] 還可預(yù)見(jiàn),本系統(tǒng)和方法可以用于產(chǎn)生熒光精子。例如,可以將報(bào)道分子比如上文 提到的那些連接于啟動(dòng)子或,實(shí)際上,在分開(kāi)的啟動(dòng)子下,比如tetO啟動(dòng)子增強(qiáng)子系統(tǒng),如 果效應(yīng)物是tTA或其變體的任一種。熒光精子對(duì)于精子或性腺的可視分離,特別是在解剖 或性選擇方法中會(huì)是有優(yōu)勢(shì)的。尤其,它推斷出確定雌性與哪個(gè)雄性個(gè)體交配,在野外釋放 程序的情況下哪個(gè)有用的能力。此方法可能包括,提供(例如誘捕)野生雌性;解剖它們; 尋找儲(chǔ)存的精子并看此精子是否攜帶本系統(tǒng),即是熒光的。這將非??焖俚馗嬖V你雌性是 否:
[0150] (i)是未交配的(尚未交配);
[0151] (ii)與野生型雄性交配(因?yàn)樗@示非熒光精子);
[0152] (iii)與攜帶本系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因雄性交配(其會(huì)顯示熒光精子;或
[0153] (iv)與兩種類(lèi)型的雄性都交配(通過(guò)熒光和非熒光精子的存在顯示)。
[0154] 因?yàn)?雌性與誰(shuí)交配?'是評(píng)估和控制SIT-類(lèi)型計(jì)劃的關(guān)鍵問(wèn)題,這是有用的優(yōu) 點(diǎn)。存在一些提議這點(diǎn)的文章,例如Malacrida等人2007文章已經(jīng)被引用,但是不在我們 這里提供的上下文中。
[0155] 本理念的實(shí)例是構(gòu)建體(0X3878),設(shè)計(jì)其以熒光標(biāo)記精子頭,尤其在埃及伊蚊 (Aedesaegypti)中。該構(gòu)建體使用埃及伊蚊(Aedesaegypti)tGFP_標(biāo)簽標(biāo)記的魚(yú)精蛋 白和其調(diào)控序列,以精子-特異的方式表達(dá)熒光融合蛋白。在完整的解剖的精巢和在從 0X3878雄性蚊子分離的精子中都檢測(cè)到強(qiáng)烈的綠色熒光。這顯示,熒光蛋白的表達(dá)可以由 本系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)以產(chǎn)生熒光精子并且,此外所述熒光可以有用地被檢測(cè)到。
[0156] 因此,在進(jìn)一步的方面,本發(fā)明提供確定雌性節(jié)肢動(dòng)物的交配狀況的方法,所述方 法包括在轉(zhuǎn)基因雄性(即釋放的)群體中使用根據(jù)本發(fā)明系統(tǒng),其中所述系統(tǒng)包含標(biāo)記比 如熒光報(bào)道蛋白;并且在存在精子時(shí),測(cè)定雌性中所述標(biāo)記的存在;標(biāo)記的存在表示雌性 已與攜帶所述系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因雄性交配。不攜帶標(biāo)記的精子的存在表示雌性與野生型(不是 轉(zhuǎn)基因)個(gè)體交配。精子不存在的情況,其表示雌性尚未,或剛交配。在一些實(shí)施方案中,所 述方法包括釋放攜帶本系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因的雄性并且允許它們與雌性(即野生型雌性)交配。
[0157] 將理解,在本發(fā)明中,所述系統(tǒng)的表達(dá)必須被引發(fā)或被允許發(fā)生。換句話(huà)說(shuō),遵循 誘導(dǎo)效應(yīng)物表達(dá)(和如果分開(kāi),任選標(biāo)記的比如報(bào)道分子)所需的條件。在可抑制tet系 統(tǒng)的情況下,例如,這意為從轉(zhuǎn)基因雄性的飲食中去除四環(huán)素。
[0158] 本發(fā)明的首要目的是提供雄性不育。然而,我們還顯示的是可能提供不育精子,其 仍然能夠與野生型精子競(jìng)爭(zhēng)。這是有優(yōu)越性的,因?yàn)槠鋵?dǎo)致更高程度的群體控制,因?yàn)槿绻?野生型精子輕易能夠競(jìng)爭(zhēng)掉轉(zhuǎn)化的精子,并且雌性可能與兩種類(lèi)型的雄性都交配,那么將 在下一代中僅存在群體的少量減少。即使雌性典型地僅交配一次,在此種情況下,對(duì)于增加 的再交配可以存在強(qiáng)烈的選擇性。
[0159] 泛素融合蛋白還可以有利地包括在本系統(tǒng)中。這具有以融合產(chǎn)生兩種蛋白的表 達(dá),即單個(gè)多肽,但是(共翻譯)切割為兩個(gè)分開(kāi)的蛋白的優(yōu)點(diǎn)。如果所述蛋白之一不容許 融合(例如,tTA,趨于以N-末端融合不行使功能),這是有用的。你仍然具有緊密結(jié)合形 式的共表達(dá),然而你失去了使用標(biāo)簽(例如熒光蛋白,F(xiàn)P)以確定融合蛋白的亞細(xì)胞定位的 能力,因?yàn)槠洳槐3峙c它融合。
[0160] 值得重申,本啟動(dòng)子是"早期作用"生殖系啟動(dòng)子,因此在減數(shù)分裂前提供必要水 平的轉(zhuǎn)錄。所述啟動(dòng)子在下文進(jìn)一步定義,但是同樣值得銘記于心的是,啟動(dòng)子應(yīng)該優(yōu)選在 有絲分裂之后不在早于topi啟動(dòng)子作用,尤其是,不在干細(xì)胞中作用(至少其中效應(yīng)物不 損害此種細(xì)胞類(lèi)型,即其中效應(yīng)物不是核酸酶)。
[0161] 所述啟動(dòng)子應(yīng)該具有生殖系效果,并且優(yōu)選所述系統(tǒng)的表達(dá)是有條件的。理想地, 在看到效應(yīng)物表達(dá)的任何負(fù)效應(yīng)之前,精子自然發(fā)生應(yīng)該基本上完成。優(yōu)選不存在對(duì)精子 功能的可辨效果,直到卵進(jìn)入后。同時(shí)可能看到DNA損害為'負(fù)效應(yīng),'人們可以?xún)H將精子 中的DNA視為"貨物",因?yàn)樵诰又袩o(wú)轉(zhuǎn)錄。由效應(yīng)物引起的任何DNA損害必須足以阻止 可成活子代的產(chǎn)生。
[0162] 因此,本發(fā)明優(yōu)選提供條件生殖系特異性(就表達(dá)而言)。
[0163] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)例中,第二表達(dá)單元的'框架'尤其基于來(lái)自Dm或目標(biāo)節(jié)肢動(dòng)物 的B2T野生型基因。將編碼序列用轉(zhuǎn)錄因子的編碼序列替代,并且也將啟動(dòng)子和/或5'UTR 序列改變。實(shí)質(zhì)上,甚至可以插入異源增強(qiáng)子或使用異源3'UTR。顯然,如果進(jìn)行所有這些 改變,將存在很少殘留的原序列,因此將理解這是建立第二表達(dá)單元的一種方式。
[0164] 關(guān)于調(diào)控元件,特別是第二表達(dá)單元中的上游調(diào)控元件啟動(dòng)子和/或5'UTR,對(duì)于 本轉(zhuǎn)錄因子不存在延遲的翻譯效果是重要的。實(shí)現(xiàn)這點(diǎn)的一種途徑是使用來(lái)自已知在減數(shù) 分裂前以足夠,優(yōu)選強(qiáng)烈水平轉(zhuǎn)錄和翻譯的基因的調(diào)控元件。合適的實(shí)例會(huì)包括分子伴侶 基因,優(yōu)選HSP家族的基因,尤其是hsp83。在一個(gè)其它的優(yōu)選實(shí)施方案中,3'UTR可以源自 病毒,比如SV40。
[0165] 在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中,本系統(tǒng)的第二表達(dá)單元包含來(lái)自@2微管蛋白 (B2T)的啟動(dòng)子,連同修改的B2T5'UTR或來(lái)自hsp83的5'UTR。任選地,可以使用來(lái)自 SV40的3'UTR。啟動(dòng)子和5'UTR之一或二者可以來(lái)自topi。topi指果蠅(Drosophila) 基因matotopetli。然而,本發(fā)明包括功能同源物和來(lái)自其它物種的旁系同源物。這些可以 通過(guò)參考如上文描述的保守0RF鑒定。在5'UTR來(lái)自topi的情況下,所述啟動(dòng)子也可以 來(lái)自topi,盡管可預(yù)見(jiàn)其可以來(lái)自本文公開(kāi)的任何其它啟動(dòng)子,例如B2T。同樣,當(dāng)使用來(lái) 自topi的啟動(dòng)子和/或使用來(lái)自的topi5'UTR時(shí),3'UTR優(yōu)選為也來(lái)自topi,剩余的調(diào) 控元件比如5'帽和多聚腺苷酸尾也是一樣。這一點(diǎn)的原因是topi在精子自然發(fā)生中具有 "早期"表達(dá)形式,從而其能夠在有絲分裂后但在減數(shù)分裂前驅(qū)動(dòng)合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯。
[0166] 在B2T,同時(shí)啟動(dòng)子有用的情況下,我們發(fā)現(xiàn)的確似乎存在與來(lái)自B2T的5'UTR密 切相關(guān)的延遲信號(hào),阻礙早期翻譯。由于該原因:B2T的5'UTR可以由來(lái)自例如,分子伴侶 比如hsp83的5'UTR替代。因此,將看出,在一些情況下啟動(dòng)子和調(diào)控元件彼此同源,或至 少優(yōu)選來(lái)自不同物種的保守同源物的同時(shí),在一些情況下,使用彼此異源的啟動(dòng)子和調(diào)控 元件以精細(xì)調(diào)控本發(fā)明所需的表達(dá)模式可以是必要的。如在實(shí)施例中看到的,我們提供每 個(gè)方案的實(shí)施例。
[0167] 在其它方面,本發(fā)明還提供用本系統(tǒng)或通過(guò)本方法轉(zhuǎn)化的節(jié)肢動(dòng)物(在本文提供 其優(yōu)選實(shí)例)。換句話(huà)說(shuō),本發(fā)明還提供轉(zhuǎn)化子或遺傳改進(jìn)的節(jié)肢動(dòng)物,優(yōu)選如本文進(jìn)一步 限定的。將理解所述節(jié)肢動(dòng)物是雄性,優(yōu)選其性腺攜帶本系統(tǒng),從而在精子自然發(fā)生過(guò)程中 效應(yīng)物的表達(dá)發(fā)生。
[0168]啟動(dòng)子和調(diào)控元件以協(xié)同方式一起作用以提供所需表達(dá)模式是本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。
[0169] 如上文提到的,所述啟動(dòng)子優(yōu)選來(lái)自精巢-特異的基因或至少足以在精子自然發(fā) 生過(guò)程中提供"早期"表達(dá)的基因。備選方案包括更為組成型的啟動(dòng)子,比如結(jié)構(gòu)啟動(dòng)子, 例如,微管蛋白家族,特別是0微管蛋白和最優(yōu)選0 2微管蛋白啟動(dòng)子,和其同源物。當(dāng)使 用它時(shí),有必要使用不具有至少在0 2微管蛋白的上游調(diào)控元件的一些情況下看到的翻譯 延遲信號(hào)的上游調(diào)控元件。使用B2T啟動(dòng)子的優(yōu)點(diǎn)是B2T基因編碼序列高度保守并且它和 合適的啟動(dòng)子片段可以由技術(shù)人員從給定節(jié)肢動(dòng)物物種中容易地鑒定和分離。
[0170]B2T啟動(dòng)子序列的實(shí)例在下文給出。
[0171] 改善的B2T啟動(dòng)子序列的實(shí)例在下文給出。
[0172] 來(lái)自B2T的5'UTR的實(shí)例在下文給出。如果來(lái)自其它物種的B2T啟動(dòng)子用于本發(fā) 明,那么技術(shù)人員將能夠基于其來(lái)自上述SEQIDN0的保守性質(zhì)容易鑒定5'UTR。他們將 隨后能夠用其它5'UTR替代它。制備的實(shí)例包括來(lái)自分子伴侶,特別是hsp家族,特別是 hsp83的5'UTR。來(lái)自hsp83的5'UTR的合適實(shí)例在下文給出。
[0173] 已經(jīng)成功用于本發(fā)明實(shí)施方案的3'UTR的合適實(shí)例是來(lái)自SV40的3'UTR。該 3'UTR在下文給出。
[0174]topi編碼序列在蚊子比如埃及伊蚊(Aedesaegypti)和地中海果蠅(Medfly) (C.capitata)間大部分保守。如對(duì)于B2T,人們可以通過(guò)序列相似性(很多方法,包括分 子和基于序列的方法)克隆topi(或其部分)編碼區(qū)域,然后轉(zhuǎn)向轉(zhuǎn)錄起始的5'并獲取其 5'DNA的大部分作為你的啟動(dòng)子。有多少不總是立即清楚;保守地轉(zhuǎn)向5',直到你到達(dá)下一 個(gè)轉(zhuǎn)錄的區(qū)域并獲取其全部,但是實(shí)踐中雄性生殖系啟動(dòng)子趨向于非常短(幾百個(gè)堿基), 因此轉(zhuǎn)錄起始5'lkb應(yīng)該足夠,如果你感覺(jué)謹(jǐn)慎,獲取2-5。這里的試驗(yàn)和錯(cuò)誤測(cè)試也顯而 易見(jiàn):將啟動(dòng)子連接至FP,制備轉(zhuǎn)基因,觀察表達(dá)模式。
[0175]topi是有用的,因?yàn)樗哂性缙诒磉_(dá)并且與精子自然發(fā)生相關(guān)。其也是有利的,因 為它是相對(duì)"緊湊的"系統(tǒng),即由相對(duì)少的多核苷酸組成。同樣,它是精巢特異的并且,實(shí)質(zhì) 上,它早于B2T表達(dá)。與B2T啟動(dòng)子相比,表達(dá)可能弱點(diǎn),但是如果表達(dá)水平需要被改善,這 在某些方面可以是有利的。Topi是轉(zhuǎn)錄因子的實(shí)例并且因此來(lái)自在精巢表達(dá)并且優(yōu)選精 巢-特異的(即僅在精巢表達(dá))的其它轉(zhuǎn)錄因子的啟動(dòng)子和/或調(diào)控元件在此是優(yōu)選的。
[0176] 我們發(fā)現(xiàn),在雜交中更強(qiáng)的完全絕育效果,其中與特別是埃及伊蚊(Aedes aegypti)中的B2-微管蛋白相比,核酸酶表達(dá)由Topi啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。盡管如此,在兩種情況 下都觀察到顯著的雄性不育,在蚊子,尤其是埃及伊蚊(Aedesaegypti)中"父性致死性效 應(yīng)"既賦予topi也賦予B2-微管蛋白合適啟動(dòng)子的改變形式。
[0177] 其產(chǎn)物(例如編碼的蛋白)僅在減數(shù)分裂時(shí)或減數(shù)分裂后需要的基因可能僅在減 數(shù)分裂前或后被短暫翻譯,即使更早被轉(zhuǎn)錄。相反,需要驅(qū)動(dòng)此基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子必須足 夠早被表達(dá)(轉(zhuǎn)錄和翻譯),使得其蛋白產(chǎn)物足夠積累以驅(qū)動(dòng)在減數(shù)分裂前的轉(zhuǎn)錄停止之 前目標(biāo)基因的足夠表達(dá)。因此,在需要在雄性生殖系中表達(dá)轉(zhuǎn)錄激活劑比如tTA的情況下, 雄性生殖系轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控元件可以以最小改進(jìn)相適合。
[0178] 下文更詳細(xì)描述合適的核酸內(nèi)切酶。然而,優(yōu)選的實(shí)施方案包括例如在LA4104看 到的鋅指核酸內(nèi)切酶。其它備選方案包括IppOl,也稱(chēng)為I-Pp〇I,如由Crisanti等人使用的 (Catteruccia等人,2009;Windbichler等人,2011;Windbichler等人,2007;Windbichler 等人,2008)。這具有某些優(yōu)點(diǎn),比如它具有非常長(zhǎng)的識(shí)別序列,相應(yīng)地,其在隨機(jī)序列中罕 見(jiàn)。然而,其相對(duì)于一些限制性?xún)?nèi)切酶不具有高特異性,例如,因?yàn)樗鼘⑷菰S(即仍然切割) 具有與典型識(shí)別序列一定程度差異的序列。Windbichler等人2007展示岡比亞按蚊(An. gambiae)組織培養(yǎng)細(xì)胞中的生長(zhǎng)抑制,其是合理的證據(jù)(如他們也推斷的),表達(dá)會(huì)是有毒 的,但是他們不直接顯示它。
[0179] 不同結(jié)果來(lái)自Windbichler等人2008,其中I-Ppol的表達(dá)-他們認(rèn)為其應(yīng)該只 切割岡比亞按蚊(An.gambiae)中的X染色體,因?yàn)樵诖宋锓N中,其在rDNA中目標(biāo)位點(diǎn)似乎 僅在X染色體上-給出完全不育的雄性,而不是其預(yù)期(由于對(duì)源自父系的X染色體的損 害而無(wú)可成活雌性后代,但有可成活雄性后代)。他們提議的解釋?zhuān)▽?duì)其他們提供了一些 支持?jǐn)?shù)據(jù))為精子中I-Pp〇I自身被轉(zhuǎn)移至受精卵中,在那里它也切割源自盤(pán)羞的X染色體 (他們似乎假定為蛋白,但是可能與為mRNA相當(dāng))。這是持久的問(wèn)題,其與蛋白(或mRNA) 穩(wěn)定性相關(guān).
[0180] 替代的優(yōu)選核酸內(nèi)切酶是Fok-1魚(yú)精蛋白融合核酸內(nèi)切酶。進(jìn)一步優(yōu)選的備選方 案包括EcoRI魚(yú)精蛋白融合核酸內(nèi)切酶。魚(yú)精蛋白是DNA結(jié)合蛋白并起具有一般非常低的 序列特異性。這與Fok-1,類(lèi)型IIS切割結(jié)構(gòu)域聯(lián)合。該切割結(jié)構(gòu)域必須二聚化以切割其 靶。這是有用的,因?yàn)樗鑫稽c(diǎn)需要一起足夠近,從而產(chǎn)生非線(xiàn)性濃度效應(yīng)。以單體作用的 效應(yīng)物被預(yù)期具有與其濃度成比例的其效果(這里,DNA切割)。對(duì)于很多應(yīng)用,人們將偏 好非線(xiàn)性劑量反應(yīng)曲線(xiàn),以致效果接近零直到某點(diǎn),但是隨后相對(duì)快速超過(guò)那個(gè)點(diǎn)增加至 完全有效,這點(diǎn)的限制是雙重'閾值'效果。核酸酶比如魚(yú)精蛋白-FokI被預(yù)期具有一定 程度的此種非線(xiàn)性。但是魚(yú)精蛋白結(jié)合DNA具有很少或不具有序列特異性。因此,在低濃 度(例如每個(gè)核中的分子)魚(yú)精蛋白-FokI蛋白將趨向于在染色質(zhì)周?chē)S機(jī)分散,很少以 足夠緊密的接近度/定位二聚化并切割染色體。
[0181] 然而,隨濃度增加,此接近度的幾率大大增加,導(dǎo)致濃度和切割之間的非線(xiàn)性關(guān) 系。這促進(jìn)啟動(dòng)子的選擇(和特異轉(zhuǎn)基因插入),因?yàn)樗鱿到y(tǒng)相對(duì)惰性,甚至具有低-但 是非零水平的脫靶(基底)表達(dá),同時(shí)在更高表達(dá)時(shí)仍然具有所要的效果(在預(yù)期的表達(dá) 結(jié)構(gòu)域,在可抑制表達(dá)系統(tǒng)的情況下去抑制)。在結(jié)合于DNA之前效應(yīng)物必須二聚化(或 形成更大復(fù)合體,例如四聚體)的情況下,可以獲得類(lèi)似的效果。在想要更線(xiàn)性的效果的情 況下,這可以通過(guò)使用不需要二聚化的核酸酶結(jié)構(gòu)域,或其中以單個(gè)多肽(例如FokI結(jié)構(gòu) 域的兩個(gè)拷貝而不是一個(gè))提供必要的亞單位,容易地在本發(fā)明的方法內(nèi)完成??梢允褂?更好或更差的序列特異性的核酸酶實(shí)現(xiàn)所述系統(tǒng)另外的操作,因?yàn)榭色@得得蛋白分子將通 過(guò)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)Ω罅炕蚋倭课稽c(diǎn)的特異性和親和力'集中',導(dǎo)致在那些位點(diǎn)更 大或更小程度的濃度。
[0182] 優(yōu)選所述魚(yú)精蛋白基因(或蛋白編碼序列)獲自與目標(biāo)物種的那個(gè)相同的物種。 優(yōu)選所述魚(yú)精蛋白基因源自黑腹果蠅0).melanogaster)。還優(yōu)選所述魚(yú)精蛋白基因源自埃 及伊蚊(Aedesaegypti)。
[0183] 設(shè)計(jì)與組成型表達(dá)的構(gòu)建體0X4466和0X4467相關(guān)的實(shí)例以分別研究效應(yīng)物蛋 白Aeprotamin-EcoRl和Aeprotamin-Fokl的功能性。這些實(shí)例顯示,這兩種效應(yīng)物蛋 白當(dāng)用于精子致死系統(tǒng),即在早期作用啟動(dòng)子(第二表達(dá)單元)的控制下時(shí)都應(yīng)該確定 工作。事實(shí)上,我們還繼續(xù)對(duì)Aeprotamin-Fokl二元構(gòu)建體繼續(xù)顯示這點(diǎn)。證明了兩種 效應(yīng)物蛋白的功能性之后,我們開(kāi)發(fā)和注射Aeprotamin-Fokl二元構(gòu)建體(參見(jiàn)實(shí)施例 "0X4282-0X4627Topi-tTAV-驅(qū)動(dòng)表達(dá)tet〇-Ae-魚(yú)精蛋白-Fokl-CD"),其證實(shí)了 之前的 (組成型表達(dá)的)系統(tǒng)的陽(yáng)性結(jié)果。因此,完全有理由預(yù)期EcoRl系統(tǒng)在精子致死環(huán)境中也 將產(chǎn)生效果。因此,效應(yīng)物基因優(yōu)選為Aeprotamin-EcoRl或Aeprotamin-Fokl。這些對(duì)于 在蚊子和尤其伊蚊(Aedes),尤其是埃及伊蚊(Aedesaegypti)中使用是最優(yōu)選的。
[0184] 其它類(lèi)型II核酸內(nèi)切酶包括例如Ec〇32I,BfiI,和MboII。這些核酸內(nèi)切酶是同源 二聚的。一般而言,二聚核酸內(nèi)切酶是有利的。他們是二聚的,因?yàn)樗麄儍H當(dāng)二聚化時(shí)才切 割DNA。當(dāng)它們適當(dāng)?shù)囟刍瘯r(shí),它們導(dǎo)致雙鏈DNA破壞。
[0185] 其它核酸內(nèi)切酶可以包括HEG's(歸巢核酸內(nèi)切酶(HomingEndonucleases)。這 些HEG's可以是單體或二聚體,但是一般具有低特異性(從它們不需要與其(非常長(zhǎng))識(shí) 別序列完全匹配,但是它們確定不僅切割隨機(jī)序列的意義上)。其它備選方案包括來(lái)自細(xì)菌 的限制型核酸內(nèi)切酶。這些也具有低特異性。
[0186] 因此,技術(shù)人員可以選擇所需特異性的水平。將理解對(duì)于給定的識(shí)別序列,低特異 性核酸內(nèi)切酶將比高特異性核酸內(nèi)切酶以更大量的機(jī)會(huì)破壞或損害DNA。HEGs具有非常長(zhǎng) 的識(shí)別序列,其將以常小于一次/基因組的頻率偶然發(fā)生。因此盡管對(duì)于該序列有其不完 美的特異性,它們可以根本不切割(例如Windbichler等人,2011中的I-Scel僅切割設(shè)計(jì) 的位點(diǎn),不切割基因組的剩余部分-至少不以足夠高以引起他們的實(shí)驗(yàn)中的明顯問(wèn)題的頻 率)。
[0187] 因此,通過(guò)適當(dāng)選擇核酸內(nèi)切酶為效應(yīng)物的進(jìn)一步精細(xì)調(diào)節(jié)水平是可能的。已 經(jīng)發(fā)現(xiàn)所述核酸酶效應(yīng)物融合蛋白在至今測(cè)試的三種不同雙翅目物種,即地中海果蠅 (C.capita),橄欖果蠅(B.oleae)和埃及伊蚊(Aedesaegypti)中是完全形式功能的。這 些物種是特別優(yōu)選的,如相同屬中其它物種一樣。
[0188] 特別優(yōu)選所述節(jié)肢動(dòng)物(本系統(tǒng)表達(dá)所在的宿主生物)是昆蟲(chóng),優(yōu)選實(shí)蠅 (Tephritid)。尤其,優(yōu)選所述昆蟲(chóng)來(lái)自雙翅目(OrderDiptera),尤其是高級(jí)雙翅目 并且特別它是實(shí)蠅,優(yōu)選地中海果蠅(Medfly)(地中海實(shí)蠅(地中海果蠅(Ceratitis capitata))),優(yōu)選墨西哥果蠅(Mexfly)(墨西哥按實(shí)蠅(Anastrephaludens)),優(yōu)選東方 果妮(Orientalfruitfly)(Bactroceradorsalis),撤攬果妮(Bactroceraoleae),瓜 實(shí)妮(Melonfly)(瓜實(shí)妮(Bactroceracucurbitae)),納塔爾果妮(Natalfruitfly) (納塔耳小條實(shí)蠅(Ceratitisrosa)),搜桃果蠅(搜桃繞實(shí)蠅(Rhagoletiscerasi)),昆 士蘭果蠅(Bactroceratyroni),桃果蠅(Bactrocerazonata)加勒比果蠅(加勒比按實(shí) 蠅(Anastrephasuspensa))或西印度群島果蠅(Anastrephaobliqua)。還特別優(yōu)選的所 述宿主生物是蚊子,優(yōu)選來(lái)自覆蚊亞屬(Stegomyia),伊蚊屬(Aedes),按蚊屬(Anopheles) 或庫(kù)蚊屬(Culex)。特別優(yōu)選是Stegomyiaaegyptae,也稱(chēng)為埃及伊蚊(Aedesaegypti),Stegomyiaalbopicta(也稱(chēng)為白紋伊蚊(Aedesalbopictus)),史氏按蚊(Anopheles stephensi),白魔按蚊(Anophelesalbimanus)和網(wǎng)比亞按蚊(Anophelesgambiae)。
[0189] 在雙翅目?jī)?nèi),其它優(yōu)選的群是麗蠅科(Calliphoridae),特別是新世界旋蠅 (NewWorldscrewworm)(嗜人維妮(Cochliomyiahominivorax)),舊世界旋妮(Old Worldscrewworm)(蛆癥金妮(Chrysomyabezziana))和澳大利亞羊_妮(Australian sheepblowfly)(銅綠妮(Luciliacuprina))。鱗翅目(Lepidoptera)和鞘翅目 (Coleoptera)也是優(yōu)選的,尤其是蛾,包括蘋(píng)果蠹蛾(codlingmoth)(Cydiapomonella), 和香(家香(Bombyxmori)),棉紅鈴蟲(chóng)(thepinkbollworm)(紅鈴麥蛾(Pectinophora gossypiella)),小菜蛾(thediamondbackmoth)(菜蛾(Plutellaxylostella)),舞 毒蛾(Gypsymoth)(Lymantriadispar),胳澄懦蟲(chóng)(theNavelOrangeWorm)(胳澄螟 (Amyeloistransitella)),桃芽蛾(PeachTwigBorer,桃條麥蛾(Anarsialineatella)) 和水稻螟蟲(chóng)(ricestemborer)(三化螟(Tryporyzaincertulas)),還有夜蛾,尤其是實(shí) 夜蛾亞科(Heliothinae)。鞘翅目(Coleoptera)中,日本甲蟲(chóng)(日本金龜子((Popilla japonica)),白流蘇甲蟲(chóng)(White-fringedbeetle)(白緣象(Graphognatusspp.)),棉 籽象鼻蟲(chóng)(Bollweevil)(墨西哥棉鈴象(Anthonomousgrandis)),玉米根蟲(chóng)(葉甲屬 (Diabroticaspp))和Colorado馬鈴薯甲蟲(chóng)(馬鈴薯甲蟲(chóng)(Leptinotarsadecemlineata)) 是特別優(yōu)選的。
[0190] 然而,如我們?cè)趯?shí)施例中顯示的,本系統(tǒng)和方法可以跨雙翅目實(shí)施,包括高級(jí)和低 級(jí)雙翅目。高級(jí)雙翅目因此是優(yōu)選的。低級(jí)雙翅目也是優(yōu)選的。
[0191] 在一些實(shí)施方案中,優(yōu)選所述昆蟲(chóng)不是果蠅(Drosphilid)。因此,在一些實(shí)施方案 中,在果蠅Orosophilid),尤其是黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)中的表達(dá)是被排 除的。
[0192] 優(yōu)選效應(yīng)物蛋白的表達(dá)導(dǎo)致生物中表型的后果,即不育。特別優(yōu)選地,功能蛋白可 以與可視標(biāo)記(包括熒光)關(guān)聯(lián)。
[0193] 在對(duì)特定核苷酸或蛋白序列進(jìn)行參考的情況下,將理解這包括對(duì)與其具有基本上 相當(dāng)?shù)蒙飳W(xué)活性的其任何突變體或變體的參考。優(yōu)選地,所述突變體或變體與參考序列 具有至少85 %,優(yōu)選至少90 %,優(yōu)選至少95 %,優(yōu)選至少99 %,優(yōu)選至少99. 9 %,和最優(yōu)選 至少99. 99 %的序列同一1丨生。
[0194] 我們預(yù)期:
[0195]a)本不育是顯性的,從而雜合雄性的所有精子將受影響(不必要都是缺陷的,因 為所述系統(tǒng)可能對(duì)于一些類(lèi)型的精子有選擇性,或?qū)?yīng)該受影響的那些精子有少于100% 的有效性);并且
[0196]b)所述機(jī)制不依賴(lài)于由通過(guò)這些精子的顯性致死基因的受精卵導(dǎo)致的遺傳
[0197] 因此,本系統(tǒng)不是RIDL系統(tǒng),因?yàn)閍)和b)都區(qū)別于RIDL。
[0198] 輻射的一個(gè)可能優(yōu)點(diǎn)是,難以看到野生目標(biāo)群體中可遺傳的或遺傳改變能夠克服 輻射的絕育效果。因此難以想象在野生群體中對(duì)于基于輻射的SIT的這方面產(chǎn)生的抗性 (然而其它類(lèi)型的抗性,比如行為抗性例如選型交配(Dhillon等人,2005),可能產(chǎn)生)。相 反,可以想象,賦予對(duì)RIDL基因的殺滅或失能作用的抗性的基因或等位基因可能產(chǎn)生。類(lèi) 似地,盡管CI的精確生物化學(xué)基礎(chǔ)未知,以沃爾巴克氏體(Wolbachia)的合適株感染的胚 胎能夠反轉(zhuǎn)CI誘導(dǎo)的雄性不育,因此對(duì)CI誘導(dǎo)的不育的生物化學(xué)/遺傳抗性似乎是可以 想象的。
[0199] 本發(fā)明克服這些困難。設(shè)計(jì)絕育機(jī)制以在合子基因表達(dá)前作用,從而可遺傳抗性 的可能性嚴(yán)格受限。例如,考慮使用在精子自然發(fā)生中表達(dá)的核酸酶。在限制性條件(對(duì) 于繁殖力,容許表達(dá)核酸酶)下,這將傾向于與輻射幾乎相同的方式損害DNA,例如誘導(dǎo)雙 鏈破壞。因此同樣難以想象野生目標(biāo)群體如何能夠發(fā)展出對(duì)此種不育或父本效應(yīng)致死性的 抗性。其可以是,人工大量飼養(yǎng)的群體可能發(fā)展出抗性,然而使用合適的條件表達(dá)系統(tǒng),從 而在容許的(對(duì)于繁殖力)條件下幾乎對(duì)精子(或其它細(xì)胞或組織)不進(jìn)行損害,將最小 化對(duì)于此種等位基因的選擇壓力。盡管從這方面與輻射類(lèi)似,但本發(fā)明的方法具有一些優(yōu) 點(diǎn)。絕育效果限制于性腺或配子,并且這樣較小可能降低昆蟲(chóng)的性能。通過(guò)選擇合適的可 抑制表達(dá)系統(tǒng),可以?xún)H通過(guò)去除抑制物就實(shí)現(xiàn)不育。從這方面,所述系統(tǒng)還提供生物節(jié)制, 因?yàn)獒尫诺揭巴獾睦ハx(chóng)(故意或無(wú)意)為不育的,或它們的后代中的部分或全部是不育的。
[0200] 我們打算將雌性致死(或不能飛)RIDL技術(shù)與本"精子致死"發(fā)明組合以開(kāi)發(fā)適 于在SIT計(jì)劃中實(shí)施的昆蟲(chóng)產(chǎn)品。我們?cè)趯?shí)施例中顯示本"精子致死"系統(tǒng)與RIDL技術(shù)的 聯(lián)合是可行的。當(dāng)然,還將存在不需要雌雄分離的物種,和需要雌雄分離但可以通過(guò)其他手 段實(shí)現(xiàn)的物種(例如基于物理尺寸的雌雄分離,如適于埃及伊蚊(Aedesaegypti)的)。因 此,優(yōu)選地,本表達(dá)系統(tǒng)還可以與存在的雌性致死(或不能飛)技術(shù)聯(lián)合以進(jìn)一步開(kāi)發(fā)適于 在SIT-類(lèi)型計(jì)劃中實(shí)施的節(jié)肢動(dòng)物,并特別是昆蟲(chóng)產(chǎn)品。對(duì)于SIT,對(duì)于很多物種,僅釋放 雄性被認(rèn)為是所需的,例如成體雌性即使不育實(shí)質(zhì)上或可能是有害的(例如蚊子,通過(guò)叮 咬,或地中海果蠅(Medfly),通過(guò)產(chǎn)卵于未成熟水果),同樣對(duì)于地中海果蠅(Medfly),共 釋放不育雌性似乎'干擾'不育雄性找到野生雌性(Rend6n等人,2004)。
[0201] 合適雌雄分離系統(tǒng)包括基于兩性異形的分離(例如埃及伊蚊(Aedesaegypti)的 尺寸,舌蠅(tsetsefly)的蛹化時(shí)間);誘導(dǎo)的兩性異形(例如Catteruccia等人,2005)。 備選地,可以通過(guò)使用致死遺傳雌雄鑒別系統(tǒng)排除一個(gè)性別;此種系統(tǒng)已經(jīng)通過(guò)經(jīng)典遺傳 學(xué)(例如Franz,2005 ;Klassen和Curtis,2005)和還通過(guò)包括RIDL的實(shí)施方案的重組DNA 方法((Fu等人,2007 ;Thomas等人,2000)構(gòu)建。兩種條件表達(dá)系統(tǒng)都可以使用相同條件, 從而協(xié)調(diào)控制兩種表型中每個(gè)的控制。因此,例如,如果各個(gè)系統(tǒng)被四環(huán)素(或其合適的類(lèi) 似物,比如氯四環(huán)素)抑制,在合適濃度的四環(huán)素的存在下飼養(yǎng)會(huì)讓所述株生長(zhǎng)到足夠數(shù) 量。在釋放前的最后一代中,在無(wú)四環(huán)素的條件下飼養(yǎng)會(huì)導(dǎo)致雌性-特異的致死系統(tǒng)和建 議的精子致死系統(tǒng)二者去抑制。因此,雌性將死亡并且剩余的雄性將是不育的。
[0202] 兩個(gè)tet-可抑制系統(tǒng)之間一定程度的對(duì)話(huà)(cross-talk)是可以預(yù)期的,從而兩 種效應(yīng)物將由兩個(gè)系統(tǒng)都表達(dá)。雌性中精子致死效應(yīng)物的表達(dá)不可能具有任何不想要的后 果,因?yàn)橐鈭D是這些雌性死亡。以其它方式對(duì)話(huà),即在精子自然發(fā)生中表達(dá)雌性-致死效應(yīng) 物可能有困難,其依賴(lài)于雌性-致死效應(yīng)物的性質(zhì)和其對(duì)精子自然發(fā)生的影響。如果認(rèn)為 不需要,此種對(duì)話(huà)可以容易被避免,以對(duì)雌性限制雌性-致死效應(yīng)物的表達(dá),例如通過(guò)使用 型別特異的可變剪接調(diào)節(jié)功能效應(yīng)物的產(chǎn)生(Fu等人,2007)。
[0203] 可以以?xún)煞N方式實(shí)現(xiàn)所述組合技術(shù):
[0204] -可以將提議的發(fā)明通過(guò)轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化分開(kāi)插入昆蟲(chóng)的基因組。仔細(xì)分析產(chǎn) 生的株將引起具有所需特征的候選株??梢詫⑦@些回交以導(dǎo)致雌性致死(優(yōu)選fs-RIDL) 株產(chǎn)生雙純合子用于兩次插入。
[0205] 在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中,可以將兩個(gè)系統(tǒng)與條件雌性-特異的致死構(gòu)建體 組合在單個(gè)DNA構(gòu)建體上。該構(gòu)建體將因此既提供遺傳雌雄鑒別也提供雄性不育。
[0206] 精子自然發(fā)生是細(xì)胞分化的高度專(zhuān)化的過(guò)程,其導(dǎo)致用于成功繁殖的功能精子的 形成。理論上,精子自然發(fā)生的過(guò)程在所有有性繁殖的生物中是良好保守的,盡管成熟精 子的大小和形狀在不同物種間十分不同。很多細(xì)節(jié)在哺乳動(dòng)物和果蠅(Drosophila)之間 是類(lèi)似的,使得果蠅成為研究生育缺陷的非常好的模型系統(tǒng)。像哺乳動(dòng)物的生殖細(xì)胞,果蠅 (Drosophila)生殖細(xì)胞,在胚胎發(fā)育的早期被預(yù)留出來(lái)并通過(guò)后腸原基遷移入胚胎內(nèi)部, 在那里,它們加入胚胎性腺的體部(Zhao和Garbers, 2002)。在第三幼蟲(chóng)齡的最后和蛹化 的開(kāi)始,第一生殖細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂。精子自然發(fā)生是成熟階段過(guò)程中的連續(xù)過(guò)程并且,因 此,成體精巢含有從干細(xì)胞到成熟精子的所有階段。
[0207] -般而言,對(duì)于精子自然發(fā)生中的雄性(昆蟲(chóng))生殖系細(xì)胞,轉(zhuǎn)錄在減數(shù)分裂前短 暫關(guān)閉(Fuller, 1993)??梢杂幸恍┲筠D(zhuǎn)錄的基因(Barreau等人,2008),但是這些是例 外的。一般而言,但在減數(shù)分裂時(shí)或減數(shù)分裂后需要其產(chǎn)品的基因在減數(shù)分裂前轉(zhuǎn)錄;之 后儲(chǔ)存和翻譯mRNA,即當(dāng)需要時(shí),例如轉(zhuǎn)錄后。之后在翻譯后典型地mRNA降解。很多基因 遵循此模式;實(shí)例包括3 2-微管蛋白和魚(yú)精蛋白,還有減數(shù)分裂調(diào)節(jié)劑twine。這些當(dāng)中, twine蛋白是進(jìn)入減數(shù)分裂所需的,3 2-微管蛋白是減數(shù)分裂紡錘體和減數(shù)分裂后鞭毛所 需的;魚(yú)精蛋白嚴(yán)格是減數(shù)分裂后所需的。因此,可以提供時(shí)機(jī)的適當(dāng)控制。
[0208] 理論上通過(guò)影響(例如殺死)精子自然發(fā)生所需的精巢中的體細(xì)胞(例如包囊細(xì) 胞),或通過(guò)在雄性中影響激素產(chǎn)生等或(稍微更有希望)表達(dá)或消除精液中的因子破壞 精子產(chǎn)生應(yīng)該是可能的。然而,此種方法將至多確定產(chǎn)生至多無(wú)精子雄性,或明顯異常的精 子。為了此原因,我們?cè)噲D集中于雄性生殖系表達(dá)。
[0209] 牛葙系啟動(dòng)子序列
[0210] 因此,可以容易制備單基因表達(dá)構(gòu)建體,其將在雄性生殖系中表達(dá)研究的基因 ("效應(yīng)物")。已經(jīng)在果蠅Orosophila)中鑒定了很多基因,其在精子自然發(fā)生過(guò)程中 表達(dá)并且這些中的很多是生殖系,或雄性生殖系特異的。此種表達(dá)數(shù)據(jù)可容易直接從文獻(xiàn) 獲得;還有大規(guī)模的項(xiàng)目(Chintapalli等人,2007)和http://www.flyatlas.org/)對(duì)果 蠅(Drosophila)基因組中的很多基因進(jìn)行表達(dá)分析(例如FlyAtlas(Chintapalli等人, 2007)和http://www.flyatlas.org/,果妮(Drosophila)精巢表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(www.fly-ted. org)和在FlyBase上整理的數(shù)據(jù),例如http://flybase.bio.indiana.edu/)。因此可以如 下制備表達(dá)構(gòu)建體:
[0211] (1)鑒定合適的精巢-表達(dá)的基因,例如@2-微管蛋白,其編碼微管蛋白的雄 性-生殖系-特異的同種型(Nielsen等人,2001)(近期的報(bào)道(Jattani等人,2009),表 明32-微管蛋白的表達(dá)和功能可以不嚴(yán)格限制于果蠅(Drosophila)中的雄性生殖系,然 而來(lái)自R比亞按蚊(An.gambiae) 0 2-微管蛋白的啟動(dòng)子片段用于表達(dá)有效的核酸酶,已 知其切割岡比亞按蚊(An.gambiae)基因組中的序列,除了在雄性生殖系和在由來(lái)自此種 雄性的精子受精的胚胎中之外無(wú)明顯影響);
[0212] (2)分離基因的野生型拷貝;
[0213] (3)用效應(yīng)物基因替代基因的編碼區(qū)域;和
[0214] 4)使轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)攜帶該基因。
[0215] 通過(guò)該方法在果蠅(Drosophila)中使用一系列參與精子自然發(fā)生的基因比如 魚(yú)精蛋白,例如donjuan和sneaky,實(shí)現(xiàn)突光蛋白報(bào)道分子的雄性-生殖系-特異表達(dá) (Raja和Renkawitz-Pohl,2005;Santel等人,1997;Wilson等人,2006)。0 2-微管蛋白 是良好的保守基因,因此對(duì)此方法的延伸,在步驟2中從研究的物種(或相關(guān)物種,比如岡 比亞按蚊(Anophelesgambiae)分離適當(dāng)基因用于在史氏按蚊(Anophelesstephensi) 中使用(Catteruccia等人,2005)),將允許在任意選擇的節(jié)肢動(dòng)物物種中使用。該方法已 經(jīng)實(shí)質(zhì)上成功用于在包括地中海果蠅(Malacrida等人,2007),埃及伊蚊(Aedesaegypti) (Maynard-Smith等人,2007)和網(wǎng)比亞按蚊(Anophelesgambiae)(Catteruccia等人, 2005)的一些物種中雄性-生殖系-特異表達(dá)熒光蛋白報(bào)道分子,它們所有都使用來(lái)自 目標(biāo)物種的0 2-微管蛋白的啟動(dòng)子片段,除了Catteruccia等人使用來(lái)自網(wǎng)比亞按蚊 (Anophelesgambiae) 0 2-微管蛋白的啟動(dòng)子片段在史氏按蚊(Anophelesstephensi)中 驅(qū)動(dòng)精子自然發(fā)生-特異表達(dá)熒光蛋白。
[0216] 將"精子致死性"與條件表達(dá)系統(tǒng)聯(lián)合使用以通過(guò)在容許的條件下生殖保證轉(zhuǎn)換。 該條件可以是溫度,例如通過(guò)溫度-敏感蛋白效應(yīng)物產(chǎn)生效果。然而,基于溫度的條件系統(tǒng) 傾向于例如"有滲漏"。TSL雌雄鑒別地中海果蠅(Medfly)株(Casares,2002),基于外部施 加分子(例如RU486/米非司酮(mifepristone) (Osterwalder等人,2001))的存在/缺失 的系統(tǒng)可以使備選的。然而,其不適于二元表達(dá)系統(tǒng)(Brand等人,1994 ;Brand和Perrimon, 1993 ;Fussenegger,2001;Fussenegger等人,2000;Gossen和Bujard,1992;Gossen和 Bujard,2002;Victorinovd和Wimmer,2007)。
[0217] 另一方面,Tet-關(guān)或Tet-開(kāi)系統(tǒng)是選擇的方案(Gossen和Bujard, 1992;Gossen 和Bujard,2002)。該系統(tǒng)依賴(lài)于條件地驅(qū)動(dòng)合適基因(效應(yīng)物)的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的表 達(dá)。在tet系統(tǒng)中,合成的轉(zhuǎn)錄因子tTA(或其變體,包括rtTA)的結(jié)合受四環(huán)素和/或相 關(guān)化合物比如氯四環(huán)素或多西環(huán)素濃度影響。在tet-關(guān)表達(dá)系統(tǒng)中,tTA對(duì)tetO的結(jié)合 被四環(huán)素抑制,因此效應(yīng)物的表達(dá)被四環(huán)素抑制,從而"Tet-關(guān)"。由鏈陽(yáng)菌素調(diào)控的類(lèi)似 的表達(dá)系統(tǒng)也是已知的(Fussenegger等人,2000)。然而,在0 2-微管蛋白的控制下的tTA 的表達(dá),例如,將不導(dǎo)致效應(yīng)物的顯著表達(dá),甚至在缺少四環(huán)素的情況下。這是因?yàn)閠TA的 表達(dá)將基本上在減數(shù)分裂后(更確切地,基本上在減數(shù)分裂前的轉(zhuǎn)錄關(guān)閉之后),并且因此 太遲以不能驅(qū)動(dòng)效應(yīng)物的表達(dá),甚至在缺少四環(huán)素的情況下。
[0218] 關(guān)鍵是理解在節(jié)肢動(dòng)物并且尤其是在昆蟲(chóng)精子自然發(fā)生種基因表達(dá)的時(shí)機(jī)。在減 數(shù)分裂起始后基本上無(wú)基因表達(dá)。因此,為了使用二元表達(dá)系統(tǒng)比如tet-關(guān)(或tet-開(kāi)), 序列-特異轉(zhuǎn)錄因子(tTA)的轉(zhuǎn)錄必須在減數(shù)分裂之前足夠遠(yuǎn)以允許在減數(shù)分裂之前積累 tTAmRNA,翻譯tTA蛋白和tTA-依賴(lài)地轉(zhuǎn)錄效應(yīng)物。在精子自然發(fā)生過(guò)程中表達(dá)的大多數(shù) 基因在精母細(xì)胞中(即在減數(shù)分裂前)轉(zhuǎn)錄,但然后當(dāng)實(shí)際需要蛋白產(chǎn)物時(shí)翻譯。對(duì)于參 與精子分化或功能的多數(shù)蛋白(和因此多數(shù)精子蛋白),這意為在減數(shù)分裂后翻譯。因此, 為了我們的目的的合適的表達(dá)意為tTA的早期轉(zhuǎn)錄和早期翻譯。這不是被廣泛認(rèn)可的,并 且也不易實(shí)現(xiàn)。因此,我們第一個(gè)發(fā)現(xiàn)這里存在問(wèn)題。
[0219] 可以使用異源序列,而不是源自精巢-表達(dá)的基因的序列構(gòu)建合適3'UTR,例如也 可以保留精巢-表達(dá)的基因的編碼區(qū)域的全部或部分。雄性-生殖系-特異地表達(dá)熒光蛋 白報(bào)道分子已經(jīng)通過(guò)該方法在果蠅Orosophila)中使用一系列參與精子自然發(fā)生的基因 比如魚(yú)精蛋白,例如donjuan和sneaky實(shí)現(xiàn)(Raja和Renkawitz_Pohl,2005;Santel等 人,1997 ;Wilson等人,2006)。類(lèi)似地,5'UTR可以用異源序列替代以避免在減數(shù)分裂后 翻譯。五個(gè)主要的非翻譯區(qū)(5'UTR),可以包含用于通過(guò)例如調(diào)控元件的方式控制基因表 達(dá)的序列。已經(jīng)將啟動(dòng)或抑制翻譯起始或5'UTRs內(nèi)的內(nèi)含子的序列基因表達(dá)和mRNA輸 出的調(diào)控相關(guān)聯(lián)(Cenic等人,2011)。其在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)開(kāi)始并且在編碼區(qū)域的起始密碼 子(通常AUG)之前一個(gè)核苷酸(nt)終止。
[0220] 為了獲得tTAV和效應(yīng)物基因各自的足夠表達(dá),換句話(huà)說(shuō),為了獲得"精子致死 性,"我們用來(lái)自hsp83(Theodoraki&Mintzas,2006)和SV40(猴空泡形成病毒(Simian vacuolatingvirus) 40 或猴病毒(Simianvirus) 40)(Cheng等人,2009)的相應(yīng)序列分別 替代(在第二表達(dá)單元的上游調(diào)控元件中)0 2-微管蛋白基因的5'UTR,和在一些情況下 3'UTR,參見(jiàn)本文的討論和本實(shí)例。
[0221] 換句話(huà)說(shuō),優(yōu)選的5'UTR來(lái)自hsp83。這優(yōu)選來(lái)自地中海果蠅(Medfly),因?yàn)樗?是我們?cè)诰唧w實(shí)例中使用的,但是來(lái)自其它物種的同源物也是優(yōu)選的。優(yōu)選的3'UTR來(lái)自 SV40,但是也可以來(lái)自hsp83(如上文對(duì)于5'UTR的物種)。然而,我們發(fā)現(xiàn)5'UTR的選擇 比3'UTR的選擇更重要。
[0222] 反式激活子(這里以tTA為例)的更早表達(dá),也可以通過(guò)以下方法中的任一個(gè)實(shí) 現(xiàn)。一個(gè)實(shí)例是通過(guò)鑒定在精子自然發(fā)生中更早作用的啟動(dòng)子。這意為啟動(dòng)子作用從而在 該啟動(dòng)子控制下表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,例如tTA將能夠驅(qū)動(dòng)tTA-響應(yīng)性效應(yīng)物構(gòu)建體的表達(dá)。 我們偏愛(ài)這不是在生殖系干細(xì)胞中基本上活化的啟動(dòng)子,因?yàn)榇朔N基因(例如vasa)在未 成熟階段表達(dá);這將傾向于導(dǎo)致效應(yīng)物的表達(dá)(在誘導(dǎo)的或去抑制的條件下)在發(fā)育的很 早期表達(dá),可能導(dǎo)致對(duì)生殖系的損害或生殖系的喪失并且因此不產(chǎn)生或產(chǎn)生更少的配子。 如果所述表達(dá)系統(tǒng)在發(fā)育中晚些誘導(dǎo)(或去抑制),精子自然發(fā)生的時(shí)間過(guò)程,即干細(xì)胞分 裂和成熟精子的產(chǎn)生之間(在果蠅(Drosophila)中為幾天),會(huì)導(dǎo)致對(duì)誘導(dǎo)(或去抑制) 的緩慢反應(yīng)(例如不育);該效果由雄性?xún)?chǔ)存精子的能力復(fù)合。
[0223] 我們因此偏愛(ài)使用來(lái)自在精原細(xì)胞或初級(jí)精母細(xì)胞中表達(dá)的基因的啟動(dòng)子元件。 如上文討論的,很多在初級(jí)精母細(xì)胞中表達(dá)的基因參與之后的功能并且在減數(shù)分裂后翻 譯,因此我們偏愛(ài)具有減數(shù)分裂前功能的基因(和來(lái)自基因的啟動(dòng)子)。特別優(yōu)選的基因類(lèi) 型是編碼轉(zhuǎn)錄因子,或轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的組分的那些,其參與精子自然發(fā)生基因(例如之后作 用的基因)的表達(dá)。偏愛(ài)此種基因的關(guān)鍵原因是,幾乎通過(guò)限定,在精子自然發(fā)生中足夠早 表達(dá)(以蛋白水平),從而能夠驅(qū)動(dòng)其它基因的減數(shù)分裂前表達(dá)(當(dāng)然此種復(fù)合體的負(fù)調(diào)控 元件也是優(yōu)選的,重要的是表達(dá)的時(shí)機(jī),而不是翻譯的蛋白的特異功能)。
[0224] 已知此種基因的一些類(lèi)型。然而,如下文討論的,不是所有都是合適的并且一些相 對(duì)其它的是優(yōu)選的。類(lèi)型包括can-類(lèi)型的減數(shù)分裂停止基因。該類(lèi)型包括can,mia,sa, nht和rye;這些編碼廣泛表達(dá)的TATA-結(jié)合蛋白相關(guān)因子(TAFs)精巢特異的旁系同源物 (Hiller等人,2004)。其它類(lèi)型是減數(shù)分裂停止基因的aly-類(lèi)型。這些包括aly,comr, achi/vis,topi和tomb,其編碼序列特異的DNA結(jié)合蛋白和與稱(chēng)為dREAM或Myb-MuvB的廣 泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合體旁系同源的相關(guān)因子的復(fù)合體的組分(Beall等人,2007;Jiang 等人,2007 ;Jiang和White-Cooper,2003 ;White_Cooper等人,2000)。這些基因中的大多 數(shù)似乎通過(guò)保守的'體'基因(例如在體系或生殖系中都行使功能的祖先TAFs或Myb-MuvB 組分)的復(fù)制而呈現(xiàn),然后專(zhuān)化這些版本為生殖系-或雄性生殖系特異的表達(dá)和作用。這 些復(fù)制中的一些似乎在進(jìn)化中相對(duì)近期發(fā)生,意味著生殖系-特異的種內(nèi)同源基因以可 變的,并且在一些情況下非常有限,種系發(fā)生的/分類(lèi)學(xué)范圍存在。我們偏愛(ài)使用從果蠅 (Drosophila)到研究的物種都保守的基因的啟動(dòng)子,并且特別偏愛(ài)橫跨寬種系發(fā)生/分類(lèi) 學(xué)范圍保守的基因的啟動(dòng)子;該保守使鑒定同源物更容易,并且使特異基因更普遍有用。
[0225] 可以以以下兩種方式中的一種鑒定此種(保守早期作用)基因:
[0226] Li甬丄寸與侈il々口來(lái)自果也黽(Drosophila)的已知基因同源,以具有合適表汰模式矛口 水平。
[0227] 這通過(guò)在序列數(shù)據(jù)庫(kù)中同源性檢索獲得。然而,一些精子自然發(fā)生基因正 在快速進(jìn)化,并且特異同源物不能容易地橫跨寬的種系發(fā)生范圍而被鑒定。例如, bag-of-marbles(bam)滿(mǎn)足上文的早期表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)-bam在精原細(xì)胞中表達(dá)(并且也在卵 子發(fā)生中表達(dá))并且早期行使功能-其參與調(diào)節(jié)精原細(xì)胞的有絲分裂數(shù)量(Gonczy等人, 1997 ;Kawase等人,2004)。此外,bam啟動(dòng)子的片段已經(jīng)成功用于果蠅(Drosophila)的 精子自然發(fā)生(并且也在卵子發(fā)生)的二元表達(dá)系統(tǒng)(GAL4/UAS) (Jiang等人,2007)。然 而,bam僅在果蠅(Drosophilid)中可被識(shí)別。具有類(lèi)似表達(dá)模式的其它基因(其基因產(chǎn) 物被認(rèn)為與bam的產(chǎn)物相互作用)是良性性母細(xì)胞腫瘤(benigngonialcellneoplasm, bgcn)。不幸的是,該基因也不是跨昆蟲(chóng)良好保守的;兩種基因都顯示正選擇和快速進(jìn)化的 信號(hào)(BauerDuMont等人,2007)。
[0228] 對(duì)于can-類(lèi)型和aly-類(lèi)型減數(shù)分裂停止基因的一些成員也產(chǎn)生困難。他們中的 很多似乎源自據(jù)推測(cè)既用于體細(xì)胞也用于生殖系細(xì)胞的祖先基因的復(fù)本。所述生殖系版本 傾向于快速進(jìn)化,從而體旁系同源物比生殖系旁系同源物更容易被鑒定。此外,導(dǎo)致果蠅 (Drosophila)中這些體/生殖系基因?qū)Φ膹?fù)本系列似乎發(fā)生在雙翅目從其它目昆蟲(chóng)的趨 異之后,因此大多數(shù)這些基因的生殖系-特異的種內(nèi)同源基因不存在于雙翅目之外,并且 它們中的一些僅存在于高等雙翅目中。
[0229] 然而,例外的確存在;這些容易通過(guò)與來(lái)自其它目的昆蟲(chóng)(例如意蜂(Apis mellifera),赤擬谷盜(Triboliumcastaneum),家香(Bombyxmori)-基因組的大部分已經(jīng) 被測(cè)序的昆蟲(chóng)的列表快速增加并且容易由本領(lǐng)域技術(shù)人員評(píng)估)序列比較而鑒定。此種基 因的一個(gè)實(shí)例是matotopetli(topi) (aly-類(lèi)型基因),其編碼在雙雜篩選中鑒定為結(jié)合其 它aly-類(lèi)型蛋白(Comr)的,推定的序列-特異DNA結(jié)合蛋白并且因此據(jù)推測(cè)是精巢-特異 的Myb-MuvB復(fù)合體的組分。在果蠅(Drosophila)和網(wǎng)比亞按蚊(Anophelesgambiae)中 鑒定了Topi同源物(Perezgasga等人,2004);通過(guò)公共序列數(shù)據(jù)庫(kù)的序列相似性檢索,我 們也在一些其它目的昆蟲(chóng),包括鞘翅目(Coleoptera)(赤擬谷盜(Triboliumcastaneum), NW_001092862. 1),膜翅目(Hymenoptera)(意蜂(Apismellifera),NW_001253507. 1)中鑒 定了同源物。因此Topi是具有合適表達(dá)模式的良好保守基因的實(shí)例(基于(i)FlyAtlas上 和別處的定量rtPCR數(shù)據(jù);(ii)在初級(jí)精母細(xì)胞中,尤其是早期初級(jí)精母細(xì)胞中由RNA原 位雜交顯示的發(fā)育表達(dá)模式(Perezgasga等人,2004) ;(iii)預(yù)測(cè)的作為雄性生殖系-特 異轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的部分的功能(Beall等人,2007 ;Perezgasga等人,2004) ;(iv)通過(guò)突變體 表型分析的實(shí)際功能影響許多其它精子自然發(fā)生基因的表達(dá)(Perezgasga等人,2004))。
[0230] 也可以通過(guò)以下方法鑒定具有早期作用啟動(dòng)子的基因:
[0231] 2.從目標(biāo)物種詵擇的某閔的同源物鑒定
[0232] 來(lái)自與研究的物種具有更大或更小種系發(fā)生距離的物種的相關(guān)序列的比對(duì)將鑒 定可能在目標(biāo)物種的研究的基因中保守的區(qū)域。優(yōu)選,為了富集研究的基因并避免內(nèi)含子 的問(wèn)題,將使用來(lái)自提取自雄性的RNA的cDNA,最優(yōu)選來(lái)自解剖的精巢。合適的啟動(dòng)子片段 可以從所研究基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)域的克隆片段獲得。
[0233] 合適啟動(dòng)子片段的候選物在轉(zhuǎn)錄起始的5'包含至少50個(gè)核苷酸堿基的基因組 DNA,并且優(yōu)選,轉(zhuǎn)錄由自身起始并且轉(zhuǎn)錄區(qū)域的至少1個(gè)核苷酸。這將包含啟動(dòng)子片段和 報(bào)道分子的開(kāi)放閱讀框。其還可以包含5'和3'UTR序列,或者來(lái)自與啟動(dòng)子片段相同的基 因,或者來(lái)自其它區(qū)域。如果基因被正確地鑒定為在精子自然發(fā)生中是活化的,來(lái)自相同基 因的那些可能在精子自然發(fā)生中行使功能,然而他們也可以包含信號(hào),例如用于延遲的翻 譯,這對(duì)于必須在減數(shù)分裂前行使功能的蛋白(比如tTA)的表達(dá)將是不希望的。來(lái)自與啟 動(dòng)子片段相同的基因的調(diào)控序列因此對(duì)于功能已知或被認(rèn)為是(例如通過(guò)同源性)減數(shù)分 裂前的(例如topi)的基因是優(yōu)選的,但是異源調(diào)控序列對(duì)于功能已知或被認(rèn)為減數(shù)分裂 的或減數(shù)分裂后的基因是優(yōu)選的。
[0234] 為了我們工作的目的,本實(shí)施例中,我們分離并測(cè)試了具有不同效應(yīng)物蛋白的,來(lái) 自地中海果蠅(C.capitata)和埃及伊蚊(A.aegypti)的topi啟動(dòng)子序列。
[0235] 產(chǎn)生后期精子表型的蛋白效應(yīng)物
[0236] '后期'這里意為在需要精子功能的點(diǎn)(例如轉(zhuǎn)移至雌性或進(jìn)入卵)之后。目的 是產(chǎn)生轉(zhuǎn)移至雌性的精子并且將誘導(dǎo)雌性中對(duì)再交配的不應(yīng)態(tài),并且如果雌性的確再交配 將在精子競(jìng)爭(zhēng)方面做好。當(dāng)雌性與多于一個(gè)雄性交配時(shí),精子競(jìng)爭(zhēng)發(fā)生,或能夠發(fā)生;在 此情況下,哪個(gè)雄性生育,雌性胚胎的比率是什么的問(wèn)題產(chǎn)生??赡懿晦D(zhuǎn)移精子的雄性在 此種情況下將做得不好。由于對(duì)于使用無(wú)精子,或具有不能轉(zhuǎn)移至雌性的精子,或具有轉(zhuǎn) 移至雌性后不能與其它精子競(jìng)爭(zhēng)的精子的雄性的進(jìn)化反應(yīng)的可能(likelihood)或概率 (possibility),為了生物控制的目的,需要設(shè)計(jì)的確產(chǎn)生精子,這些精子能夠轉(zhuǎn)移至雌性 并在轉(zhuǎn)移至雌性后能夠與其它精子競(jìng)爭(zhēng)的不育雄性。
[0237] 父本效應(yīng)致死
[0238] 我們的途徑,我們青睞的實(shí)現(xiàn)"不育"的方法是構(gòu)建父本效應(yīng)致死,其中精子進(jìn)入 卵,但是無(wú)可成活受精卵(能夠發(fā)育為可育成體)形成。優(yōu)選地,該效果由具有單拷貝的父 本效應(yīng)致死的雄性產(chǎn)生,盡管使用多拷貝也是可預(yù)見(jiàn)的。將雄性純合釋放到環(huán)境中用于條 件父本效應(yīng)致死是特別是優(yōu)選的,這樣在飼養(yǎng)過(guò)程中株基本上穩(wěn)定。本發(fā)明的父本效應(yīng)致 死(Pals)典型地影響由攜帶至少一個(gè)拷貝Pal的雄性產(chǎn)生的精子中的全部或大多數(shù)。尤 其,所述受精卵可以受不利影響,例如基于親本的基因型被殺死,被絕育或其發(fā)育(例如性 別表型被改變。這與RIDL相反,其中對(duì)受精卵的影響基于胚胎基因型。因此,對(duì)于在單個(gè) 位置的RIDL構(gòu)建體,野生型雌性和雄性雜合之間交配的后代將典型地產(chǎn)生?50%正常后 代和經(jīng)遺傳獲得RIDL構(gòu)建體并可以受其影響的?50%。相反,對(duì)于Pal,雄性雜合的所有 后代都可以受影響。
[0239] -些類(lèi)型的基于蛋白的效應(yīng)物是可預(yù)見(jiàn)的。蛋白或RNA效應(yīng)物可以隨精子被傳輸 以影響卵或發(fā)育的受精卵。這些可以在精子表面(例如如果蠅(Drosophila)性肽,SP), 或在其內(nèi)部產(chǎn)生和儲(chǔ)存。精子自然發(fā)生的其它階段的精子和細(xì)胞,對(duì)一些類(lèi)型的蛋白,例如 促凋亡蛋白有顯著抗性,據(jù)推測(cè)因?yàn)榈蛲鐾緩奖恢付ㄓ诰幼匀话l(fā)生中的其它目的(Arama 等人,2003 ;Cagan,2003)。
[0240] 優(yōu)選所述效應(yīng)物對(duì)精子具有直接的生物化學(xué)效果,而不是僅使用精子作為通過(guò)其 進(jìn)入卵的載體(并隨后在那里具有效果)。這是由于考慮到可能的抗性。在SIT-類(lèi)型計(jì)劃 中,在人工飼養(yǎng)設(shè)施中產(chǎn)生釋放的雄性,從而它們和它們的基因型在一定程度上在控制下, 或與可能從相同物種的野生群體被鑒定或排除相比,至少變異可以可能更容易被鑒定或排 除。作用于卵(或發(fā)育中的受精卵)的生物化學(xué)效果可以可能通過(guò)那個(gè)卵中的改變被改變 或緩和;如果這些可遺傳,那么至少存在可能的對(duì)產(chǎn)生該生物化學(xué)效果的毒素的可遺傳抗 性的基礎(chǔ)。相反,在其進(jìn)入卵之前(或在其進(jìn)入雌性之前),難以看到母系或合子基因型怎 樣能夠補(bǔ)償已經(jīng)對(duì)精子進(jìn)行的至少一些類(lèi)型的損害。此種損害的一個(gè)實(shí)例是對(duì)精子包含 的遺傳信息的損害,其它實(shí)例(盡管可能關(guān)于母系/合子基因組補(bǔ)償能力具有較弱的確定 性),包括早期過(guò)程的關(guān)鍵組分的喪失或損害比如例如精子膜破裂或精子核去凝縮,或中心 體功能。
[0241] 父本效應(yīng)致死的一種優(yōu)選類(lèi)型是核酸酶。盡管精子對(duì)受精卵貢獻(xiàn)很多東西,一個(gè) 關(guān)鍵的東西是遺傳信息。如果該遺傳信息被損害到部分或(優(yōu)選)基本上所有受精卵不可 成活的程度,那么這形成通過(guò)父本效應(yīng)致死性的不育的合適形式的基礎(chǔ)。如例如在常規(guī)不 育昆蟲(chóng)技術(shù)中使用的輻射-絕育是條件(在通過(guò)輻射可誘導(dǎo)的情況下)父本效應(yīng)致死性的 實(shí)例;用化學(xué)不育劑,例如噻替派(thiotepa)的絕育是另一個(gè)。這些方法中的每個(gè)通過(guò)損 壞精子中DNA,從而降解攜帶至很多受精卵死亡的點(diǎn)的遺傳信息,而產(chǎn)生效果(Robinson, 2005)?;瘜W(xué)不育劑比如噻替派(thiotepa)和bisazir,例如,可以留下毒性殘留并且通常 認(rèn)為對(duì)于廣泛使用是不可接受的。
[0242] 在精子中,或在精子自然發(fā)生過(guò)程中合適核酸酶的合適表達(dá),將具有破壞配子的 遺傳信息,或產(chǎn)生配子而不類(lèi)似地破壞雄性體細(xì)胞的遺傳信息的效果。這將降低與絕育過(guò) 程相關(guān)聯(lián)的使雄性失能的程度。相反,使用輻射或化學(xué)不育劑典型地大致相等地將所有細(xì) 胞暴露于絕育劑。
[0243] 合適的核酸酶是切割DNA,優(yōu)選產(chǎn)生雙鏈損傷的那個(gè)。影響遺傳信息的儲(chǔ)存或解 釋?zhuān)蚶缤ㄟ^(guò)細(xì)胞DNA修復(fù)機(jī)制導(dǎo)致直接切割或修飾DNA的DNA-修飾酶,在此也歸類(lèi)為 核酸酶;將理解對(duì)'切割'DNA的引用,例如,因此適當(dāng)包括'修飾'DNA。
[0244] 合適的表達(dá)是條件表達(dá),從而在限制性條件(對(duì)于可育性,顯然這些是表達(dá)核酸 酶的容許條件)下,來(lái)自攜帶至少一個(gè)拷貝的包含核酸酶父本效應(yīng)致死系統(tǒng)的雄性('PAL 雄性')的至少30%,優(yōu)選多于50%和最優(yōu)選> 90%的精子不能使卵受精以形成能夠存活 以在典型地飼養(yǎng)條件,例如如在野外建立的條件,或近似于野外建立的條件的實(shí)驗(yàn)室條件 下產(chǎn)生可育成體的可成活受精卵。相反,在容許條件下(對(duì)于可育性),相當(dāng)?shù)腜AL雄性應(yīng) 該比限制性條件顯著產(chǎn)生更多的可成活受精卵;優(yōu)選至少50%的受精卵應(yīng)該存活。
[0245] 優(yōu)選地,在雄性表達(dá)中核酸酶基本上受限于生殖系。在這可以意為表達(dá)基本上限 制于雄性生殖系的同時(shí),這不是關(guān)鍵的。對(duì)于一些應(yīng)用,排除雌性是所需的(例如SIT中的 遺傳雌雄鑒別(Alphey,2007 ;Franz,2005))。在雌性被排除掉的情況下,在雌性中表達(dá)核 酸酶可以不是不可取的。實(shí)質(zhì)上,如果用于排除,或幫助排除雌性,其可以是所需的。這會(huì) 是可能的'雙重用途'的實(shí)例-使用核酸酶既作為PAL也作為(合子)顯性致死以殺死一 些或全部雌性。已知很多核酸酶。相關(guān)類(lèi)型包括限制性核酸內(nèi)切酶和鋅指核酸酶和轉(zhuǎn)錄激 活劑樣效應(yīng)物(TALE)核酸酶(Hockemeyer等人,2011 ;Mahfouz等人,2011 ;Miller等人, 2011)和歸巢核酸內(nèi)切酶。不同類(lèi)型和一類(lèi)中的不同成員在或接近它們切割的位點(diǎn)處顯示 不同水平的序列特異性。理論上,具有很高程度序列特異性的酶將在每個(gè)基因組的相對(duì)小 量的位點(diǎn)切割,可能僅有一個(gè)。這不是優(yōu)選的,因?yàn)槠湓试S通過(guò)目標(biāo)位點(diǎn)的突變或改變導(dǎo)致 的抗性的可能性。在特異序列重復(fù)很多次的情況下,從而盡管對(duì)于相對(duì)長(zhǎng)的識(shí)別序列有相 對(duì)高程度的特異性,在基因組中存在多個(gè)位點(diǎn),這是更可接受的。然而,我們偏愛(ài)核酸酶在 每個(gè)基因組具有多個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)。這意為識(shí)別對(duì)于名義上的目標(biāo)序列不完全特異性的,然而 以多個(gè)拷貝存在于基因組中的相對(duì)長(zhǎng)的序列或相對(duì)短的識(shí)別序列或目標(biāo)序列內(nèi)顯著程度 的冗余,或?qū)嵸|(zhì)上具有很小或根本無(wú)序列特異性的核酸酶。I-Ppol是這種類(lèi)型,具有長(zhǎng)的識(shí) 別序列,但是其在rDNA的高度保守區(qū)域內(nèi),其存在于每個(gè)基因組的多個(gè)拷貝中。I-Ppol另 外進(jìn)一步討論。
[0246] 已經(jīng)描述了鋅指核酸酶(ZFNs),其中各個(gè)鋅指提供對(duì)短核苷酸序列,例如3核苷 酸的序列-特異性結(jié)合。因此通過(guò)將多個(gè)此種鋅指組合在單個(gè)蛋白中可以提供更高的親和 力和更大的序列特異性。如果將這與核酸酶,例如限制性核酸內(nèi)切酶FokI的核酸酶結(jié)構(gòu)域 組合,人工的序列-特異性核酸酶可以被構(gòu)建,其具有任意的序列特異性(Kim等人,1996)。 此種合成的鋅指核酸酶已經(jīng)被開(kāi)發(fā)用于基因治療的目的,例如(Urnov等人,2005)。相當(dāng) 大的嘗試已經(jīng)轉(zhuǎn)向例如改善其特異性,以減少對(duì)基因組中單個(gè)位點(diǎn)的切割,(Miller等人, 2007)。在果蠅(Drosophila)的實(shí)例中,鋅指核酸酶當(dāng)在轉(zhuǎn)基因果蠅中表達(dá)時(shí)產(chǎn)生,特異損 害目標(biāo)位點(diǎn),例如yellow和之后還有rosy和bw位點(diǎn)(Beumer等人,2006 ;Bibikova等人, 2002)。觀察到不想要的副作用,其是使用的一些ZFN的高水平表達(dá)有毒性。進(jìn)一步顯示該 毒性依賴(lài)于核酸酶,而不是毒性ZFN的DNA結(jié)合活性(Beumer等人,2006)。盡管不是基因 靶向所需,該更廣泛的特異性對(duì)于我們?cè)谝恍┗蚝芏辔稽c(diǎn)產(chǎn)生損害的目的是有吸引力的。
[0247] 使用歸巢核酸內(nèi)切酶(HEGs)通常不是優(yōu)選的,因?yàn)樗鼈儍A向于識(shí)別相對(duì)長(zhǎng)的 (15_40bp,盡管常接受對(duì)普通目標(biāo)序列的一些錯(cuò)配)核苷酸序列,其因此在很多昆蟲(chóng)基因 組中即使真的有也很少發(fā)生??山邮茏R(shí)別/切割位點(diǎn)的最小數(shù)量是每個(gè)二倍體基因組一 個(gè);每個(gè)單倍體基因組一個(gè)是優(yōu)選的并且每個(gè)單倍體基因組識(shí)別/切割多個(gè)位點(diǎn)是特別優(yōu) 選的??赡懿贿m當(dāng)?shù)腍EG的實(shí)例是I-Scel。最初分離自酵母(釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))線(xiàn)粒體的I-Scel已經(jīng)作為允許或促進(jìn)靶向的同源重組的系統(tǒng)的部分用于果 蠅(Drosophila)(Gong和Golic,2003;Rong和Golic,2000 ;2001;Rong等人,2002)。對(duì)于 那個(gè)同源重組系統(tǒng)的I-Scel的一個(gè)有吸引力的特征恰恰是I-Scel不容易切割黑腹果蠅 (Drosophilamelanogaster)基因組中的任何內(nèi)源序列,并且將因此傾向于在轉(zhuǎn)基因上插 入物的設(shè)計(jì)的位點(diǎn)處特異切割。盡管一些其它昆蟲(chóng)基因組可以偶然具有一個(gè)以上被I-Scel 識(shí)別的位點(diǎn),該酶對(duì)于本發(fā)明中的使用通常不是優(yōu)選的。每個(gè)基因組切割多個(gè)位點(diǎn)的歸巢 核酸內(nèi)切酶的一個(gè)實(shí)例是Ppol。盡管它具有相當(dāng)特異的,長(zhǎng)識(shí)別位點(diǎn),其對(duì)應(yīng)于rDNA基因 中高度保守的序列。因?yàn)樵谒姓婧嘶蚪M中存在該rDNA基因的多個(gè)拷貝,多個(gè)目標(biāo)位點(diǎn) 可用。存在可能的借以'有抗性',即對(duì)Ppol-介導(dǎo)的切割有抗性的機(jī)制,比如基因轉(zhuǎn)變,此 種基因的突變可以通過(guò)rDNA序列散布,然而存在足夠拷貝的此種抗性基因組的風(fēng)險(xiǎn)(其 中這些位點(diǎn)全部或幾乎全部變得有抗性)似乎相當(dāng)?shù)偷牡男蛄?。已?jīng)顯示I-Scel和Ppol 在蚊子(R比亞按蚊(Anophelesgambiae))組織培養(yǎng)細(xì)胞中都行使功能(Windbichler等 人,2007);因?yàn)檠芯空呖梢灶A(yù)期Ppol的表達(dá)對(duì)細(xì)胞有害,導(dǎo)致細(xì)胞增殖停止,然而I-Scel 是相對(duì)無(wú)害的。歸巢核酸內(nèi)切酶一種類(lèi)型的自私DNA元件,其可以通過(guò)真菌群體(它們從 中被鑒定)擴(kuò)散。在動(dòng)物中無(wú)已知的歸巢核酸內(nèi)切酶,但是有人建議它們的異常性質(zhì)(切 割同源的不攜帶HEG的染色體并且通過(guò)細(xì)胞的DNA修復(fù)機(jī)制復(fù)制于其中(Burt和Trivers, 2006))可以用于構(gòu)建'基因驅(qū)動(dòng)'系統(tǒng)(Burt,2003);已經(jīng)使用I-Scel和人工目標(biāo)位點(diǎn)完 成了原理驗(yàn)證(Windbichler等人,2011)?;蝌?qū)動(dòng)系統(tǒng)是通過(guò)其中要擴(kuò)散的基因不賦予 簡(jiǎn)單的選擇優(yōu)勢(shì)的目標(biāo)群體例如野生群體擴(kuò)散基因的系統(tǒng)(例如Alphey等人,2002)。
[0248] 除了 '常規(guī)'使用HEG作為基因驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)(其類(lèi)似它們的天然擴(kuò)散系統(tǒng)并包括將 HEG復(fù)制入切割的DNA)外,有人還建議特異切割X染色體的位于Y染色體上的HEG可能產(chǎn) 生雄性,其中僅可成活配子是攜帶Y的(Deredec等人,2008)。
[0249] HEGs典型地識(shí)別15_40bp的目標(biāo)位點(diǎn)。ZFNs每個(gè)鋅指識(shí)別大致3bp。在典型的情 況中,ZFNs需要二聚化以切割DNA;這意為18bp的有效識(shí)別序列。特異的18nt序列將典 型地在418核苷酸(其是約7xl01(l核苷酸或7000Mb)中出現(xiàn)一次。為了比較,昆蟲(chóng)基因組典 型地是數(shù)百M(fèi)bp,并且人基因組為約3000Mbp,因此此種序列將典型地出現(xiàn)0-1次/基因組。 當(dāng)然這是簡(jiǎn)化的計(jì)算,并且忽略了GC含量,重復(fù)DNA等的影響,但是基本點(diǎn)仍然保持,即此 種長(zhǎng)識(shí)別序列的特異性對(duì)于需要特異性的目的,比如基因治療和基因靶向是所需的,但是 具有更短識(shí)別序列的分子對(duì)于兩次以上切割基因組的目的通常是優(yōu)選的。
[0250] 一個(gè)此種類(lèi)型的酶是限制性核酸內(nèi)切酶。這些典型地具有4-10bp的識(shí)別位點(diǎn), 其將典型地切割真核基因組很多次(41(1為大致lxlO6)。一些限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)底物DNA 的甲基化狀態(tài)敏感;對(duì)甲基化不敏感或切割以目標(biāo)基因組的原因特征修飾的DNA酶是優(yōu)選 的。例如,黑腹果蠅Orosophilamelanogaster)基因組DNA基本上是非甲基化的,因此酶 比如Dpnl(其僅切割腺甲基化的DNA)不是優(yōu)選的。相反,為了切割相同的序列(GATC),備 選酶比如DpnII,MboI或Sau3AI將是優(yōu)選的。對(duì)甲基化不敏感的和已知核酸酶結(jié)構(gòu)域在一 系列細(xì)胞類(lèi)型以及體外行使功能的FokI,是特別優(yōu)選的。
[0251] 核酸酶需要部具有任何實(shí)質(zhì)的序列特異性。核酸酶的其它優(yōu)選類(lèi)型是其中例如來(lái) 自FokI的核酸酶結(jié)構(gòu)域,與DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(所述DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有很少或不具有序列 特異性)組合的類(lèi)型(盡管對(duì)于一些類(lèi)型DNA相對(duì)于其它的一般偏好,例如對(duì)于富GC或富 AT區(qū)域或序列,是可接受的)。此種類(lèi)型效應(yīng)物的特別優(yōu)選的實(shí)例是魚(yú)精蛋白-核酸酶和 組蛋白-核酸酶融合。魚(yú)精蛋白-核酸酶融合的一些優(yōu)點(diǎn)在上文描述。兩種類(lèi)型的核酸酶 結(jié)構(gòu)域是可預(yù)見(jiàn)的。第一,需要結(jié)合至少一個(gè)其它蛋白(與其自身(同源二聚體)或與至 少一個(gè)不同蛋白(異源二聚體'二聚化';將理解對(duì)于形成更大復(fù)合體,例如三聚體,四 聚體等的需要包括在本項(xiàng)中)以切割DNA的類(lèi)型;第二,不需要這樣二聚化的類(lèi)型。
[0252] 這些兩種類(lèi)型之間的關(guān)鍵差異是它們的濃度/功能關(guān)系。不需要二聚化的酶將與 其濃度成比例而廣泛地行使功能。因此很低濃度將產(chǎn)生一些DNA損害或修飾;更高濃度將 產(chǎn)生更多。當(dāng)條件表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生相對(duì)少量的效應(yīng)物時(shí),這是有利的。精子自然發(fā)生的時(shí)間 過(guò)程可能產(chǎn)生效應(yīng)物至少一些小時(shí)以作用,并可能更長(zhǎng)。相反,的確需要二聚化的酶將典型 地具有非線(xiàn)性劑量反應(yīng)的功能。特別是對(duì)于可以在基因組中很多位點(diǎn)結(jié)合的酶,在低濃度 不可能兩個(gè)酶分子將以如此種能夠切割的方式接觸。在更高濃度,可能遠(yuǎn)超成比例的(典 型地對(duì)于同源二聚體以濃度的平方增加,對(duì)于同源三聚體以濃度的立方增加,等)。在例如, 所述條件表達(dá)系統(tǒng)有點(diǎn)滲漏,在除了在預(yù)期細(xì)胞中(例如除了在雄性生殖系,或作為其它 實(shí)例在其中預(yù)期的表達(dá)僅在精原細(xì)胞中或在精子自然發(fā)生的后期階段的雄性生殖系細(xì)胞 中之外)之外的至少一些細(xì)胞中產(chǎn)生低、非零水平的效應(yīng)物的情況下,這可以是有利的。然 后該低'基本'表達(dá)應(yīng)該相對(duì)無(wú)害,或至少在非目標(biāo)細(xì)胞中在其活性方面相對(duì)其在目標(biāo)中的 活性顯示超過(guò)線(xiàn)性的不同。
[0253] 其它相關(guān)類(lèi)型的滲漏活性涉及條件表達(dá)系統(tǒng)的條件性-不可能應(yīng)該是'關(guān)'的條 件將事實(shí)上產(chǎn)生零表達(dá),因此擴(kuò)大'開(kāi)'和'關(guān)'狀態(tài)的表型差異的另外的系統(tǒng),比如該系統(tǒng) 是所需的。注意,這些放大和可能的好處應(yīng)用于其它類(lèi)型的效應(yīng)物。在核酸酶效應(yīng)物內(nèi),它 們應(yīng)用于鋅指核酸酶以及應(yīng)用于魚(yú)精蛋白-核酸酶等。尤其,F(xiàn)okI核酸酶結(jié)構(gòu)域需要二聚 化以切割DNA。通常這通過(guò)同源二聚化。然而,已知改變這點(diǎn)的變體。所述兩種核酸酶結(jié)構(gòu) 域可以包括在相同蛋白中,通過(guò)合適接頭連接,從而不需要二聚化(即分子內(nèi),而不是分子 間的二聚化足以)。同樣,已知FokI的突變體,其中需要異源二聚化(Miller等人,2007)。 注意,不需要兩個(gè)二聚化結(jié)構(gòu)域中的每個(gè)都具有核酸酶活性。這允許獲得更好特異性的其 它方法。需要異源二聚化的兩個(gè)(或更多)蛋白可以在分開(kāi)的控制(例如轉(zhuǎn)錄控制,而且還 有例如翻譯或降解控制)下表達(dá)。僅兩種結(jié)構(gòu)域都表達(dá)的細(xì)胞將具有顯著活性。因此,也 不容許其它蛋白的滲漏表達(dá)的細(xì)胞中一個(gè)蛋白的滲漏表達(dá)將具有很少的或不具有負(fù)作用。 實(shí)施例
[0254] 實(shí)施例1 :生殖系特異的啟動(dòng)子
[0255] 為了測(cè)試分離的啟動(dòng)子區(qū)域的適用性,熒光蛋白可以用作報(bào)道分子,并且特別是 四環(huán)素響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄激活劑(tTA)和熒光蛋白間的融合。這允許既允許蛋白表達(dá)的直接可視 化,而且還允許進(jìn)一步測(cè)試由為了以在精子自然發(fā)生中行使功能的條件二元表達(dá)系統(tǒng)的部 分使用的特定目的的候選的合適啟動(dòng)子片段引導(dǎo)的表達(dá)的時(shí)機(jī)和水平的適用性。來(lái)自此插 入物的報(bào)道分子的表達(dá)說(shuō)明候選的合適啟動(dòng)子片段的活性。評(píng)估一些此種插入品系允許確 定啟動(dòng)子片段可能的適用性。由于'位置效應(yīng)',一些插入品系應(yīng)該被檢測(cè);插入基因表達(dá)憑 借的公知的現(xiàn)象是受其插入的染色質(zhì)環(huán)境影響(Wilson等人,1990)。
[0256] 如上測(cè)試所述候選的合適啟動(dòng)子片段在雄性生殖系作為可以條件表達(dá)系統(tǒng)的部 分行使功能的實(shí)際能力,但是包括例如編碼tTA或相關(guān)序列合適的表達(dá)系統(tǒng),或其相關(guān)組 分。在上文的報(bào)道分子測(cè)試中使用tTA-熒光蛋白(tTA-FP)融合允許使用用于兩種測(cè)試 的相同的插入品系,或插入品系組。容許從所述表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的條件下橫跨合適的品系, 例如tRE-X(其中X可以是效應(yīng)物或報(bào)道分子),將允許確定所述表達(dá)系統(tǒng)(啟動(dòng)子-tTA, tRE-X)在精子自然發(fā)生中是否行使功能和,例如通過(guò)對(duì)解剖的精巢的熒光顯微,確定X和/ 或tTA-FP在哪表達(dá)、何時(shí)表達(dá)和表達(dá)多少。抑制表達(dá)條件下的類(lèi)似實(shí)驗(yàn)將允許確定表達(dá)系 統(tǒng)是否是條件的。
[0257] 如果表達(dá)研究表明,候選的合適啟動(dòng)子片段事實(shí)上不合適,研究者可以采用來(lái)自 相同基因的不同啟動(dòng)子片段。此種改變的片段典型更長(zhǎng),因?yàn)樵慰梢员粍h除一些重要 的調(diào)控元件,然而在表達(dá)是特異的但在發(fā)育中太晚(例如減數(shù)分裂后)的情況下,即使啟動(dòng) 子片段源自的基因被認(rèn)為(例如基于RNA原位數(shù)據(jù))足夠早期被轉(zhuǎn)錄,刪除一些元件,尤其 是UTR元件,以去除翻譯延遲信號(hào)可以是所需的。測(cè)試更長(zhǎng)或更短的片段以鑒定對(duì)基因表 達(dá)水平和暫時(shí)的和組織特異性是必要的或影響基因表達(dá)水平和暫時(shí)的和組織特異性的啟 動(dòng)子區(qū)域也可以是所需的;該方法已經(jīng)被廣泛用于分析啟動(dòng)子并且可以簡(jiǎn)單地用原候選啟 動(dòng)子片段的變體通過(guò)重復(fù)上述過(guò)程實(shí)現(xiàn)。
[0258] RNA原位雜交實(shí)驗(yàn)表明地中海果蠅(Medfly) 0 2-微管蛋白轉(zhuǎn)錄在地中海果蠅 (Medfly)精子自然發(fā)生的早期至晚期階段。假設(shè)地中海果蠅(Medfly) 0 2-微管蛋白轉(zhuǎn)錄 本與Dm3 2-微管蛋白類(lèi)似的階段起始,其在減數(shù)分裂前并且從晚第三齡幼蟲(chóng)期合成,之前 在發(fā)育的精巢中存在顯著減數(shù)分裂。已經(jīng)開(kāi)發(fā)使用該基因啟動(dòng)子的精子標(biāo)記系統(tǒng)用于蚊 子史氏按蚊(Anophelesstephensi) (Catteruccia,Benton等人 2005)和埃及伊蚊(Ae. Aegypti) (Smith,Walter等人2007),在我們針對(duì)精子致死性的研究時(shí)期過(guò)程中用于地中 海果蠅(Medfly) (Scolari,Schetelig等人2008)和之后用于加勒比果蠅,加勒比按實(shí)蠅 (Anastrephasuspensa) (Zimowska,Nirmala等人,2009)。據(jù)此,我們使用以下引物從地中 海果蠅(Medfly)基因組擴(kuò)增了 0 2-微管蛋白啟動(dòng)子:
[0259] 正向:CTCCCGTGCGATATCCTAGGCCCCATGTTACAAGGCTG(SEQIDN0 :53)
[0260] 反向:
[0261] AGCCATTTTGGTTAATTGAAATCCCTAAAATAAATGTAATTCATTTTTCG(SEQIDNO:54)
[0262] 構(gòu)建體0X3671 (圖16)含有融合于DsRed2序列的地中海果蠅(Medfly) @ 2-微 管蛋白啟動(dòng)子(1556bp啟動(dòng)子片段擴(kuò)增自地中海果蠅(Medfly)基因組DNA)。大多數(shù) Cc3 2-微管蛋白3'-UTR序列被刪除或由通常使用的3' -UTR-SV40(已知在多個(gè)物種中表 達(dá))替代。表達(dá)轉(zhuǎn)基因應(yīng)該導(dǎo)致在適當(dāng)激發(fā)濾光片下精子發(fā)紅色熒光。DsRed2表達(dá)在獲得 的所有三個(gè)品系中的轉(zhuǎn)基因雄性腹部是明顯可見(jiàn)的,其中兩個(gè)區(qū)域具有更強(qiáng)的熒光,看似 精巢(數(shù)據(jù)未顯示)。
[0263] 為了進(jìn)一步評(píng)估DsRed2標(biāo)記在精子中是否表達(dá),解剖性成熟轉(zhuǎn)化的雄性的精巢。 結(jié)果表明,與來(lái)自野生型雄性的精子相比,成熟精子呈現(xiàn)強(qiáng)烈的DsRed2表達(dá)。在與B2-微 管蛋白表達(dá)模式的比對(duì)中,早期精母細(xì)胞不呈現(xiàn)熒光,其在精子自然發(fā)生的精細(xì)胞階段開(kāi) 始明顯可見(jiàn)。
[0264] 為了測(cè)試使用二元"tet-關(guān)系統(tǒng)"我們是否會(huì)獲得類(lèi)似的熒光表達(dá)模式,建立兩個(gè) 熒光報(bào)道分子構(gòu)建體;〇X3866(圖14) (tet〇-微型啟動(dòng)子-DsRed2-mls)和0X3867(圖15) (與DsRed2融合的tet〇-微型啟動(dòng)子-魚(yú)精蛋白)。tet〇-微型啟動(dòng)子元件公認(rèn)為tRE并 且是優(yōu)選的。在〇X3866(圖14)中,DsRed2報(bào)道分子融合于膜定位信號(hào)(mls),預(yù)測(cè)其導(dǎo)致 表達(dá)后任何表達(dá)的熒光蛋白為膜結(jié)合或相關(guān)的,然而在0X3867 (圖15)中,DsRed2融合于 果蠅(Drosophila)魚(yú)精蛋白。以驅(qū)動(dòng)體細(xì)胞中tTAV表達(dá)的啟動(dòng)子測(cè)試兩種報(bào)道分子基因 并且發(fā)現(xiàn)是有功能的。
[0265] 按照P2-微管蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)精子中DsRed2表達(dá)的研究結(jié)果,盡管對(duì)于我們的 目的來(lái)說(shuō)太晚,以驅(qū)動(dòng)tTAV-熒光融合基因的地中海果蠅(Medfly) 0 2-微管蛋白啟動(dòng)子設(shè) 計(jì)構(gòu)建體0X3831 (圖20)并從0X3671 (圖16)修飾。在該構(gòu)建體中,在tTAV蛋白將隨后在精 子自然發(fā)生過(guò)程中更早期表達(dá)的推測(cè)下,果蠅(Dr〇S〇phila)aly5'UTR區(qū)域替代了 02-微 管蛋白啟動(dòng)子的5'UTR區(qū)域。因?yàn)門(mén)urboGFP序列與tTAV融合,0X3831 (圖20)轉(zhuǎn)基因雄 性的精子應(yīng)該在適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)濾光片下呈現(xiàn)綠色熒光。為了測(cè)試這點(diǎn),解剖來(lái)自七個(gè)轉(zhuǎn)基因 品系的成體雄性并在熒光顯微鏡下觀察。盡管熒光表達(dá)在未解剖的雄性的精巢中不容易看 至IJ,但在解剖的0X3831 (圖20)成體雄性的精巢中,熒光表達(dá)在精細(xì)胞束中可見(jiàn)。一些品系 比其它品系表達(dá)更強(qiáng)熒光,但是0X3831 (圖20)株中的所有精細(xì)胞呈現(xiàn)熒光精巢-特異的 精子標(biāo)記表達(dá)。
[0266] 0X3831-雜合蠅與 0X3866-和 0X3867-雜合蠅(分別為圖 14 和 15) (tet〇-DsRed2 株)雜交。將多于20只以無(wú)四環(huán)素食物飼養(yǎng)的(即tet〇-DSRed2表達(dá)的容許條件),以不 同雜交和在不同時(shí)間的成體雄性后代解剖并在高倍熒光顯微鏡下觀察。僅一個(gè)雄性顯示強(qiáng) 烈的DsRed2表達(dá),其在一些精細(xì)胞束中可見(jiàn)。在其它雄性中,在任何精細(xì)胞束中都未檢測(cè) 到DsRed2表達(dá)。僅一個(gè)雄性呈現(xiàn)強(qiáng)烈的DsRed2表達(dá)的可能原因是由Cc3 2-微管蛋白啟動(dòng) 子驅(qū)動(dòng)的tTAV-熒光的后期轉(zhuǎn)錄和翻譯。該后期表達(dá)可以意為對(duì)于tTAV有足夠的時(shí)間以 結(jié)合tetO序列和在減數(shù)分裂前進(jìn)一步誘導(dǎo)足夠的DsRed2轉(zhuǎn)錄本。根據(jù)我們的結(jié)果,僅是 偶然,一些雄性中的精母細(xì)胞中的一些具有足夠的在減數(shù)分裂前積累的DsRed2轉(zhuǎn)錄本并 且DsRed2熒光可以在精細(xì)胞束中被檢測(cè)。使用tTAV特異引物對(duì)0X3831 (圖20)雄性的分 離的精巢和尸體的反轉(zhuǎn)錄酶PCR分析,表明5'UTR-alyCcP2-微管蛋白啟動(dòng)子的精巢-特 異性。
[0267] 在這個(gè)階段,顯然tTAV的甚至更早表達(dá)是必要的以允許在雄性生殖系中足夠表 達(dá)報(bào)道分子基因。為此,我們開(kāi)發(fā)和測(cè)試了構(gòu)建體0X4282,其含有Hsp83基因的5'UTR。 Hsp83在地中海果蠅地中海實(shí)蠅(地中海果蠅(Ceratitiscapitata))的生殖系和體細(xì) 胞中都強(qiáng)烈表達(dá)并且不認(rèn)為包含任何延遲翻譯信號(hào)。在構(gòu)建體0X4282中,報(bào)道分子基因; TurboGFP,不融合于tTAV序列,但是與tetO序列相鄰設(shè)置。此外,在嘗試中將tetO-報(bào)道 分子和啟動(dòng)子-tTAV組分組合于單個(gè)質(zhì)粒中從而以更直接的方式評(píng)估Hsp83 5'UTR。tTAV 應(yīng)該被表達(dá)在轉(zhuǎn)化個(gè)體的雄性生殖系中并且,在缺失四環(huán)素的情況下,通過(guò)結(jié)合tetO應(yīng)該 誘導(dǎo)相鄰TurboGFP標(biāo)記基因的表達(dá)。換句話(huà)說(shuō),當(dāng)關(guān)四環(huán)素飼養(yǎng)時(shí),攜帶該構(gòu)建體的那些 株的雄性精巢應(yīng)該顯示TurboGFP表達(dá),并且表達(dá)應(yīng)該被四環(huán)素抑制。精巢解剖在缺少四環(huán) 素的情況下飼養(yǎng)的成體雄性,揭示6個(gè)測(cè)試的品系的三個(gè)中存在強(qiáng)烈的綠色(turboGFP)熒 光。
[0268] 在其它品系中未觀察到TurboGFP表達(dá)的事實(shí)可能由于轉(zhuǎn)基因插入物的位置效 應(yīng)。在呈現(xiàn)TurboGFP熒光關(guān)四環(huán)素的品系中,表達(dá)由四環(huán)素完全抑制(數(shù)據(jù)未顯示)。
[0269] 將0X4282雄性與0X3867 (tetO-魚(yú)精蛋白-DsRed2)(圖15)雌性在各籠中雜 交以進(jìn)一步檢測(cè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)報(bào)道分子基因足夠表達(dá)的能力;在此種情況下DsRed2使用 "tet-關(guān)"二元條件系統(tǒng)。
[0270] 可以在精子自然發(fā)生的不同階段(在延長(zhǎng)的精細(xì)胞和精母細(xì)胞二者中)檢測(cè) TurboGFP表達(dá),盡管紅色熒光僅在延長(zhǎng)的精細(xì)胞但是未在早期精母細(xì)胞中檢測(cè)到(圖3)。 在精細(xì)胞的精子頭(核定位處)和尾都檢測(cè)TurboGFP表達(dá)。
[0271] 上述結(jié)果表明,與tTAV表達(dá)相比,存在報(bào)道分子基因(本實(shí)驗(yàn)中為DsRed2)表達(dá) 的稍微延遲;因?yàn)檫@由觀察到的綠色熒光的量估計(jì)??紤]到紅色熒光在精子自然發(fā)生的后 期(延長(zhǎng)的精細(xì)胞)明顯,可能報(bào)道分子在減數(shù)分裂前轉(zhuǎn)錄但是在減數(shù)分裂后翻譯。
[0272] Dmtopi是精巢-特異的基因,其編碼生理上與Comr相互作用的精巢-特異的鋅 指蛋白(Perezgasga,Jiang等人2004)。Dmtopi對(duì)于Aly或Comr的核定位不是所需的,但 對(duì)于其在染色質(zhì)上的積累是所需的。在果蠅Orosophila)中,盡管對(duì)于表達(dá)依賴(lài)于aly或 comr的所有基因也依賴(lài)于achi/vis和/或topi,但存在一些基因,其轉(zhuǎn)錄依賴(lài)于achi/vis 和topi,但是不依賴(lài)于aly或comr(Perezgasga,Jiang等人2004)??赡芨@著的是,很多 aly-類(lèi)型基因似乎產(chǎn)生自基因復(fù)制。復(fù)制之后,一對(duì)中的一個(gè)承擔(dān)體作用并且另一個(gè)承擔(dān) 生殖系作用。就使用這些基因作為寬范圍的昆蟲(chóng)中雄性生殖系啟動(dòng)子的來(lái)源而言,這具有 兩個(gè)限制。
[0273] 第一,所述兩個(gè)基因可以非常類(lèi)似,使得相對(duì)難以鑒定生殖系-特異的版本。第 二,和更加顯著的是,很多這些復(fù)制似乎都非常近期。多數(shù)昆蟲(chóng)可以因此具有祖先版本(其 是既執(zhí)行生殖系功能也執(zhí)行體功能的單個(gè)基因),并且因此無(wú)分開(kāi)的生殖系基因和啟動(dòng)子。 topi在這方面是不尋常的,因?yàn)樗痪哂忻黠@的體替代物,并且它還似乎比aly-類(lèi)型復(fù)制 中的大多數(shù)更古老。因此可能比其它aly-類(lèi)型基因在更寬范圍的昆蟲(chóng)中提供可能的生殖 系-特異的啟動(dòng)子。對(duì)這點(diǎn)的一個(gè)注意事項(xiàng)是,topi序列保守性是明確的,但是功能保守 型,和尤其是topi在其它昆蟲(chóng)中的表達(dá)模式,通常未知。然而,該保留意見(jiàn)也適用于其它雄 性-生殖系基因。由于這些不同原因,選擇topi用于雄性-生殖系啟動(dòng)子來(lái)源的進(jìn)一步研 究。
[0274] 在地中海果蠅(Medfly)中開(kāi)發(fā)基于topi的構(gòu)建體之前,首先在蚊子埃及伊蚊 (Ae.Aegypti)中測(cè)試topi的表達(dá)模式的保守性;基因組序列的可用性意為topi同源物和 推定的啟動(dòng)子片段可以快速被分離。RISH(RNA原位雜交)結(jié)果顯示埃及伊蚊(Ae.Aegypti) topi(Aetopt)基因轉(zhuǎn)錄從初級(jí)精母細(xì)胞階段開(kāi)始;表達(dá)譜類(lèi)似果蠅(Drosophila)精巢中 Dmtopi的表達(dá)譜(Perezgasga,Jiang等人2004)。開(kāi)發(fā)了埃及伊蚊(Ae.Aegypti)轉(zhuǎn)基因 株(0X4286,圖23),具有由1233-bp序列(包括1168bp的Aetopi啟動(dòng)子和65bpAetopi 5'-UTR)驅(qū)動(dòng)的tTA表達(dá)。將3個(gè)獨(dú)立的0X4286 (圖23)系與tet〇-報(bào)道分子株(0X3978, tet0AehSp70微型啟動(dòng)子-Amcyan,圖24)雜交后,在以無(wú)TET飲食飼養(yǎng)的全部三個(gè)雜交 中的精巢和精子自然發(fā)生細(xì)胞中都看到明顯的Amcyan表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。表達(dá)是四環(huán) 素-可抑制的。
[0275] 在顯示埃及伊蚊(Ae.Aegypti)topi啟動(dòng)子誘導(dǎo)tTAV的精巢-特異表達(dá)和后續(xù)的 報(bào)道分子基因的表達(dá)之后,分析地中海實(shí)蠅(地中海果蠅(Ceratitiscapitata))topi的 表達(dá)模式。在地中海果蠅(Medfly)中使用該基因核苷酸序列,設(shè)計(jì)因無(wú)以驗(yàn)證Cctopi在 地中海果蠅(Medfly)中是精巢-特異的基因。將解剖自十只野生型雄性的十對(duì)精巢用于 提取RNA(解剖詳情見(jiàn)2. 6. 4. 3部分)。從生育的尸體提取RNA以提供非精巢對(duì)照。使用引 物TopitestFl' :和'TopitestR'的反轉(zhuǎn)錄酶分析用于這些PCR。結(jié)果確認(rèn)Cctopi表達(dá)是 精巢-特異的。RISH也證明Cctopi在地中海果蠅(Medfly)精巢中轉(zhuǎn)錄(數(shù)據(jù)未顯示)。 因此選擇此基因啟動(dòng)子在用于開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)基因株中精巢-特異表達(dá)的新構(gòu)建體中使用。
[0276] TopitestFl引物:GTAACTCCCGTTCCTGAGACAACA(SEQIDN0 :55)
[0277] TopitestR引物:CGATATGGAGTGGGTGAAACCTCA(SEQIDNO:56)
[0278] 構(gòu)建體0X4275 (圖25)包含來(lái)自Cctopi的驅(qū)動(dòng)DsRed2的推定啟動(dòng)子片段 (1178bp) (SV403'UTR)。來(lái)自以該構(gòu)建體獲得的所有株的成體雄性的解剖的精巢不顯露 DsRed2表達(dá)的任何信號(hào)(數(shù)據(jù)未顯示)。為了進(jìn)一步測(cè)試Cctopi啟動(dòng)子,開(kāi)發(fā)了具有相 同啟動(dòng)子序列的驅(qū)動(dòng)tTAV表達(dá)的構(gòu)建體(0X4254,圖26)。將0X4254-雜合蠅與異性的 0X3867(tet0-DsRed2)(圖15)雜合蠅(tet〇-DsRed2株)雜交并且將這些雜交的成體雄性 后代解剖并評(píng)估紅色熒光。在那些雄性精巢的任何精細(xì)胞束中都未檢測(cè)到DsRed2表達(dá)。
[0279] 因?yàn)?X4275 (圖25)和0X4254 (圖26)中推定的Cctopi啟動(dòng)子的長(zhǎng)度短可以導(dǎo) 致顯見(jiàn)功能的缺失,基于以下改進(jìn)制備了新構(gòu)建體-0X4371 (圖27)。該構(gòu)建體含有來(lái)自推 定的Cctopi編碼區(qū)域的1708-bp序列,比之前的包括484bp可能的編碼序列和編碼區(qū)域 的保留的部分的55bp內(nèi)含子的構(gòu)建體多出超過(guò)530bp。因?yàn)樵谄銷(xiāo)末端與其它蛋白融合 后tTAV通常不彳丁使功能,在Cctopi編碼區(qū)域和tTAV之間使用228bp泛素基因序列(基于 果蠅(Drosophila)泛素的但是優(yōu)化用于在一系列昆蟲(chóng)表達(dá)的序列,由GeneartLtd合成) 以在翻譯后通過(guò)泛素蛋白酶的切割分開(kāi)兩個(gè)基因產(chǎn)物(Varshavsky2005)。該構(gòu)建體既含 有新設(shè)計(jì)的驅(qū)動(dòng)tTAV的Cctopi啟動(dòng)子也還有tet〇-Dmhsp70微型啟動(dòng)子-TurboGFP報(bào)道 分子。因此,應(yīng)該通過(guò)在其幼蟲(chóng)飲食中無(wú)四環(huán)素的情況下飼養(yǎng)的雄性的精巢中的熒光檢測(cè) tTAV的表達(dá)。在來(lái)自?xún)蓚€(gè)測(cè)試的品系中的一個(gè)中關(guān)四環(huán)素飼養(yǎng)的0X4371 (圖27)雄性成體 的解剖的精巢中檢測(cè)到精子自然發(fā)生細(xì)胞中的弱TurboGFP表達(dá)。在開(kāi)四環(huán)素條件下飼養(yǎng) 的任何雄性的解剖的精巢中未檢測(cè)到TurboGFP表達(dá),表明可抑制的表達(dá)。
[0280] 產(chǎn)生和分析以0X4371 (圖27),0X4391 (圖22)株操作的并發(fā)事件。
[0281] 0X4391 (圖 22)在一個(gè)方面不同于 0X4371 (圖 27) :0X4371(圖 27)中的tTAV的 SV40 3'UTR由0X4391中的Cctopi內(nèi)源3'UTR替代(圖22)。如之前提到的,3'-UTR可以 影響特定mRNA的命運(yùn),例如轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性或翻譯水平(Mazumder,Seshadri等人2003)???慮到已經(jīng)顯示3'UTR在mRNA加工中發(fā)揮重要作用,我們假想來(lái)自Cctopi的內(nèi)源3'UTR可 以將基因的所需的表達(dá)模式賦予我們的tTAV轉(zhuǎn)基因。使用反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增Cctopi3' -UTR。 將來(lái)自6個(gè)0X4391 (圖22)株的在關(guān)四環(huán)素下飼養(yǎng)的2-3日齡的雄性成體的精巢解剖。3 株顯示在雄性生殖系細(xì)胞中強(qiáng)烈的TurboGFP表達(dá)。在其它三株中檢測(cè)到弱熒光。
[0282] 為了進(jìn)一步測(cè)試新設(shè)計(jì)的topi啟動(dòng)子序列,我們將0X4391(圖22)雄性(以無(wú)四 環(huán)素飲食飼養(yǎng))與野生型雌性雜交并且評(píng)估解剖的納精囊中熒光的存在。在熒光顯微鏡下 檢查儲(chǔ)存在納精囊中的精子證明TurboGFP實(shí)際上是可檢測(cè)的。
[0283] 上述結(jié)果表明我們的分離的topi啟動(dòng)子序列(如上文描述的)在雄性生殖系中 表達(dá)并且足夠驅(qū)動(dòng)精巢中tetO報(bào)道分子基因的表達(dá)。與包含tet〇-核酸酶轉(zhuǎn)基因的蠅的 雜受在之后討論。
[0284] 實(shí)施例2效應(yīng)物蛋白
[0285] 本工作的目的是產(chǎn)生轉(zhuǎn)移至雌性的精子并且將導(dǎo)致低的或?qū)嵸|(zhì)上無(wú)胚胎(否則 雌性會(huì)產(chǎn)生的)存活。相同的精子應(yīng)該誘導(dǎo)足夠的對(duì)雌性中再交配的不應(yīng)態(tài),同時(shí)如果雌 性的確再交配將在精子競(jìng)爭(zhēng)方面表現(xiàn)良好。對(duì)此,我們的方法是構(gòu)建父本效應(yīng)致死,借此, 精子可以進(jìn)入卵,但是無(wú)可成活受精卵(能夠發(fā)育為可育成體)形成。理想地,該效果由具 有單拷貝父本效應(yīng)致死的雄性產(chǎn)生,盡管多拷貝的使用也是可預(yù)見(jiàn)的。還優(yōu)選效應(yīng)物對(duì)精 子具有直接的生物化學(xué)效果,而不是僅使用精子作為進(jìn)入卵(并隨后在那里具有效果)所 通過(guò)的載體。這是由于對(duì)可能的抗性的考慮。核酸酶是對(duì)于本發(fā)明的目的的優(yōu)選的選擇。 理論上,如果由精子攜帶的遺傳信息被損害至一些或(優(yōu)選)基本上全部受精卵不可成活 的程度,那么這形成形成通過(guò)父本效應(yīng)致死性的不育的合適形式的基礎(chǔ)。在嘗試中已經(jīng)探 索不同類(lèi)型的核酸酶誘導(dǎo)精子特異的損害。作為"tet-關(guān)"二元條件系統(tǒng)的部分測(cè)試所有 核酸酶;其連接于tetO序列。該方式允許與不同生殖系特異的啟動(dòng)子序列組合評(píng)估各種效 應(yīng)物蛋白,而無(wú)產(chǎn)生新轉(zhuǎn)化子株的負(fù)擔(dān)。此外,其就未來(lái)應(yīng)用而言提供更現(xiàn)實(shí)的狀況。
[0286] 已經(jīng)描述了鋅指核酸酶(ZFNs),其中各個(gè)鋅指提供對(duì)短核苷酸序列,例如3個(gè)核 苷酸的序列-特異的結(jié)合??梢酝ㄟ^(guò)將多個(gè)此種鋅指組合于單個(gè)蛋白提供更高的親和力和 更好的序列特異性。如果將這與核酸酶,例如限制性核酸內(nèi)切酶FokI的核酸酶結(jié)構(gòu)域組 合,可以以任意的序列特異性構(gòu)建人工序列-特異的核酸酶。我們已經(jīng)通過(guò)將這些品系與 不同雄性生殖系特異的啟動(dòng)子雜交測(cè)試ZFNs可以在延長(zhǎng)的精細(xì)胞中產(chǎn)生DNA破壞的假想。 設(shè)計(jì)和測(cè)試了兩個(gè)(0X4103)(圖18)和三個(gè)(0X4104,圖19)鋅指核酸酶構(gòu)建體。之前的通 過(guò)與在體組織中表達(dá)的啟動(dòng)子-tTAV品系雜交的評(píng)估,表明3-鋅指核酸酶呈現(xiàn)更好的"致 死"效果并且因此將這些品系中最強(qiáng)的用于本工作的目的。該核酸酶因此是優(yōu)選的。
[0287] 歸巢核酸內(nèi)切酶是典型地由內(nèi)含子編碼的一種類(lèi)型的限制性?xún)?nèi)切酶的。它們作用 于合成它們的細(xì)胞的細(xì)胞DNA并且它們傾向于識(shí)別相對(duì)長(zhǎng)的(15_40bp,盡管經(jīng)常接受對(duì)正 常目標(biāo)序列的一些錯(cuò)配)核苷酸序列,其因此在任何給定昆蟲(chóng)基因組中就算真的有也很少 發(fā)生??山邮茏R(shí)別/切割位點(diǎn)的最小數(shù)量是每二倍體基因組一個(gè);每單倍體基因組一個(gè)是 優(yōu)選的并且每個(gè)單倍體基因組識(shí)別/切割多個(gè)位點(diǎn)是特別優(yōu)選的。每基因組切割多個(gè)位 點(diǎn)的歸巢核酸內(nèi)切酶的一個(gè)實(shí)例是Ippol。盡管這具有相當(dāng)特異的,長(zhǎng)識(shí)別位點(diǎn),其對(duì)應(yīng)于 rDNA基因中的高度保守序列。因?yàn)樵搑DNA基因的多個(gè)拷貝存在于所有真核基因組中,多個(gè) 目標(biāo)位點(diǎn)是可用的。設(shè)計(jì)和測(cè)試了tet0-IPP01(0X4112,圖17)構(gòu)建體。
[0288] 限制性核酸內(nèi)切酶具有4-10bp的識(shí)別位點(diǎn),其將典型地切割真核基因組很多次。 此種核酸酶不具有實(shí)質(zhì)的序列特異性。FokI(其對(duì)甲基化不敏感并且對(duì)于其,已知核酸酶結(jié) 構(gòu)域在在一系列細(xì)胞類(lèi)型中以及體外行使功能)對(duì)于我們的目的是特別優(yōu)選的。與具有很 少或無(wú)序列特異性的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域組合的FokI核酸酶結(jié)構(gòu)域是特別感興趣的。類(lèi)型效 應(yīng)物的優(yōu)選的實(shí)例是魚(yú)精蛋白-核酸酶融合。魚(yú)精蛋白-核酸酶融合的優(yōu)點(diǎn)是需要與其自 身(同源二聚體)或與至少一種不同蛋白(異源二聚體)二聚化(或多聚化)以切割DNA。 的確需要二聚化的酶將典型地具有非線(xiàn)性劑量響應(yīng)的功能。特別是對(duì)于可以結(jié)合在基因組 中很多位點(diǎn)的酶,在低濃度可能兩個(gè)酶分子將以此種能夠被切割的方式相遇。條件表達(dá)系 統(tǒng)滲漏-通過(guò)啟動(dòng)子或通過(guò)條件系統(tǒng)自身之一,除了在預(yù)期的細(xì)胞(例如除了在雄性生殖 系中之外)之外在至少一些細(xì)胞產(chǎn)生低的,非零水平的效應(yīng)物,可以是有利的。已經(jīng)設(shè)計(jì)和 測(cè)試了tetO-魚(yú)精蛋白-FokI構(gòu)建體(0X4458,圖21)。
[0289] 在之前提到的二元系統(tǒng)中評(píng)估雄性不育被稱(chēng)為"卵孵化率測(cè)定或?qū)嶒?yàn)"。設(shè)計(jì)的圖 示在圖1中說(shuō)明。啟動(dòng)子品系驅(qū)動(dòng)雄性生殖系中tTAV的表達(dá),優(yōu)選在別處具有很少或無(wú)表 達(dá),同時(shí)效應(yīng)物品系連結(jié)于tetO序列,其表達(dá)與tTAV相關(guān),_者是時(shí)間和空間上的。啟動(dòng) 子和效應(yīng)物品系中的轉(zhuǎn)化標(biāo)記使用不同熒光基因用于精確評(píng)估結(jié)果,即在適當(dāng)激發(fā)濾光片 下啟動(dòng)子品系發(fā)綠色熒光,同時(shí)效應(yīng)物系發(fā)紅色熒光。效應(yīng)物(E)和啟動(dòng)子(P)品系在無(wú) 四環(huán)素,即容許(表達(dá))條件下雜交。收集來(lái)自這些雜交的卵并分為容許條件(無(wú)四環(huán)素) 或抑制條件(有四環(huán)素)并從而飼養(yǎng)。對(duì)于品系特異的熒光標(biāo)記的表達(dá)篩選蛹并且收集雙 雜合子-兩種標(biāo)記都具有。Ecclosion之后將這些對(duì)核實(shí)相等的雄雌比和雄性與野生型雌 性雜交-同樣開(kāi)或關(guān)tet。雙雜合子雌性與野生型雄性雜交用于測(cè)試任何觀察到的效果是 否是性別特異的。野生型控制被包括為卵孵化率的參考點(diǎn)。收集和計(jì)數(shù)來(lái)自雜交的卵。三 天后重復(fù)計(jì)數(shù)并且評(píng)估未孵化卵的數(shù)量。
[0290] 圖1.:卵孵化率測(cè)定的設(shè)計(jì)。
[0291] 許多這些雜交的結(jié)果在下文顯示。這里提供的所有雜交遵循上文描述的基本設(shè) 計(jì)。
[0292] 0X4282 (PB-HrIE-AmCyan-SV40-TurboGFP-tetol4-cc微管蛋 白-hsp83-tTAV-SV40)x0X4104(PB-YAFN-hsp83-tet021-Hr5-IEl-Red)(圖 19)
[0293] 圖2.開(kāi)和關(guān)四環(huán)素下0X4282-0X4104雄性不育。將三個(gè)獨(dú)立的,攜帶由來(lái)自地中 海實(shí)蠅(地中海果蠅(Ceratitiscapitata))基因(I,L,G)的0 2-微管蛋白啟動(dòng)子的四 環(huán)素可抑制反式激活子(tTAV)的0X4282轉(zhuǎn)座子的常染色體插入品系與攜帶tetO-3鋅指 效應(yīng)物的品系0X4014。以有(100iig/ml;tet+)或無(wú)四環(huán)素(tet_)的飲食飼養(yǎng)和繁殖這 些雜交的后代。將攜帶驅(qū)動(dòng)物和效應(yīng)物等位基因二者的雄性與野生型雌性雜交并且計(jì)算獲 自這些雜交的卵的孵化率(孵化的產(chǎn)的卵的百分?jǐn)?shù))。對(duì)于每個(gè)雜交使用每組100-150個(gè) 卵的兩組不同的卵收集物。使用在存在或缺少四環(huán)素的情況下與野生型雌性雜交的野生型 雄性作為對(duì)照。觀察到高度顯著雄性不育的雜交(卡方檢驗(yàn),*表示P< 〇. 01,**表示P < 0. 001)用星號(hào)標(biāo)記。
[0294] 將三株0X4282品系與之前當(dāng)與兩個(gè)遺傳啟動(dòng)子(Hsp83和0P)雜交時(shí)顯示有希望 的結(jié)果的3個(gè)鋅指品系(0X4104,圖19)。對(duì)于含有兩種質(zhì)粒的蠅未記錄到負(fù)效應(yīng),表明效 應(yīng)物在體組織中的基礎(chǔ)表達(dá)不足夠_以顯不負(fù)效應(yīng)。從品系L和從品系I僅觀察到14%和 27%卵孵化。從品系G在卵孵化方面也無(wú)顯著降低。品系L和I包含單拷貝的轉(zhuǎn)基因,與 含有兩個(gè)(或更多個(gè))拷貝的品系G相反。結(jié)果明確表明5'Hsp83UTR-Cc微管蛋白-SV40 3'UTR啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)雄性生殖系中tTAV的足夠表達(dá)以誘導(dǎo)精子不育,如由從這些雄性產(chǎn)生的 后代孵化的幼蟲(chóng)的減少表明的。另外,未觀察到雌性可育性的降低,表明啟動(dòng)子以雄性-生 殖系特異的方式作用(數(shù)據(jù)未顯示)。然而,一個(gè)0X4282品系的后代無(wú)顯著減少的事實(shí)指 向影響表型的位置效應(yīng)。
[0295] 0X4282 (PB-HrIE-AmCyan-SV40-TurboGFP-tetol4-cc微管蛋 白-hsp83-tTAV-SV40)x0X4112 (PB-IPP0-l-hsp83-tet021-Hr5-IEl-Red)
[0296] 將相同的0X4282品系與I-Ppol品系雜交,其證明在體細(xì)胞中活化的兩個(gè)啟動(dòng)子 (Hsp83和0pie2)雜交時(shí)的致死性。與野生型和四環(huán)素對(duì)照相比,使用該效應(yīng)物,觀察到高 達(dá)50%不育(數(shù)據(jù)未顯示)。結(jié)果表明在此測(cè)定中看到的不育是通過(guò)tTAV激活核酸酶表達(dá) 和之后的精子DNA切割的結(jié)果。不育水平表明不足夠的外顯率。當(dāng)其與遺傳啟動(dòng)子品系雜 交時(shí),相同品系呈現(xiàn)強(qiáng)烈的致死效果的事實(shí)可以提示,在雄性生殖系中產(chǎn)生不足夠的此種 蛋白分子以引起想要的效果。對(duì)于強(qiáng)烈效果發(fā)生,可能蛋白需要超過(guò)某閾值,其也增加影響 性能的轉(zhuǎn)基因的位置效應(yīng)的可能性。這與含有在該測(cè)定過(guò)程中觀察的兩種轉(zhuǎn)基因的蛹的降 低的數(shù)量一起,使I-Pp〇l成為對(duì)于開(kāi)發(fā)精子致死性不適當(dāng)?shù)?,并且因此不?yōu)選的候選物。
[0297] 0X4282 (PB-HrIE-AmCyan-SV40-TurboGFP-tetol4-cc微管蛋 白-hsp83-tTAV-SV40)x
[0298] 0X4458 (PB-AttP-Hr5-IEl-DsRed2-SV40-teto21-Dm魚(yú)精蛋白-核酸酶)
[0299] 圖3.開(kāi)和關(guān)四環(huán)素下的0X4282-0X4458雄性不育-轉(zhuǎn)基因地中海果蠅中可抑制 的雄性特異的不育。
[0300] 將四個(gè)獨(dú)立的,攜帶tet〇-魚(yú)精蛋白-FokI效應(yīng)物(Bl,Dl,D2,F2)的0X4458(圖 21)轉(zhuǎn)座子的常染色體插入品系與攜帶來(lái)自地中海實(shí)蠅(地中海果蠅(Ceratitis capitata)) 02-微管蛋白基因的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的四環(huán)素可抑制反式激活子(tTAV)的 0X4282L驅(qū)動(dòng)物品系雜交。將這些雜交的后代以有(lOOiig/ml;tet+)或無(wú)四環(huán)素(tet_) 的飲食之一飼養(yǎng)和繁殖。既攜帶驅(qū)動(dòng)物等位基因也攜帶效應(yīng)物等位基因的雄性與野生型 雌性雜交并且計(jì)算獲自這些雜交的卵孵化率(孵化的所產(chǎn)卵的百分?jǐn)?shù))。200-500個(gè)卵每 組的四組不同卵收集物用于各個(gè)雜交。野生型和0X4282L雄性與野生型雌性在存在或缺 少四環(huán)素的情況下的雜交用作對(duì)照。將觀察到的高度顯著雄性不育的雜交(卡方檢驗(yàn),P < 0. 0001)用星號(hào)標(biāo)記。
[0301 ] 0X4458 (圖21)構(gòu)建體含有在單端的源自piggyBac的載體中的tetO操縱 子的轉(zhuǎn)錄控制下的融合于果蠅(Drosophila)魚(yú)精蛋白的單個(gè)FokI切割結(jié)構(gòu)域,以hr5-IEl-DsRed2作為轉(zhuǎn)化標(biāo)記。0X4458(圖21)構(gòu)建體應(yīng)該自身不發(fā)揮任何效果。當(dāng) 0X4458 (圖21)品系與合適的表達(dá)tTAV的品系雜交時(shí),在具有兩個(gè)等位基因的雙雜合子后 代中,并且在容許條件(無(wú)tTAV抑制物-四環(huán)素)下,效應(yīng)物融合蛋白的表達(dá)發(fā)生。
[0302] 將具有單個(gè),常染色體轉(zhuǎn)基因插入的四個(gè)品系與表達(dá)tTAV的品系-0X4282L(其在 之前的實(shí)驗(yàn)中呈現(xiàn)更高的啟動(dòng)子活性(參見(jiàn)上文))雜交。在所有的四個(gè)雙雜合子組合中, 觀察到來(lái)自與轉(zhuǎn)基因雄性交配的雌性的卵的孵化率的劇烈降低。使用與野生型雄性雜交的 攜帶兩種轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因雌性驗(yàn)證觀察到的效果的性別特異性(數(shù)據(jù)未顯示)。
[0303] 根據(jù)上文顯示的結(jié)果,"改變的"微管蛋白啟動(dòng)子和果蠅(Drosophila)魚(yú)精蛋 白-FokI效應(yīng)物的組合,似乎產(chǎn)生以任何其它方式比測(cè)試的方式對(duì)雄性的一般健康具有最 ?。ɑ蛉鄙伲┴?fù)效應(yīng)的雄性生殖系特異的致死效果。另外,雌性似乎不顯著受轉(zhuǎn)基因表達(dá) 的影響,支撐使用的序列的雄性生殖系特異性。下一步將是設(shè)計(jì)將在單個(gè)質(zhì)粒(0X4353)中 既含有啟動(dòng)子也含有效應(yīng)物序列的構(gòu)建體。此種構(gòu)建體將提供要用于開(kāi)發(fā)父本效應(yīng)致死系 統(tǒng)的轉(zhuǎn)座子的更現(xiàn)實(shí)的狀況。
[0304] 0X4353 (PB-HrIE-AmCyan-SV40-tetol4-Dm魚(yú)精蛋白-核酸酶-cc微管蛋 白-hsp83-tTAVnew_SV40)
[0305] 4個(gè)品系被認(rèn)為是除品系F(其被認(rèn)為具有兩個(gè)插入)的,基于轉(zhuǎn)化標(biāo)記的遺傳模 式單插入事件。如之前描述的在四環(huán)素存在和缺少的情況下,通過(guò)與野生型雜交測(cè)試所有 品系。將來(lái)自相同品系的雌性也與野生型雄性雜交并且以類(lèi)似的方式評(píng)估其可育性。
[0306] 圖4.開(kāi)和關(guān)四環(huán)素下0X4353雄性不育的百分?jǐn)?shù)。
[0307] 在地中海果蠅中產(chǎn)生五株獨(dú)立的,攜帶tet〇-魚(yú)精蛋白-FokI效應(yīng)物和由來(lái)自地 中海實(shí)蠅(地中海果蠅(Ceratitiscapitata))的0 2-微管蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的四環(huán)素可 抑制反式激活子(tTAV)的0X4353轉(zhuǎn)座子的常染色體插入品系(A,B,C,D,F(xiàn))。將這些品系 的后代以有(100Ug/ml;tet+)或無(wú)四環(huán)素(tet_)的飲食飼養(yǎng)和繁殖。將雄性與野生型雌 性雜交并且計(jì)算獲自這些雜交的卵孵化率(孵化的所產(chǎn)卵的百分?jǐn)?shù))。100-150個(gè)卵的兩 組卵用于每個(gè)雜交。在四環(huán)素存在或缺少的情況下與野生型雌性雜交的野生型雄性用作對(duì) 照。觀察到高度顯著雄性不育的雜交(卡方檢驗(yàn),**表示P< 〇? 001,***表示P< 〇? 0001) 用星號(hào)標(biāo)記。
[0308] 圖5.開(kāi)和關(guān)四環(huán)素下0X4353雌性不育的百分?jǐn)?shù)。在地中海果蠅中產(chǎn)生五個(gè)獨(dú) 立的,攜帶tet〇-魚(yú)精蛋白-FokI效應(yīng)物和由來(lái)自地中海實(shí)蠅(地中海果蠅(Ceratitis capitata))的02-微管蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的四環(huán)素可抑制反式激活子(tTAV)的0X4353轉(zhuǎn) 座子的常染色體插入品系(A,B,C,D,F(xiàn))。將這些品系的后代以有(lOOyg/ml;tet+)或無(wú) 四環(huán)素(tet_)的飲食飼養(yǎng)和繁殖。將雌性與野生型雄性雜交并且計(jì)算獲自這些雜交的卵 孵化率(孵化的所產(chǎn)卵的百分?jǐn)?shù))。使用來(lái)自各個(gè)雜交的100-150卵的兩組卵收集物。在 存在或缺少四環(huán)素的情況下與野生型雌性雜交的野生型雄性用作對(duì)照。未觀察到顯著的雌 性不育(卡方檢驗(yàn),P> 〇? 05)。
[0309] 結(jié)果表明在飲食中缺少四環(huán)素(容許條件)的情況下,雜合0X4353雄性多達(dá) 100%不育。然而一些品系的雄性甚至在四環(huán)素存在的情況下是近乎可育的(sub-fertile) 并且來(lái)自多數(shù)品系的雌性在四環(huán)素缺少的情況下顯示可育性的稍微降低。從上述結(jié)果,我 們可以得出結(jié)論:轉(zhuǎn)基因的表達(dá)在所有5個(gè)測(cè)試的品系中就誘導(dǎo)精子致死性而言是起作用 的,然而實(shí)現(xiàn)對(duì)含有該轉(zhuǎn)基因的昆蟲(chóng)的一般健康具有最小影響的完全(或非常接近)精子 致死性的精細(xì)調(diào)節(jié),似乎極大地受位置效應(yīng)(即插入的序列在昆蟲(chóng)基因組合接近的調(diào)控元 件中的位置)影響。
[0310] 這里描述的工作顯示1030bp地中海果蠅(Medfly) 0 2-微管蛋白啟動(dòng)子片段在四 環(huán)素的控制下足以驅(qū)動(dòng)tTAV表達(dá)并進(jìn)一步驅(qū)動(dòng)精子自然發(fā)生中效應(yīng)物基因表達(dá)。0X4353 株證明是功能的,四環(huán)素-可抑制的精子-致死株。另外,研究者可以得出結(jié)論:當(dāng)在地中 海果蠅(Medfly)中表達(dá)時(shí),Dm魚(yú)精蛋白保留其關(guān)鍵性質(zhì)中的至少一種;即結(jié)合精子DNA。 魚(yú)精蛋白序列不是良好保守的,因此在這些實(shí)驗(yàn)之前陽(yáng)性結(jié)果是不確定的。這些結(jié)果表明 進(jìn)一步使用與二元"tet-關(guān)"系統(tǒng)有關(guān)的啟動(dòng)子/效應(yīng)物組合的對(duì)于地中海果蠅(Medfly) 群體控制的看法的希望。
[0311] 0X4718(PB4Hriel-AmC-MexMActPr〇-DsR-tet021-Prota-mCh-FokI-CcBTubPr〇-tT AV2-Hriel-ZsG)
[0312] 0X4718是地中海果蠅(Medfly)上的既攜帶啟動(dòng)子組分又?jǐn)y帶效應(yīng)物組分的單個(gè) 構(gòu)建體的實(shí)例。將該質(zhì)粒注射入前胚盤(pán)地中海實(shí)蠅(地中海果蠅(Ceratitiscapitata)) 胚胎中。既表達(dá)紅也表達(dá)綠色熒光蛋白的蛹(含有不同顏色的pb端的4-端pb構(gòu)建體 (Dafaala等人,2006)-意味著完全轉(zhuǎn)座子的插入-在兩組Go雜交V(1個(gè)蛹)和〇 (47個(gè) 蛹)中的G1后代之間發(fā)現(xiàn)。來(lái)自0X4718-V品系的單個(gè)蛹未存活至成年。來(lái)自0X4718-O 品系的蛹展現(xiàn)兩個(gè)明顯不同的表型:更強(qiáng)(30個(gè)蛹)和更弱(17個(gè)蛹)并且分別命名為〇 1 和〇 2。這些大多數(shù)增殖為與野生型的單個(gè)雄性或雌性雜交并且在此階段被認(rèn)為是兩個(gè)獨(dú) 立的插入事件。0X4718- 〇 1 (b)和0X4718- 〇 2 (b)品系在G2階段終止。G2蛹的表型分析 表明每個(gè)這些品系中的多個(gè)插入。G3階段的品系的進(jìn)一步分析證實(shí)〇 1(a)和〇 1(c)品系 二者都是單個(gè),常染色體插入。0X4718-g2 (a)在X染色體上攜帶單個(gè)插入-如通過(guò)改變不 同代雄性中轉(zhuǎn)基因的缺少或存在所提示的并且尚未為了本研究的目的進(jìn)一步分析。
[0313] 以有(100Ug/ml;tet+)或無(wú)四環(huán)素(tet_)的飲食飼養(yǎng)和繁殖0X4718-O1(a)和 0X4718-O1(c)品系并與野生型雜交。在存在或缺少四環(huán)素的情況下,野生型與野生型之間 和0X4718雌性與野生型雄性的雜交用作對(duì)照。在建立籠后第4天收集來(lái)自這些雜交的新 鮮-不老于24小時(shí)-卵。進(jìn)行每個(gè)雜交/籠三次收集。將卵的總數(shù)量與四天后未能孵化 的卵數(shù)量進(jìn)行比較。計(jì)算孵化率為平均孵化的所產(chǎn)卵的百分?jǐn)?shù);這些數(shù)據(jù)顯示在四環(huán)素缺 失情況下0X4718-〇 1雄性的顯著不育。結(jié)果顯示于圖6。將在存在或缺少的四環(huán)素情況下 飼養(yǎng)的0X4718- 〇 1 (a)和X4718- 〇 1 (c)品系與野生型雌性雜交并且計(jì)算獲自這些雜交的 卵孵化率(孵化的所產(chǎn)卵的百分?jǐn)?shù))。野生型與野生型之間和0X4718雌性與野生型雄性的 雜交用作對(duì)照。觀察到高度顯著雄性不育的雜交(卡方檢驗(yàn),P< 〇. 0001)用星號(hào)標(biāo)記。
[0314] 上述結(jié)果證明成功以適于野外使用的方式在地中海實(shí)蠅(地中海果蠅 (Ceratitiscapitata))開(kāi)發(fā)條件雄性特異的不育;即個(gè)體啟動(dòng)子和效應(yīng)物分子組裝于單 個(gè)構(gòu)建體。
[0315] 圖7和8開(kāi)和關(guān)四環(huán)素下橄欖果蠅中0X4705雄性和雌性不育的百分?jǐn)?shù)。
[0316] 0X4705
[0317] (PBMexMActPr〇-DsR-tet021-Prota-mCh-FokI-CcBTubPr〇-tTAV2)
[0318] 這提供既含有啟動(dòng)子組分又含有效應(yīng)物組分的單個(gè)構(gòu)建體的其它實(shí)例,在這一情 況中是在橄欖果蠅中。
[0319] 基于在地中海果蠅(Medfly)(地中海實(shí)蠅(地中海果蠅(Ceratitiscapitata))) 中獲得的另人鼓舞的結(jié)果,對(duì)于相關(guān)的實(shí)蠅(Tephritid),橄欖果蠅(Bactroceraoleae) (通常稱(chēng)為橄欖果蠅)開(kāi)發(fā)類(lèi)似的質(zhì)粒。質(zhì)粒0X4705整合了驅(qū)動(dòng)雄性生殖系中tTAV表達(dá) 和接著驅(qū)動(dòng)tetO和Dro魚(yú)精蛋白-FokI融合效應(yīng)物的表達(dá)的B2微管蛋白的改變的形式。 所述質(zhì)粒還整合了新的墨西哥果蠅(Mexfly)(墨西哥按實(shí)蠅(Anastrephaludens))肌肉 肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子,其驅(qū)動(dòng)作為轉(zhuǎn)化標(biāo)記的DsRed2熒光蛋白的表達(dá)。
[0320] 在橄欖果蠅前胚盤(pán)胚胎上顯微注射質(zhì)粒0X4705S產(chǎn)生10個(gè)獨(dú)立的插入事件。所 有株在顯微鏡下以適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)濾光片呈現(xiàn)強(qiáng)烈的熒光表型(熒光標(biāo)記表達(dá))并且根據(jù)孟德 爾遺傳法則是單個(gè)插入。9個(gè)插入是常染色體的,同時(shí)一個(gè)在X染色體上。在存在和缺少四 環(huán)素的情況下從幼蟲(chóng)中期測(cè)試所有株的雄性和雌性不育。野生型雜交提供另外的對(duì)照。結(jié) 果顯示于圖7和8。
[0321] 圖7顯示開(kāi)和關(guān)四環(huán)素下0X4705橄欖果蠅雄性不育的百分?jǐn)?shù)。在橄欖果蠅中 產(chǎn)生9個(gè)獨(dú)立的,攜帶tet〇-魚(yú)精蛋白-FokI效應(yīng)物和由來(lái)自地中海實(shí)蠅(地中海果蠅 (Ceratitiscapitata))的0 2-微管蛋白啟動(dòng)子的改變形式驅(qū)動(dòng)的四環(huán)素可抑制反式激 活子(tTAV)的0X4605轉(zhuǎn)座子的常染色體插入品系(A,A1,A2,A3,B,B1,F(xiàn),F(xiàn)1,P)。將這些 品系的后代以有(100Ug/ml;tet+)或無(wú)四環(huán)素(tet_)的飲食飼養(yǎng)和繁殖。將雄性與野生 型雌性雜交并且計(jì)算獲自這些雜交的卵孵化率(孵化的所產(chǎn)卵的百分?jǐn)?shù))。100-150卵的 三組卵收集物用于各個(gè)雜交以提供統(tǒng)計(jì)顯著性。在存在或缺少四環(huán)素的情況下與野生型雌 性雜交的野生型雄性用作對(duì)照。
[0322] 圖8顯示開(kāi)和關(guān)四環(huán)素下0X4705橄欖果蠅雌性不育的百分?jǐn)?shù)。在橄欖果蠅中產(chǎn)生 9個(gè)獨(dú)立的,攜帶tet〇-魚(yú)精蛋白-FokI效應(yīng)物和來(lái)自地中海實(shí)蠅(地中海果蠅(Ceratitis capitata))的02-微管蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的四環(huán)素可抑制反式激活子(tTAV)的0X4705轉(zhuǎn) 座子的常染色體插入(A,Al,A2,A3,B,Bl,F(xiàn),F(xiàn)l,P)。將這些品系的后代以有(100iig/ml; tet+)或無(wú)四環(huán)素(tet_)的飲食飼養(yǎng)和繁殖。將雌性與野生型雄性雜交并且計(jì)算獲自這些 雜交的卵孵化率(孵化的所產(chǎn)卵的百分?jǐn)?shù))。使用來(lái)自每個(gè)雜交的100-150卵的兩組卵收 集物。在存在或缺少四環(huán)素的情況下與野生型雌性雜交的野生型雄性用作對(duì)照。未觀察到 顯著的雌性不育。
[0323] 與野生型對(duì)照相比,當(dāng)雄性在幼蟲(chóng)飲食中存在四環(huán)素的情況下飼養(yǎng)時(shí),數(shù)據(jù)強(qiáng)烈 地表明另人驚嘆的0X4705橄欖果蠅雄性不育,而在幼蟲(chóng)飲食缺少四環(huán)素的情況下,雄性可 育性不降低(圖7)。雌性可育性(圖8)和雄性的一般健康未受影響,提示"父性致死盒" 的雄性生殖系特異表達(dá)。
[0324] 圖9開(kāi)和關(guān)四環(huán)素下0X4466雄性和雌性不育的百分?jǐn)?shù)
[0325] 接著地中海實(shí)蠅(地中海果蠅(Ceratitiscapitata)),和橄欖果蠅(Bactrocera oleae)中父系轉(zhuǎn)移的致死效果的成功,焦點(diǎn)轉(zhuǎn)移至具有經(jīng)濟(jì)上重要性的其它雙翅目;埃及 伊蚊(Aedesaegypti)。以下實(shí)例使用與在地中海果蠅(C.capitata)中類(lèi)似的啟動(dòng)子和效 應(yīng)物序列提供在此物種上的顯著雄性不育的證據(jù)。在一些使用該生物的基因組序列的構(gòu)建 體中發(fā)生稍微的改變以獲得最大化結(jié)果。
[0326] 0X4466(PB-hr5IEl-DsRed-Aeprot-tGFP-EcoRI)
[0327] 這也提供其它效應(yīng)物的實(shí)例;將A印ro-EcoRI. 0X4466注射入前胚盤(pán)埃及伊蚊 (Aedesaegypti)胚胎中。該構(gòu)建體的組分組成型表達(dá)而不是通過(guò)tet-關(guān)系統(tǒng)誘導(dǎo)。產(chǎn)生 4個(gè)獨(dú)立的插入事件。來(lái)自各個(gè)株的雄性和雌性與野生型異性蚊子回交。野生型昆蟲(chóng)用作 對(duì)照。讓雌性在濾紙上產(chǎn)卵24小時(shí)。評(píng)估后代的存活。結(jié)果顯示于圖9。圖標(biāo)顯示收集的 從各個(gè)測(cè)試雜交孵化的胚胎的百分?jǐn)?shù)。內(nèi)部表格提供實(shí)際記錄的數(shù)量。該實(shí)驗(yàn)證明當(dāng)這些 以0X4466雄性為父本時(shí),孵化的卵數(shù)量顯著減少;在品系D中,胚胎存活力的降低不明顯, 可能由于位置效應(yīng)。結(jié)果證實(shí)胚胎致死性的性別特異性;來(lái)自轉(zhuǎn)基因雌性的胚胎野生型對(duì) 照雜交的這些同等地可成活。
[0328] 將構(gòu)建體0X4466的伊蚊(Aedes)-魚(yú)精蛋白-核酸酶效應(yīng)物DNA序列(EcoRI)融 合于熒光基因(turboGFP),以致在精子中核酸酶的表達(dá)應(yīng)該與熒光蛋白的表達(dá)共存。分離 自許多0X4466雄性中解剖的精巢的精子的熒光顯微,顯示與核/精子頭的強(qiáng)烈的GFP共定 為。這是融合于突光表達(dá)的核酸酶功能的實(shí)例。
[0329] 圖10開(kāi)和關(guān)四環(huán)素下0X4467雄性和雌性不育的百分?jǐn)?shù)
[0330] 0X4467(PB-hr5IEl-DsRed-A印rot-tGFP-FokICD)
[0331] 0X4467與質(zhì)粒0X4466相同,僅有的區(qū)別是核酸酶效應(yīng)物是Fokl而不是EcoRI。
[0332] 將該質(zhì)粒注射入前胚盤(pán)埃及伊蚊(Aedesaegypti)胚胎產(chǎn)生3個(gè)獨(dú)立的插入事 件。這些事件中的兩個(gè)在通過(guò)轉(zhuǎn)基因G0雄性的代G1中喪失;表明父性致死效應(yīng)的非常強(qiáng) 烈的表達(dá)。如之前的分析剩余株。結(jié)果顯示于圖10中。表格顯示收集的從各個(gè)測(cè)試雜交 中孵化的胚胎的百分?jǐn)?shù)。內(nèi)部表格提供實(shí)際記錄的數(shù)量。該實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)這些以0X4467雄 性為父本時(shí)孵化的卵的數(shù)量的顯著減少。結(jié)果證實(shí)預(yù)期的胚胎致死性的性別特異性;來(lái)自 轉(zhuǎn)基因雌性的胚胎與野生型對(duì)照雜交中的這些等同地可成活。
[0333] 如在0X4466質(zhì)粒中,將伊蚊-魚(yú)精蛋白-核酸酶效應(yīng)物DNA序列(Fokl)融合于 熒光基因(turboGFP),從而在精子中核酸酶的表達(dá)應(yīng)該與熒光蛋白的表達(dá)共存。分離自許 多0X4467-E1雄性中解剖的精巢的精子的熒光顯微,顯示與核/精子頭強(qiáng)烈的GFP共定位。 這是融合于熒光表達(dá)的核酸酶功能的其它實(shí)例。
[0334] 0X4286(PB-AeTopi-tTAV-K10-3xP3-DsR)
[0335] 0X4286(圖23)是基于piggyBac轉(zhuǎn)座子的構(gòu)建體,其含有由埃及伊蚊(Aedes aegypti)驅(qū)動(dòng)的topi啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的tTAV和topi5'UTR。0X4286(圖23)使用3xP3驅(qū)動(dòng) 的DsRed作為轉(zhuǎn)化標(biāo)記。3xP3是人工的,眼特異的啟動(dòng)子,負(fù)責(zé)進(jìn)化保守的Pax-6轉(zhuǎn)錄因子 并且在胚胎,幼蟲(chóng)和蛹階段過(guò)程中活化。為了測(cè)試Topi啟動(dòng)子的活性,使用報(bào)道分子品系, 0X3979-Ae。0X3979-Ae含有在tetO操縱子控制下的AmCyan編碼序列,使用噬菌體C31系 統(tǒng)整合于基因組停泊位點(diǎn)(dockingsite)。其表達(dá)hr5IEl驅(qū)動(dòng)的DsRed作為轉(zhuǎn)化標(biāo)記。 由與0X4628B和0X3979品系雜交產(chǎn)生的既攜帶Topi-tTAV也攜帶tet〇-AmCyan的雙雜合 子,顯示來(lái)自后幼蟲(chóng)期的埃及伊蚊(Aedesaegypti)精巢中明確地AmCyan表達(dá)。
[0336] 0X4635 (PB-HrIE-AmCyan-SV40-AeP2 微管蛋白-hsp83-tTAV-SV40)
[0337] 為了測(cè)試B2微管蛋白啟動(dòng)子用于埃及伊蚊(Aedesaegypti)蚊子的條件雄性不 育系統(tǒng)中的適用性,構(gòu)建基于PiggyBac的構(gòu)建體0X4635。Smith等人,在他們的2007年文 章中描述了埃及伊蚊(Aedesaegypti)B2_微管蛋白啟動(dòng)子的克隆和表征并限定其959bp 片段足以以類(lèi)似于內(nèi)源啟動(dòng)子的階段和組織-特異的方式驅(qū)動(dòng)蚊子精巢中的DsRed表達(dá)。 這表明報(bào)道分子基因的成功直接表達(dá)并且就設(shè)計(jì)而言與我們之前測(cè)試的組成型雄性不育 系統(tǒng)類(lèi)似。為了將啟動(dòng)子適于用于我們的條件表達(dá)系統(tǒng),我們決定盡可能去除B2-微管蛋 白的轉(zhuǎn)錄的序列,理由是這些可能介導(dǎo)典型的B2-微管蛋白的翻譯延遲,其對(duì)于建議的二 元表達(dá)系統(tǒng)將是極不想要的。將與0RF的前36bp-起存在于由Smith等人(2007)使用的 序列中的5'UTR去除并以來(lái)自地中海果蠅的hsp83最小啟動(dòng)子替代。該改變的啟動(dòng)子用于 驅(qū)動(dòng)構(gòu)建體0X4635中tTAV表達(dá)。0X4635含有hr5IEl驅(qū)動(dòng)的AmCyan作為轉(zhuǎn)化標(biāo)記。
[0338] 埃及伊蚊(Aedesaegvtoi)中的備件雄件不育
[0339] 圖 110X4282-0X4627Topi_tTAV-驅(qū)動(dòng)的tet〇-Ae-魚(yú)精蛋白-FokI-CD(0X4286_Bx 0X4458)的表達(dá)
[0340] 0X4627 (PB-AeProt-FokI_sv40-多聚腺苷酸-hrIEl-DsRed)
[0341] 對(duì)于條件不育系統(tǒng)的第二部分;核酸酶效應(yīng)物蛋白,以與0X4458(圖21)(在 地中海果蠅(C.capita)中成功使用)類(lèi)似的方式建立構(gòu)建體0X4627;主要區(qū)別是使用 的魚(yú)精蛋白序列源自埃及伊蚊(Aedesaegypti)并且為了優(yōu)化的結(jié)果,不源自黑腹果蠅 (D.melanogaster)〇
[0342] 株0X4282B與四個(gè)不同0X4627株雜交。將雙雜合雄性與野生型雌性雜交并且將產(chǎn) 生的胚胎對(duì)孵化率評(píng)分。包括野生型,0X4627自身,和雌性對(duì)照。在以無(wú)四環(huán)素的飲食飼養(yǎng) 的攜帶兩種等位基因的雄性的所有4個(gè)樣品中都觀察到胚胎孵化率的顯著(高達(dá)100% ) 降低。結(jié)果顯示于圖11。將0X4286B和0X4627品系之間的雜交的后代以有(tet+)或無(wú)四 環(huán)素(tet_)的飲食飼養(yǎng)。將既攜帶驅(qū)動(dòng)物等位基因又?jǐn)y帶效應(yīng)物等位基因的雄性與野生 型雌性雜交并且計(jì)算獲自這些雜交的卵孵化率(孵化的所產(chǎn)卵的百分?jǐn)?shù))。野生型雄性與 野生型雌性的雜交用作對(duì)照。觀察到高度顯著雄性不育的雜交(卡方檢驗(yàn))用星號(hào)標(biāo)記。
[0343] 圖 120X4635-0X4627P2-tub-tTAV-驅(qū)動(dòng)的tet〇-Ae-魚(yú)精蛋白-FokI-CD(0X4635x 0X4627)的表達(dá)
[0344] 將兩個(gè)0X4635株與四個(gè)不同0X4627株雜交。將雙雜合雄性與野生型雌性雜交并 且將產(chǎn)生胚胎對(duì)孵化率評(píng)分。野生型雜交用作對(duì)照。在一些以四環(huán)素飲食飼養(yǎng)的攜帶兩種 等位基因的雜合雄性(對(duì)于各個(gè)等位基因)中觀察到胚胎孵化率的顯著降低。相信不是所 有樣品都表現(xiàn)出相同比例的精子不育的事實(shí)是由于不同轉(zhuǎn)基因插入的位置效應(yīng)。結(jié)果顯示 于圖12中。將0X4635和0X4627品系之間雜交的后代以有(tet+)或無(wú)四環(huán)素(tet-)的 飲食飼養(yǎng)。將既攜帶驅(qū)動(dòng)物等位基因又?jǐn)y帶效應(yīng)物等位基因的雄性與野生型雌性雜交并且 計(jì)算獲自這些雜交的卵孵化率(孵化的所產(chǎn)卵的百分?jǐn)?shù))。野生型雄性與野生型雌性的雜 交用作對(duì)照。觀察到高度顯著雄性不育的雜交(卡方檢驗(yàn))用星號(hào)標(biāo)記。
[0345] 在埃及伊蚊(Aedesaegypti)中,與B2-微管蛋白相比,在核酸酶表達(dá)由Topi啟 動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的雜交中,看到更強(qiáng)的完全絕育效果。盡管如此,在兩種情況下均觀察到顯著雄性 不育,使topi和B2-微管蛋白合適啟動(dòng)子的改變形式二者都成為蚊子物種埃及伊蚊(Aedes aegypti)中的"父本致死效應(yīng)"。然而由Topi啟動(dòng)子發(fā)揮的更強(qiáng)效應(yīng)可能與多于一個(gè) Topi-tTAV等位基因插入相關(guān)。根據(jù)表型分離數(shù)據(jù),在0X4286B品系中存在一些Topi-tTAV 插入-它們中的一些與雄性性別確定位點(diǎn)連接。埃及伊蚊(Aedesaegypti)缺少性別二態(tài) 性染色體,作為替代,性別由雄性性別確定位點(diǎn)(M)的存在或缺少確定。
[0346] 核酸酶效應(yīng)物融合蛋白;魚(yú)精蛋白-Fokl,在至今測(cè)試的三種不同雙翅目物種,即 地中海果蠅(C.capita),橄欖果蠅(B.oleae)和埃及伊蚊(Aedesaegypti)中完全行使功 能。
[0347] 雄件不育和雌件致死株一起雜奪
[0348] 為了檢測(cè)精子致死技術(shù)可以怎樣與雌性致死RIDL技術(shù)相互作用和對(duì)包含著兩種 轉(zhuǎn)基因的終產(chǎn)物的一般性能的可能的影響,建立了將0X4353的地中海果蠅(Medfly)雌性 (選擇兩個(gè)品系B和F)與地中海果蠅(Medfly)雌性致死品系(0X3864A和0X3647Q)的雄 性雜交的實(shí)驗(yàn)。RIDL技術(shù)的使用第一次在W0 01/39599中描述。根據(jù)其熒光表型選擇包 含這兩種插入的個(gè)體并且不育和雌性致死性測(cè)定就位。在缺少四環(huán)素的情況下,這些雜交 的后代應(yīng)該僅是雄性并且是不育的。在存在和缺少四環(huán)素(l〇〇ng/yl)的情況下評(píng)估雄性 可育性和雌性致死性。結(jié)果證實(shí)在缺少四環(huán)素的情況下在任何雜交中都無(wú)雌性后代產(chǎn)生, 然而,當(dāng)幼蟲(chóng)在含有四環(huán)素的食物上生長(zhǎng)時(shí),獲得正常的50 :50雄性對(duì)雌性比例。將含有兩 種插入無(wú)的雄性與野生型雌性回交并且如在之前的雜交評(píng)估雄性不育。結(jié)果顯示于圖13。 數(shù)據(jù)表明測(cè)試的0X4353株的雄性不育仍然不受雌性致死正反饋存在影響或?qū)嵸|(zhì)上其被進(jìn) 一步稍微降低,盡管這可以歸因于隨機(jī)變異。因此重要的是,這些雜交強(qiáng)烈提示雌性和精子 致死質(zhì)粒的存在可以共存于單個(gè)生物中,而沒(méi)有對(duì)二者中任一個(gè)的任何負(fù)效應(yīng)。
[0349] 精子-致死株中Cc3 2-微管蛋白啟動(dòng)子的5'和3'UTR的作用
[0350] 如在文獻(xiàn)(Catteruccia等人,2005;Smith等人,2007;Scolari等人,2008 ; Nirmala等人,2009)中另外描述的Cc0 2-微管蛋白啟動(dòng)子不驅(qū)動(dòng)0X3671 (圖16)株所有 精子中DsRed2表達(dá),可能與Cc3 2-微管蛋白基因的后期轉(zhuǎn)錄或翻譯相關(guān)。后期表達(dá)可以 導(dǎo)致對(duì)tetO重復(fù)的足夠tTAV蛋白結(jié)合,以激活轉(zhuǎn)基因株中報(bào)道分子基因或致死基因之一 的功能。具有修飾的5'UTR-0X3831,0X4282和0X4353的構(gòu)建體-在精子中顯示更高水平 的熒光或致死性,其說(shuō)明精子自然發(fā)生中基因表達(dá)中5'UTR的重要性。
[0351] 在黑腹果蠅(D.melanogaster)中,多數(shù)基因在減數(shù)分裂前表達(dá)并且產(chǎn)物儲(chǔ)存在 發(fā)育的生殖系細(xì)胞中,僅一些基因在減數(shù)分裂后轉(zhuǎn)錄(White-Cooper2009)。轉(zhuǎn)錄和翻譯 的時(shí)機(jī),和RNA和蛋白產(chǎn)物的穩(wěn)定性,對(duì)于開(kāi)發(fā)精子-致死轉(zhuǎn)基因地中海果蠅(Medfly)株 是關(guān)鍵的。這點(diǎn)的重要性可以從一種類(lèi)型的效應(yīng)物到另一種而不同。實(shí)質(zhì)上Windbichler 等人推測(cè)部分他們的問(wèn)題是核酸酶太穩(wěn)定,并且在胚胎中持續(xù)存在(Windbichler等人 2008)。另一方面,對(duì)于用熒光蛋白標(biāo)記的精子,熒光蛋白存活于成熟精子顯然是關(guān)鍵的。 未修飾的Cc3 2-微管蛋白表達(dá)在雄性生殖系中,如通過(guò)使用來(lái)自該基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)精母 細(xì)胞中報(bào)道分子基因表達(dá)證實(shí)的。然而,以其正常構(gòu)造即與源自相同基因的5'UTR序列 組合的該CcP2-微管蛋白啟動(dòng)子,可以在很后期并且剛好在減數(shù)分裂之前驅(qū)動(dòng)tTAV的翻 譯。在該情況下,當(dāng)與tetO-報(bào)道分子株雜交時(shí),對(duì)于tTAV蛋白結(jié)合tetO序列并進(jìn)一步誘 導(dǎo)相鄰報(bào)道分子基因的足量表達(dá)無(wú)充足時(shí)間。以未修飾的Cc0 2-微管蛋白啟動(dòng)子,20個(gè) 精巢中僅一個(gè)在一些精細(xì)胞束中顯示報(bào)道分子(DsRed2)表達(dá)。另一方面,5'UTR替代導(dǎo)致 株0X3831 (圖20)和0X4282雄性精巢中的早期精母細(xì)胞和解剖精細(xì)胞中更強(qiáng)的熒光表達(dá)。 3'UTR含有調(diào)節(jié)翻譯效率和mRNA穩(wěn)定性的序列,因此以已知在寬范圍的物種中行使功能的 序列替代微管蛋白基因的3'UTR;研究者可能排除負(fù)責(zé)微管蛋白基因的后期翻譯的調(diào)控元 件。
[0352] 0X4371
[0353] (PB-HrIE-AmCyan-SV40-TurboGFP-tetol4-Topi-ubi-tTAV2-SV40)
[0354] 0X4112 (PB-IPP0-l-hsp83-tet021-Hr5-IEl-Red)
[0355] 通過(guò)遺傳的方式,0X4371(圖27)品系似乎具有單拷貝的轉(zhuǎn)基因。當(dāng)與品系 0X4112 (圖17)(其含有效應(yīng)物IPpol)雜交時(shí),含有兩種質(zhì)粒的個(gè)體的數(shù)量稍微減少(與相 同雜交的野生型蛹相比)。然而,大多數(shù)品系中孵化的卵的數(shù)量無(wú)顯著降低,除了品系E呈 現(xiàn)雄性可育性的40 %的降低。
[0356] 0X4371
[0357] (PB-HrIE-AmCyan-SV40-TurboGFP-tetol4-Topi-ubi-tTAV2-SV40)
[0358] 0X4104(PB-YAFN-hsp83-tet〇2l-Hr5_IEl-Red)(圖I9).
[0359] 當(dāng)將0X4371 (圖27)品系與3-鋅指品系雜交時(shí),含有兩種質(zhì)粒的蠅完全可成活和 健康。品系F的雄性可育性無(wú)降低;然而品系B和E中分別存在45%和40%的降低。
[0360] 0X4391
[0361] (PB-HrIE-AmCyan-SV40-TurboGFP-teto14-Topi-ubi-tTAV2-Topi3'UTR)
[0362] 0X4104(PB-YAFN-hsp83-tet〇2l-Hr5_IEl-Red)(圖I9)
[0363] 評(píng)估品系0X4391G,C和D具有單個(gè)插入,同時(shí)品系B和H似乎各具有兩個(gè)拷貝的 轉(zhuǎn)基因。當(dāng)將0X4391 (圖22)品系與tetO-3鋅指品系(0X4104,圖19)雜交時(shí),似乎對(duì)含有 兩種質(zhì)粒的個(gè)體的生存力無(wú)任何負(fù)效應(yīng)。這表明在體組織中存在非常低(如果有)的轉(zhuǎn)基 因的基礎(chǔ)表達(dá)。所有5個(gè)分析的品系中,B具有精子產(chǎn)生可成活后代能力的70%降低,同時(shí) 品系H為僅40%可育。在剩余的品系中,在開(kāi)和關(guān)T下,卵生存力無(wú)顯著差異。結(jié)果強(qiáng)烈表 明該特定組合中存在兩個(gè)拷貝顯著減少測(cè)試的雄性的可育性。
[0364] 0X4391
[0365] (PB-HrIE-AmCyan-SV40-TurboGFP-tetol4-Topi-ubi-tTAV2-Topi3,UTR)
[0366] 0X4112 (PB-IPP0-l-hsp83-tet021-Hr5-IEl-Red)
[0367] 當(dāng)將相同的0X4391 (圖22)品系與IPP01品系雜交時(shí),與含有兩種質(zhì)粒之一或都 不含的后代相比,在存在T的情況下含有兩種質(zhì)粒的后代的數(shù)量降低。如在類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)中 描述的評(píng)估卵生存力。當(dāng)與品系B,C,F(xiàn)和G中的野生型對(duì)照相比時(shí),孵化的幼蟲(chóng)的數(shù)量無(wú) 顯者降低。在品系H中存在50%的胚胎生存力降低。
[0368] Aetopi和Cctopi啟動(dòng)子二者都顯示報(bào)道分子基因和tTAV的直接精巢-特異的表 達(dá)的能力,其隨后誘導(dǎo)報(bào)道分子基因或致死基因的精巢-特異表達(dá)。具體地,顯示1233-bp 序列(包括1168bp的Aetopi啟動(dòng)子和65bpAetopi5' -UTR)驅(qū)動(dòng)在埃及伊蚊(Ae. Aegypti)中tTAV-DsRed融合蛋白的精巢-特異表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示),并且tTAV表達(dá)可以 進(jìn)一步誘導(dǎo)精巢-特異的AmCyan報(bào)道分子基因表達(dá)。1178bp推定的Cctopi啟動(dòng)子不顯示 地中海果蠅(Medfly)中精巢-特異活性的證據(jù)。發(fā)現(xiàn)更大的(1708bp)Cctopi片段序列足 以驅(qū)動(dòng)精巢-特異的tTAV表達(dá)。
[0369] 從應(yīng)用遺傳工程的角度,證實(shí)使用的Cctopi推定的啟動(dòng)子片段為地中海果蠅 (Medfly)中新的雄性生殖系-特異的啟動(dòng)子,其比之前表征的0-2-微管蛋白啟動(dòng)子更早 表達(dá)。
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[0436] 序列
[0437] 以下涉及此后提供的SEQ ID NOs :1-56。
[0438] SEQ ID NOS :l-5完全0 -2微管蛋白序列-不同昆蟲(chóng)
[0439] SEQ ID NO :1
[0440] > gi|l67822003|gb|EU386342. l| 地中海實(shí)蠅(地中海果蠅(Ceratitis capitata)) 0 _2 微管蛋白 mRNA,完全 cds
[0441] SEQ ID NO :2
[0442] > gi|l58742|gb|M20420. l|DR0TUBB2A 黑腹果蠅(D.melanogaster) 0-2 微管蛋 白mRNA,完全cds
[0443] SEQ ID NO :3
[0444] > gi 1111035017 | gb | DQ833526. 11 埃及伊蚊(Aedes aegypti) 0 _2 微管蛋白 (B2t)基因,完全cds
[0445] SEQIDNO:4
[0446] >gi|2198152711gb|EU938673. 11 東方果蠅(Bactroceradorsalis)P-2 微管蛋 白基因,完全cds
[0447] SEQIDNO:5
[0448] >gi| 219815267 |gb|EU938671. 11 加勒比按實(shí)妮(Anastrephasuspensa) 0 _2 微 管蛋白基因,完全cds
[0449] SEQIDN0S:6_10 :@-2微管蛋白5'UTR序列-不同昆蟲(chóng)
[0450] SEQIDNO:6
[0451] >gi1167822003|gb|EU386342. 11 地中海實(shí)蠅(地中海果蠅(Ceratitis capitata)) 0 _2 微管蛋白 5'UTR
[0452] SEQIDNO:7
[0453] >gi1158742 |gb|M20420. 11DR0TUBB2A黑腹果蠅(D.melanogaster)P-2 微管蛋 白 5'UTR
[0454] SEQIDNO:8
[0455] >gi| 2198152711gb|EU938673. 11 東方果妮(Bactroceradorsalis) 0 _2 微管蛋 白 5'UTR
[0456] SEQIDNO:9
[0457] >gi| 111035017 |gb|DQ833526. 11 埃及伊蚊(Aedesaegypti) 0 _2 微管蛋白 (B2t)5,UTR
[0458] SEQIDNO: 10
[0459] >gi| 219815267 |gb|EU938671. 11 加勒比按實(shí)妮(Anastrephasuspensa) 0 _2 微 管蛋白5'UTR
[0460] SEQIDNOS: 11-15 -2微管蛋白3'UTR序列-不同昆蟲(chóng)
[0461] SEQIDNO: 11
[0462] >gi1167822003 |gb|EU386342. 11 地中海實(shí)蠅(地中海果蠅(Ceratitis capitata)) 0 _2 微管蛋白 3'UTR
[0463] SEQIDNO: 12
[0464] >gi1158742 |gb|M20420. 11DR0TUBB2A黑腹果蠅(D.melanogaster)P-2 微管蛋 白mRNA3'UTR
[0465] SEQIDNO: 13
[0466] >gi| 111035017 |gb|DQ833526. 11 埃及伊蚊(Aedesaegypti) 0 _2 微管蛋白 (B2t)基因 3'UTR
[0467] SEQIDNO: 14
[0468] >gi| 2198152711gb|EU938673. 11 東方果妮(Bactroceradorsalis) 0 _2 微管蛋 白基因3'UTR
[0469] SEQIDNO: 15
[0470] >gi| 219815267 |gb|EU938671. 11 加勒比按實(shí)妮(Anastrephasuspensa) 0 _2 微 管蛋白基因3'UTR
[0471] tTAV和變體
[0472] SEQIDNO. 16 :tTAV的開(kāi)放閱讀框
[0473] SEQIDNO. 17 :tTAV的蛋白序列
[0474] SEQIDNO. 18 :tTAV2 的開(kāi)放閱讀框
[0475] SEQIDNO. 19 :tTAV2 的蛋白序列
[0476] SEQIDNO. 20 :tTAV3 的開(kāi)放閱讀框
[0477] SEQIDNO. 21 :tTAV3 的蛋白序列
[0478] SEQIDNO :22_ 來(lái)自黑腹果蠅(D.melanogaster)的 5' UTRP-2 微管蛋白
[0479] SEQIDNO :23-24_ 黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)的b2 微管蛋白啟動(dòng)子 序列(SEQIDNO24)與Dmb2-微管蛋白的mRNA序列(SEQIDNO23)比對(duì)(5,UTR包括 在比對(duì)中)
[0480] SEQIDNO :25_Hsp83 的ORF地中海果蠅(Medfly)
[0481] SEQIDNO :26_ 如由Genebank給出的 5,UTR
[0482] SEQIDNO :27-來(lái)自 4353 的Hsp835,UTR
[0483] SEQIDNO :28_Hsp83的氨基酸序列,地中海果蠅(Medfly)
[0484] SEQIDNO :29-來(lái)自 0X3831 的DmAly5,UTR
[0485] SEQIDNO :30-DmAly啟動(dòng)子
[0486] SEQIDNO :31_tetR
[0487] SEQIDNO :32_Vpl6
[0488] 組合TETR和VP16序列產(chǎn)生tTAV序列。
[0489] SEQIDNO:33-DmTopicDNA
[0490] SEQIDNO:34_如在蠅基部發(fā)現(xiàn)的Dm啟動(dòng)子序列
[0491] SEQIDNO:35-#0X4254Cctopi啟動(dòng)子
[0492] SEQIDNO :36_#0X4275Cctopi啟動(dòng)子
[0493] SEQIDNO :37_#0X4371Cctopi啟動(dòng)子
[0494] SEQIDNO:38-40-LA4254(SEQIDNO38)cfLA4275(SEQIDNO39)cf LA4371(SEQIDNO40)的比對(duì)
[0495] SEQIDNO :41_ 來(lái)自 4286 的伊蚊topi啟動(dòng)子
[0496] SEQIDNO :42_ 來(lái)自 4286 的Aetopi 5, UTR
[0497] SEQIDNO:43_Topi黑腹果妮(Drosophilamelanogaster)ORF(編碼區(qū)域)
[0498] SEQIDNO:44_ 來(lái)自黑腹果妮(Drosophilamelanogaster)的AlyORF(編碼區(qū) 域)
[0499] SEQIDNO :45-LA3671B2 微管蛋白啟動(dòng)子和 5'UTR
[0500] SEQIDNO :46-LA4353B2 微管蛋白啟動(dòng)子
[0501] SEQIDNO:47-LA4353hsp835'UTR
[0502] SEQIDNO:48-B2 微管蛋白 5'UTR
[0503] SEQIDNO:49_Ae魚(yú)精蛋白
[0504] SEQIDNO:50_SG4
[0505] SEQIDNO:51-Fokl切割結(jié)構(gòu)域
[0506] SEQIDNO:52-Ae魚(yú)精蛋白-SG4-Fokl
[0507] SEQIDN0:53_地中海果蠅(Medfly)B2微管蛋白啟動(dòng)子正向引物
[0508] SEQIDN0:54_地中海果蠅(Medfly)B2微管蛋白啟動(dòng)子反向引物
[0509] SEQIDNO:55-TopitestFl引物
[0510] SEQIDNO:56-TopitestR引物
[0511] SEQIDNO: 23-24
[0512] 黑腹果蠅的b2微管蛋白啟動(dòng)子序列與Dmb2-微管蛋白的mRNA序列比對(duì)(5'UTR 包括在比對(duì)中)
[0513]
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【權(quán)利要求】
1. 一種適于在節(jié)肢動(dòng)物雄性生殖系中條件表達(dá)效應(yīng)物基因的節(jié)肢動(dòng)物雄性生殖系基 因表達(dá)系統(tǒng),所述系統(tǒng)包括: -第一表達(dá)單元,所述第一表達(dá)單元包含效應(yīng)物基因和與其可操作連接的用于其的啟 動(dòng)子; -第二表達(dá)單元,所述第二表達(dá)單元包含轉(zhuǎn)錄因子的編碼序列和可操作連接于其的上 游調(diào)控元件,所述轉(zhuǎn)錄因子能夠作用于第一表達(dá)單元的啟動(dòng)子上以驅(qū)動(dòng)效應(yīng)物基因的表 達(dá),所述上游調(diào)控元件包括: -轉(zhuǎn)錄因子的啟動(dòng)子;和 -臨近轉(zhuǎn)錄因子編碼序列起始位點(diǎn)的5' UTR ; 所述上游調(diào)控元件驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄因子的足量表達(dá),從而轉(zhuǎn)錄因子蛋白轉(zhuǎn)而在減數(shù)分裂前驅(qū) 動(dòng)效應(yīng)物基因的轉(zhuǎn)錄。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因表達(dá)系統(tǒng),其中所述轉(zhuǎn)錄因子是轉(zhuǎn)錄激活劑,如tTA, GAL4或它們的變體。
3. 根據(jù)任一項(xiàng)在前權(quán)利要求所述的基因表達(dá)系統(tǒng),其中所述效應(yīng)物是核酸內(nèi)切酶,最 優(yōu)選為3-鋅指核酸酶。
4. 根據(jù)任一項(xiàng)在前權(quán)利要求所述的基因表達(dá)系統(tǒng),其中第一表達(dá)單元的啟動(dòng)子是最小 啟動(dòng)子。
5. 根據(jù)任一項(xiàng)在前權(quán)利要求所述的基因表達(dá)系統(tǒng),其中第二表達(dá)單元中上游調(diào)控元件 的啟動(dòng)子大多來(lái)自topi,aly或β-2微管蛋白(B2T)或其同源物。
6. 根據(jù)任一項(xiàng)在前權(quán)利要求所述的基因表達(dá)系統(tǒng),其中第二表達(dá)單元的上游調(diào)控元件 中的5'UTR是來(lái)自hsp83,優(yōu)選來(lái)自地中海果蠅或hsp83的同源物,特別是在目標(biāo)節(jié)肢動(dòng)物 中發(fā)現(xiàn)的hsp83同源物的5' UTR。
7. 根據(jù)任一項(xiàng)在前權(quán)利要求所述的基因表達(dá)系統(tǒng),其中使用Gal4-UAS系統(tǒng),從而轉(zhuǎn)錄 因子是GAL4。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的基因表達(dá)系統(tǒng),其中所述系統(tǒng)是誘導(dǎo)型系統(tǒng),其中 誘導(dǎo)通過(guò)提供化學(xué)實(shí)體發(fā)生,如通過(guò)提供四環(huán)素發(fā)生,或通過(guò)提供四環(huán)素的類(lèi)似物之一發(fā) 生,所述四環(huán)素的類(lèi)似物包括多西環(huán)素。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的基因表達(dá)系統(tǒng),其中第二表達(dá)單元中的轉(zhuǎn)錄因子是tTA或其 變體(tTAV,tTAV2, tTAV3)。
10. 根據(jù)任一項(xiàng)在前權(quán)利要求所述的基因表達(dá)系統(tǒng),其中第二表達(dá)單元的轉(zhuǎn)錄因子是 tTA或變體并且所述第一表達(dá)單元包括tet操縱子(tetO)。
11. 根據(jù)任一項(xiàng)在前權(quán)利要求所述的基因表達(dá)系統(tǒng),其中所述節(jié)肢動(dòng)物是昆蟲(chóng),優(yōu)選雙 翅目(Dipteran),包括實(shí)蠅科(Tephritid),如地中海果蠅或橄欖果蠅。
12. 根據(jù)任一項(xiàng)在前權(quán)利要求所述的基因表達(dá)系統(tǒng),其中所述效應(yīng)物是核酸酶并賦予 或給予父本效應(yīng)致死性。
13. -種在性腺或精子中表達(dá)效應(yīng)物蛋白的方法,所述方法包括用根據(jù)任一項(xiàng)在前權(quán) 利要求的表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化所述性腺。
14. 一種群體控制的方法,所述方法包括在雄性節(jié)肢動(dòng)物的性腺中表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求 1-12任一項(xiàng)所述的表達(dá)系統(tǒng)的效應(yīng)物蛋白。
15. -種抗性管理方法,所述方法包括使用根據(jù)權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述的表達(dá)系 統(tǒng)。
16. -種質(zhì)量控制方法,所述方法包括:包括報(bào)道分子如熒光蛋白作為根據(jù)權(quán)利要求 1-12任一項(xiàng)所述的表達(dá)系統(tǒng)中的效應(yīng)物蛋白,或在根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的表達(dá)系 統(tǒng)中的效應(yīng)物蛋白之外包括報(bào)道分子如熒光蛋白,從而來(lái)自所述系統(tǒng)的表達(dá)被誘導(dǎo)或去抑 制的個(gè)體在合適波長(zhǎng)的光下變得可見(jiàn)。
17. -種確定雌性節(jié)肢動(dòng)物的交配狀況的方法,所述方法包括在轉(zhuǎn)基因雄性群體中使 用根據(jù)權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述的表達(dá)系統(tǒng),其中所述系統(tǒng)包含標(biāo)記如熒光報(bào)道蛋白;并 且精子存在時(shí),測(cè)定雌性中所述標(biāo)記的存在;標(biāo)記的存在表示雌性已經(jīng)與攜帶所述系統(tǒng)的 轉(zhuǎn)基因雄性交配。
【文檔編號(hào)】C12N15/85GK104271747SQ201380023783
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2013年3月5日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月5日
【發(fā)明者】L·阿爾菲 申請(qǐng)人:奧西泰克有限公司
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