核酸的檢測方法及核酸檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種核酸的檢測方法，所述核酸的檢測方法能夠抑制在采用后染法的標(biāo)記化工序中雜交至捕獲探針上的靶核酸從支持體的脫離，并且與使用鈉離子的方法相比能夠以更低濃度且同等以上的靈敏度檢測靶核酸。所述靶核酸的檢測方法包括以下工序：(1)使捕獲探針與靶核酸雜交、形成雙鏈核酸的工序；使所形成的雙鏈核酸與含有標(biāo)記物及濃度10mM以上的二價金屬陽離子的溶液接觸、將該標(biāo)記物導(dǎo)入該雙鏈核酸中的工序；和對被導(dǎo)入所述雙鏈核酸中的所述標(biāo)記物進(jìn)行檢測的工序。
【專利說明】核酸的檢測方法及核酸檢測試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及利用了捕獲探針與核酸的雜交的核酸的檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 已經(jīng)開始了對各種生物的遺傳信息分析的研究，關(guān)于以人類基因為代表的多種基 因及其堿基序列、以及基因序列編碼的蛋白質(zhì)及由這些蛋白質(zhì)派生的糖鏈的信息正被迅速 闡明。對于序列已明確的基因、蛋白質(zhì)、糖鏈等生物高分子的功能，可以采用各種方法來研 究。作為主要的方法，對于核酸，可以像Northern印跡法或Southern印跡法這樣利用各種 的核酸/核酸之間的互補(bǔ)性來研究各種基因與其生物功能表達(dá)之間的關(guān)系。對于蛋白質(zhì)， 可以像Western印跡法為代表的方法那樣利用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的反應(yīng)來研究蛋白質(zhì)的 功能及表達(dá)。
[0003] 尤其是，對于基因診斷、病原菌的鑒定、或者單核苷酸多態(tài)性的檢測等，出于檢測 想要研究的核酸（靶核酸）的目的，采用包含核酸的捕獲探針。近年來，使用在支持體上固 定了多個捕獲探針的DNA芯片、DNA微陣列，用于對多種靶核酸的同時檢測。具體而言，使 被固定化于支持體上的捕獲探針與靶核酸接觸，通過捕獲探針與靶核酸有無雜交來研究互 補(bǔ)性，由此可以研究靶核酸的序列。關(guān)于靶核酸的雜交，例如通常采用以下方法：將標(biāo)記物 導(dǎo)入至靶核酸，使其與捕獲探針接觸后，檢測該標(biāo)記物的信號。
[0004] 作為向靶核酸中導(dǎo)入標(biāo)記物的方法，有在使其與捕獲探針雜交前導(dǎo)入的方法和在 雜交后導(dǎo)入的方法。其中，后者被稱為后染法，是使經(jīng)雜交的靶核酸與標(biāo)記物接觸而導(dǎo)入標(biāo) 記物的方法，由于在雜交后使其與標(biāo)記物結(jié)合，所以可以使用尺寸較大的標(biāo)記物，此外，為 了放大檢測信號，可以重復(fù)進(jìn)行標(biāo)記化工序（專利文獻(xiàn)1、2)。而且，在后染法的標(biāo)記化工序 中使用含有500?lOOOmM左右的高濃度的鈉離子等一價金屬陽離子的標(biāo)記液是已知的。
[0005] 另一方面，已知二價金屬陽離子是能活化各種核酸酶的物質(zhì)，因此，在進(jìn)行利用雜 交的核酸檢測方法時，已避免主動地使用二價金屬陽離子，也尚無在后染法的標(biāo)記化工序 中使用二價金屬陽離子的技術(shù)構(gòu)思。
[0006] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0007] 專利文獻(xiàn)
[0008] 專利文獻(xiàn)1 :日本特開2011-188837號公報
[0009] 專利文獻(xiàn)2 :日本特開2003-52383號公報


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 在利用后染法的靶核酸的標(biāo)記化中，需要清洗、除去未導(dǎo)入靶核酸中的標(biāo)記物，但 本發(fā)明人對以往的利用后染法的、對雜交至被固定化于支持體上的捕獲探針上的靶核酸的 標(biāo)記化進(jìn)行了檢驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)如下問題：在將標(biāo)記物導(dǎo)入靶核酸中時、或在清洗?除去未被 導(dǎo)入靶核酸中的標(biāo)記物時，雜交至捕獲探針上的靶核酸脫落，其結(jié)果導(dǎo)致檢測信號減弱。
[0011] 此外，本發(fā)明人的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),利用以往的標(biāo)記液中含有的500?lOOOmM左右 的高濃度鈉離子可以抑制一定程度的靶核酸的脫落，但是從試劑用量的削減、檢測靈敏度 的提高的觀點考慮，找到與鈉離子相比可以以更低濃度抑制同等以上的靶核酸脫落的物質(zhì) 成為課題。
[0012] S卩，本發(fā)明的目的在于，找到除了鈉離子以外的、能抑制雜交至捕獲探針上的靶核 酸在采用后染法的標(biāo)記化工序中從支持體脫離的物質(zhì)，并且提供與鈉離子相比能夠以更低 濃度且以同等以上的靈敏度檢測靶核酸的核酸的檢測方法。
[0013] 本發(fā)明人進(jìn)行了潛心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過在雜交至捕獲探針上的靶核酸的標(biāo)記 化工序中使用含有二價金屬陽離子（其是核酸的雜交工序中所避免的）的溶液，可以抑制 清洗?除去未被導(dǎo)入靶核酸中的標(biāo)記物時的靶核酸的脫離，其結(jié)果，與使用鈉離子的情況相 t匕，可以使檢測信號達(dá)到同等以上，由此完成了本發(fā)明。
[0014] 即，本發(fā)明由以下的⑴?（13)構(gòu)成：
[0015] (1)一種靶核酸的檢測方法，所述方法包括以下工序：
[0016] 使捕獲探針與靶核酸雜交、形成雙鏈核酸的工序；
[0017] 使所形成的雙鏈核酸與含有標(biāo)記物及濃度為10mM以上的二價金屬陽離子的溶液 接觸、將該標(biāo)記物導(dǎo)入該雙鏈核酸中的工序；和
[0018] 對被導(dǎo)入至所述雙鏈核酸中的所述標(biāo)記物進(jìn)行檢測的工序。
[0019] (2)如（1)所述的方法，其中，所述捕獲探針被固定化于支持體上。
[0020] (3)如⑴或⑵所述的方法，其中，所述二價金屬陽離子為選自由鎂離子、鋅離 子、錳離子及鈣離子組成的組中的至少1種。
[0021] (4)如⑴?（3)中任一項所述的方法，其中，所述溶液中的二價金屬陽離子濃度 為50mM以上。
[0022] (5)如⑴?⑷中任一項所述的方法，其中，所述標(biāo)記物為熒光物質(zhì)。
[0023] (6)如⑴?（5)中任一項所述的方法，其中，所述標(biāo)記物向所述靶核酸中的導(dǎo)入 利用親和素-生物素相互作用來進(jìn)行。
[0024] (7)如（6)所述的方法，其中，所述靶核酸已被生物素化，所述標(biāo)記物的導(dǎo)入通過 使標(biāo)記親和素或標(biāo)記鏈親和素與所述靶核酸上的生物素相互作用來進(jìn)行。
[0025] (8)如⑴?（5)中任一項所述的方法，其中，標(biāo)記物向所述靶核酸中的導(dǎo)入如下 進(jìn)行：使將與所述雜交得到的雙鏈核酸發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的經(jīng)標(biāo)記的抗體或其抗原結(jié)合性 片段與所述雙鏈核酸發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。
[0026] (9)如（1)、⑶?（7)中任一項所述的方法，其中，在使所述捕獲探針與所述靶核 酸雜交的工序中，所述捕獲探針處于未被固定在支持體上的游離狀態(tài)，將所述捕獲探針與 所述靶核酸雜交得到的雙鏈核酸固定化在支持體上。
[0027] (10)如（9)所述的方法，其中，所述雙鏈核酸向所述支持體上的固定化如下進(jìn)行： 使將與所述雙鏈核酸發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的、被固定化于支持體上的抗體或其抗原結(jié)合性片 段與所述雙鏈核酸發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。
[0028] (11) -種核酸檢測試劑盒，其包含捕獲探針及含有濃度為10mM以上的二價金屬 陽離子的試劑。
[0029] (12) -種核酸檢測試劑盒，其包含固定了捕獲探針的支持體及含有濃度為10mM 以上的二價金屬陽離子的試劑。
[0030] (13)如權(quán)利要求11或12所述的試劑盒，其中，含有二價金屬陽離子的所述試劑含 有該二價金屬陽離子和標(biāo)記物。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明，能夠以高靈敏度且重現(xiàn)性良好地檢測雜交至捕獲探針上的靶核酸。

【具體實施方式】
[0032]作為供給至本發(fā)明的檢測方法中的靶核酸，可以舉出例如病原菌或病毒等的基 因、或遺傳疾病的病源基因等以及它們的一部分等，但并不限定于這些。此外，作為包含這 些靶核酸的待測試樣，可以舉出血液、血清、血漿、尿、糞便、腦脊液、唾液、拭子液、各種組織 液等體液、或各種組織、石蠟包埋待測試樣（FFPE)及其切片、各種飲食品以及它們的稀釋 物等，但并不限定于這些。此外，作為被測物質(zhì)的靶核酸可以為通過常規(guī)方法從血液或細(xì)胞 中提取的核酸，也可以使用從待測試樣中提取的DNA或RNA等。作為DNA，可以使用標(biāo)記化 的DNA，病毒DNA，細(xì)菌、霉菌等的DNA，對RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄而得的cDNA，作為它們的一部分的 片段等，但并不限定于這些。作為RNA，可以使用信使RNA(mRNA)、核糖體RNA(rRNA)、小RNA 或作為它們的一部分的片段等，但并不限定于這些。此外，化學(xué)合成的DNA或RNA等也可以 用作為祀核酸。
[0033]關(guān)于支持體，可以使用載玻片或樹脂基板、膜（membrane)、珠粒（beads)等。對 于支持體的材質(zhì)，沒有特別限定，可以舉出玻璃、陶瓷、硅等無機(jī)材料，聚對苯二甲酸乙二醇 酯、乙酸纖維素、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚硅氧烷橡膠等聚合物等。
[0034]捕獲探針是指能夠與被測樣品中包含的靶核酸直接地選擇性結(jié)合的物質(zhì)。在本 發(fā)明的檢測祀核酸的方法中，具體而言，可以使用DNA、RNA、PNA(肽核酸，PeptideNucleic Acid)、LNA(鎖核酸，LockedNucleicAcid)、ENA(亞乙基橋聯(lián)核酸，Ethylene-Bridged NucleicAcid)等核酸衍生物。此處，在核酸的情況下，衍生物表示化學(xué)修飾衍生物，其包括 利用熒光物質(zhì)等得到的標(biāo)記化衍生物、經(jīng)修飾的核苷酸（例如，含有鹵素、甲基等烷基、甲 氧基等烷氧基、硫代、羧甲基等基團(tuán)的核苷酸，及經(jīng)歷了堿基重構(gòu)、雙鍵的飽和、脫氨基化、 氧分子取代為硫分子等的核苷酸等）的衍生物等。
[0035] 由于具有特定堿基序列的單鏈核酸能夠與具有與該堿基序列或其一部分互補(bǔ)的 堿基序列的單鏈核酸選擇性地雜交并結(jié)合，所以屬于本發(fā)明中所稱的捕獲探針。本發(fā)明中 使用的捕獲探針可以為市售品，也可以為從生物細(xì)胞等中獲得的物質(zhì)。作為捕獲探針，特別 優(yōu)選核酸。上述核酸中，被稱為低聚核酸的、長度為200個堿基以下的核酸可以利用合成儀 容易地人工合成。
[0036]作為將捕獲探針固定化于支持體上的方法，已知在支持體的上表面部合成捕獲探 針的方法、和將預(yù)先合成的捕獲探針滴加至支持體的上表面部并進(jìn)行固定的方法。作為在 支持體的上表面部合成捕獲探針的方法，有Ronald等人的方法（美國專利第5705610號說 明書）、Michel等人的方法（美國專利第6142266號說明書）、Francesco等人的方法（美 國專利第7037659號說明書）。這些方法中，在捕獲探針合成反應(yīng)時使用有機(jī)溶劑，因此希 望載體為對有機(jī)溶劑具有耐受性的材質(zhì)，可以使用例如采用日本特表平10-503841號公報 中記載的方法制作的具有凹凸結(jié)構(gòu)的玻璃支持體。特別地，在Francesco等人的方法中，從 支持體的背面照射光以控制捕獲探針的合成，因此，支持體優(yōu)選為具有透光性的材質(zhì)。作為 將捕獲探針滴加至支持體的上表面部并進(jìn)行固定的方法，可以采用廣田等人的方法（日本 專利第3922454號說明書）和玻璃毛細(xì)管。作為玻璃毛細(xì)管的一個例子，可以采用自制的 玻璃毛細(xì)管或微量移液器（株式會社MicroSupport制，MP-005)等市售產(chǎn)品，但并不限定 于這些方法。
[0037] 本發(fā)明的特征在于，在利用使捕獲探針與靶核酸雜交的核酸的檢測方法中，通過 使雜交至捕獲探針上的核酸與含有標(biāo)記物及二價金屬陽離子的溶液接觸，將標(biāo)記物導(dǎo)入至 該經(jīng)雜交的核酸。以下，對雜交工序和標(biāo)記物的導(dǎo)入工序進(jìn)行說明。
[0038] 捕獲探針與靶核酸的雜交可以采用其本身公知的方法來進(jìn)行。關(guān)于捕獲探針與 靶核酸雜交時的嚴(yán)格度，已知其為溫度、鹽濃度、探針的鏈長、探針的核苷酸序列的GC含量 及雜交緩沖液中的離液劑（chaotropicagent)的濃度的函數(shù)，可以采用例如Sambrook，J. etal. (1998)MolecularCloning:ALaboratoryManual(第二版），ColdSpringHarbor LaboratoryPress,NewYork中所記載的條件等。嚴(yán)格的溫度條件為約30°C以上，通常為 10?70°C左右。作為其他條件，有雜交時間、清洗劑（例如十二烷基硫酸鈉（SDS))的濃度、 以及有無運(yùn)載體DNAGarrierDNA)等，通過組合這些條件，可以設(shè)定各種嚴(yán)格度。本領(lǐng)域 技術(shù)人員可適當(dāng)?shù)卮_定用于獲得作為下述捕獲探針的功能的條件，所述捕獲探針是為檢測 所期望的靶核酸而準(zhǔn)備的。
[0039] 捕獲探針與靶核酸的雜交可以在將捕獲探針固定化于支持體上的狀態(tài)下進(jìn)行，也 可以在雜交后將其固定在支持體上。作為雜交后的捕獲探針的固定化方法，可以使用例如 與和靶核酸形成的雙鏈特異性結(jié)合（發(fā)生抗原抗體反應(yīng)）的、固相化了的抗體或其抗原結(jié) 合性片段（Fab片段或F(ab'）2片段等）來進(jìn)行（參見下述實施例）。
[0040] 將標(biāo)記物導(dǎo)入與捕獲探針雜交了的靶核酸中的方法可以采用其本身公知的方法 來進(jìn)行，例如，可以舉出如下方法：使含有標(biāo)記物和二價金屬陽離子的溶液與靶核酸接觸之 后，利用化學(xué)反應(yīng)、酶反應(yīng)、核酸雜交等導(dǎo)入標(biāo)記物的方法；利用化學(xué)反應(yīng)、酶反應(yīng)、核酸雜 交等向靶核酸中導(dǎo)入反應(yīng)性官能團(tuán)，使該官能團(tuán)與含有標(biāo)記物和二價金屬陽離子的溶液接 觸之后、與標(biāo)記物的官能團(tuán)反應(yīng)從而導(dǎo)入的方法。例如，利用酶反應(yīng)向靶核酸中導(dǎo)入具有氨 基的核酸，通過使其與具有與該氨基反應(yīng)的琥珀酰亞胺基的標(biāo)記物反應(yīng)，從而能夠?qū)霕?biāo) 記物。此外，采用同樣的方法，通過將生物素導(dǎo)入包含靶核酸的雙鏈核酸中，使其與經(jīng)標(biāo)記 的親和素或鏈親和素接觸，由此能夠經(jīng)由親和素-生物素反應(yīng)導(dǎo)入標(biāo)記物。此外，通過與 插入到由靶核酸與核酸探針雜交形成的雙鏈部分的嵌入型標(biāo)記物接觸，由此能夠?qū)霕?biāo)記 物。此外，還可以采用與雙鏈發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的抗體或其抗原結(jié)合性片段（Fab片段或 F(ab'）2片段等）進(jìn)行（參見下述實施例）。
[0041] 作為本發(fā)明中可以使用的標(biāo)記物，可以使用有機(jī)熒光染料、磷光染料、量子點 (dot)、熒光蛋白等熒光物質(zhì)或放射性同位素，能夠給出?接受電子的氧化還原類物質(zhì)、以及 結(jié)合了堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶等酶的物質(zhì)。此外，在這些標(biāo)記物中，從檢測的靈敏度 方面或簡便性來看可以優(yōu)選使用熒光物質(zhì)。
[0042]作為有機(jī)熒光染料，可以列舉花菁（cyanine)(花菁2)、氨基甲基香豆素 (aminomethylcoumarin)、突光素、卩引哚碳菁（indocarbocyanine)(花菁 3)、花菁 3. 5、四 甲基羅丹明、羅丹明紅、德克薩斯紅、吲哚碳菁（花菁5)、花菁5. 5、花菁7、Oyster染料、 B0DIPY類染料等。此外，作為嵌入型的熒光染料，可以舉出溴化乙錠、吖啶橙等；作為熒光 性的蛋白質(zhì)，可以舉出藻紅蛋白（phycoerythrin) (PE)、別藻藍(lán)蛋白（allophycocyanin) (APC)、綠色熒光蛋白（GFP)、紅色熒光蛋白（RFP)等已知的熒光物質(zhì)。
[0043] 此外，作為熒光物質(zhì)，還可以使用具有發(fā)光性的半導(dǎo)體微粒。作為這樣的半導(dǎo)體微 粒，可以舉出例如硒化鎘（CdSe)、硫化鎘（CdS)、碲化鎘（CdTe)、磷化鎵銦（InGaP)、黃銅礦 類微粒、硅（Si)等。熒光信號的檢測可以采用熒光顯微鏡或熒光掃描儀等進(jìn)行。
[0044] 如下文所述，向雙鏈核酸中導(dǎo)入標(biāo)記物后，需要清洗?除去未被導(dǎo)入雙鏈核酸中的 標(biāo)記物，從提高檢測靈敏度的觀點考慮，抑制清洗?除去標(biāo)記物時靶核酸從導(dǎo)入了標(biāo)記物的 雙鏈核酸的脫離是重要的，本發(fā)明中，通過使用含有標(biāo)記物和二價金屬陽離子的溶液導(dǎo)入 標(biāo)記物，由此能夠顯著地抑制由清洗?除去標(biāo)記物導(dǎo)致的靶核酸的脫離。
[0045] 二價金屬陽離子是指在溶液中能夠釋放2個電子而形成二價陽離子的元素?絡(luò)合 物，可以舉出由鈹離子、鎂離子、鈣離子、鍶離子、鋇離子、鐳離子等堿土金屬離子或錳離子、 鈷離子、鋅離子等過渡金屬構(gòu)成的單原子離子，及硫氰合鐵（III)離子、四氨合鋅（II)離 子、六氨合鎳（II)離子等絡(luò)離子。其中，考慮到在水中的溶解性和環(huán)境負(fù)荷的話，優(yōu)選為選 自由鎂離子、鋅離子、錳離子及鈣離子組成的組中的至少1種以上，考慮到與雙鏈核酸的結(jié) 合穩(wěn)定性的話，特別優(yōu)選鎂離子、錳離子。
[0046] 所述溶液中的二價金屬陽離子濃度為10mM以上，但從核酸的檢測信號強(qiáng)度的觀 點考慮，優(yōu)選為50mM以上，更優(yōu)選為lOOmM以上。此外，從試劑量的削減以及溶液中的金屬 陽離子析出導(dǎo)致的噪聲增加的觀點考慮，優(yōu)選為低于500mM。
[0047] 接著，優(yōu)選地，清洗除去未被導(dǎo)入雙鏈核酸中的標(biāo)記物。該清洗除去工序本身可以 采用其本身公知的方法來進(jìn)行。例如，可以使用含有表面活性劑（優(yōu)選為Tween(商品名） 系列等非離子性表面活性劑）的緩沖液（例如SSC等檸檬酸緩沖液）作為清洗液，在比雜 交的溫度通常低:TC?10°C左右的溫度下清洗1分鐘?10分鐘。
[0048] 接著，對被導(dǎo)入雙鏈核酸中的標(biāo)記物進(jìn)行檢測。關(guān)于檢測工序本身，其可以采用公 知的方法來進(jìn)行，能夠通過檢測被導(dǎo)入雙鏈核酸中的標(biāo)記物的信號來進(jìn)行。將檢測到的信 號與背景噪聲進(jìn)行比較。具體而言，對從固定有捕獲探針的位置得到的信號值與從這以外 的位置得到的信號值加以比較，前者的數(shù)值較高時，認(rèn)為檢測到了靶核酸。信號值的測定可 以采用對于各標(biāo)記而言公知的方法來進(jìn)行，用于此的裝置也有各種各樣已被市售，因此可 以使用市售的測定裝置容易地進(jìn)行。例如，當(dāng)標(biāo)記是熒光標(biāo)記時，可以使用市售的DNA芯片 掃描儀等容易地進(jìn)行。需要說明的是，有時通過測定信號值也能夠?qū)崿F(xiàn)對靶核酸的定量，但 對靶核酸的定量必然伴隨著對靶核酸的檢測，因此，對靶核酸進(jìn)行定量的情況也包含在本 發(fā)明的檢測方法中。
[0049] 接下來，對本發(fā)明的核酸的檢測試劑盒的優(yōu)選實施方式進(jìn)行說明。本發(fā)明的核酸 的檢測試劑盒至少具有：捕獲探針及含有二價金屬陽離子的試劑。所述含有二價金屬陽離 子的試劑優(yōu)選為含有該二價金屬陽離子和標(biāo)記物的試劑。此外，捕獲探針也可以被固定化 于支持體上。本發(fā)明的檢測試劑盒中所包含的固定化有捕獲探針的支持體為將所述捕獲 探針固定化于所述支持體上而得到的。此外，本發(fā)明的試劑盒中所包含的含有二價金屬陽 離子的試劑可以為干燥狀態(tài)，也可以為溶液狀態(tài)，為干燥狀態(tài)時，可以包含用于溶解其的溶 齊U。此外，作為本發(fā)明的檢測試劑盒中可以包含的試劑，可以舉出含有所述標(biāo)記物的試劑、 pH調(diào)節(jié)用試劑、表面活性劑、含有用于防止標(biāo)記物吸附在支持體上的蛋白質(zhì)或核酸的試劑 等，這些試劑可以為干燥狀態(tài)，也可以為溶液狀態(tài)，可以為各自獨立的試劑，也可以為適當(dāng) 混合而成的試劑，為干燥狀態(tài)時，可以包含用于溶解它們的溶劑。
[0050] 通過下述實施例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明。但是，本發(fā)明并不由這些實施例限 定技術(shù)范圍。
[0051]實施例1
[0052] (l)DNA芯片的制作
[0053] 關(guān)于捕獲探針，通過Operon公司委托合成了在5'末端經(jīng)氨基修飾的寡DNA。捕獲 探針的堿基序列示于表1中。將該捕獲探針固定于東麗株式會社制的"3D-Gene"基板（256 柱基板）上，用作評價用DNA芯片。
[0054] (2)靶核酸的制備
[0055] 作為靶核酸，通過Operon公司委托合成具有與捕獲探針互補(bǔ)的序列、且在5'末端 導(dǎo)入了生物素的30個堿基的寡DNA(表1)。靶核酸的堿基序列示于表1中。用IX雜交溶 液（如下文所述）將該寡DNA稀釋至200fmol/L，作為待測試樣DNA。
[0056]表1
[0057]
[0058] (3)雜交

【權(quán)利要求】
1. 一種靶核酸的檢測方法，所述方法包括以下工序： 使捕獲探針與靶核酸雜交、形成雙鏈核酸的工序； 使所形成的雙鏈核酸與含有標(biāo)記物及濃度10mM以上的二價金屬陽離子的溶液接觸、 將該標(biāo)記物導(dǎo)入該雙鏈核酸中的工序；和 對被導(dǎo)入至所述雙鏈核酸中的所述標(biāo)記物進(jìn)行檢測的工序。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述捕獲探針被固定化于支持體上。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述二價金屬陽離子為選自由鎂離子、鋅離子、 錳離子及鈣離子組成的組中的至少1種。
4. 如權(quán)利要求1?3中任一項所述的方法，其中，所述溶液中的二價金屬陽離子濃度為 50mM以上。
5. 如權(quán)利要求1?4中任一項所述的方法，其中，所述標(biāo)記物為熒光物質(zhì)。
6. 如權(quán)利要求1?5中任一項所述的方法，其中，所述標(biāo)記物向所述靶核酸中的導(dǎo)入利 用親和素-生物素相互作用來進(jìn)行。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述靶核酸已被生物素化，所述標(biāo)記物的導(dǎo)入通過 使標(biāo)記親和素或標(biāo)記鏈親和素與所述靶核酸上的生物素相互作用來進(jìn)行。
8. 如權(quán)利要求1?5中任一項所述的方法，其中，標(biāo)記物向所述靶核酸中的導(dǎo)入如下進(jìn) 行：使將與所述雜交得到的雙鏈核酸發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的經(jīng)標(biāo)記的抗體或其抗原結(jié)合性片 段與所述雙鏈核酸發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。
9. 如權(quán)利要求1、3?7中任一項所述的方法，其中，在使所述捕獲探針與所述靶核酸雜 交的工序中，所述捕獲探針處于未被固定在支持體上的游離狀態(tài)，將所述捕獲探針與所述 靶核酸雜交得到的雙鏈核酸固定化于支持體上。
10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述雙鏈核酸向所述支持體上的固定化如下進(jìn) 行：使將與該雙鏈核酸發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的、被固定化于支持體上的抗體或其抗原結(jié)合性 片段與所述雙鏈核酸發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。
11. 一種核酸檢測試劑盒，其包含捕獲探針及下述試劑，所述試劑含有濃度為10mM以 上的二價金屬陽離子。
12. -種核酸檢測試劑盒，其包含固定了捕獲探針的支持體及下述試劑，所述試劑含有 濃度為l〇mM以上的二價金屬陽離子。
13. 如權(quán)利要求11或12所述的試劑盒，其中，含有二價金屬陽離子的所述試劑含有該 二價金屬陽離子和標(biāo)記物。
【文檔編號】C12N15/09GK104271771SQ201380023524
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2013年6月19日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月20日
【發(fā)明者】中村史夫, 上田洋二, 有家隆文 申請人:東麗株式會社