專利名稱：大黃魚刺激隱核蟲的lamp檢測試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及刺激隱核蟲的檢測技術(shù)，具體涉及大黃魚刺激隱核蟲的LAMP檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
刺激隱核蟲iCiyptocaiyon irriia/^)是一種寄生于海水硬骨魚類皮膚和鰓上皮組織的纖毛蟲，引起魚的活動異常、上皮增生、呼吸困難以及機(jī)械損傷，繼而帶來病菌的繼發(fā)感染。已被列為農(nóng)業(yè)部2008年12月發(fā)布的新版“一、二、三類動物疫病病種名錄”，其所引發(fā)的“白點(diǎn)病”及繼發(fā)性細(xì)菌性感染(白鰓病、細(xì)菌性潰瘍等)給我國海水養(yǎng)殖帶來巨大損失，如2009年，整個寧德市均爆發(fā)了大規(guī)模大黃魚刺激隱核蟲病，蕉城區(qū)的發(fā)病率竟達(dá) 100%，全市損失超過2億元。2009年10月底寧波象山也爆發(fā)了大規(guī)模的刺激隱核蟲病，大黃魚的死亡率達(dá)90%以上，經(jīng)濟(jì)損失慘重。因此預(yù)先分析、檢測確定發(fā)病病原體就顯得尤為重要。目前檢測刺激隱核蟲感染的方法主要包括組織病理學(xué)觀察、顯微鏡檢以及PCR等生物技術(shù)診斷方法。但是組織病理學(xué)觀察、顯微鏡檢這些傳統(tǒng)檢測方法有時候并不能嚴(yán)格的區(qū)分感染刺激隱核蟲與感染癥狀相似的其他寄生蟲，缺乏靈敏度和特異性。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)雖具有極高的靈敏度和特異性，已被應(yīng)用于多種寄生蟲病的診斷實(shí)踐，但其需要 PCR儀等諸多精密儀器的配套使用，使其無法滿足現(xiàn)場和基層檢驗(yàn)的需要。為有效控制大黃魚刺激隱核蟲病，需建立靈敏、高效和簡便的檢測技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供大黃魚刺激隱核蟲的LAMP檢測試劑盒，該 LAMP檢測試劑盒具有高靈敏度、高特異性、適用于海水養(yǎng)殖場中大黃魚刺激隱核蟲病的現(xiàn)場快速檢測；應(yīng)用該LAMP檢測試劑盒的檢測大黃魚寄生蟲的方法具有操作簡單，對儀器要求簡單，結(jié)果易于觀察等優(yōu)點(diǎn)，為刺激隱核蟲病的早期防治提供技術(shù)支持。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為大黃魚刺激隱核蟲的LAMP檢測試劑盒，包括IOXThermoPol反應(yīng)緩沖液、濃度為IOOmM的MgSO4溶液、濃度為10 mM的 dNTP液、濃度為8 U / μ L的Bst DNA聚合酶液、FIP / BIP引物溶液、F3 / Β3引物溶液和雙蒸水，所述FIP / BIP引物溶液含有FIP引物和BIP引物，所述FIP引物的核苷酸序列為ACTCGAAATC GGTAGGAGCG TGTACTGATT ACGTCCCTG,所述 BIP 引物的核苷酸序列為 GATCCGGTGA ACCTTCTGGA TCCTTCCTCT AAGTGAAGTG,所述 FIP 引物和所述 BIP 引物的濃度都為1.6 2.4μM，所述F3 / Β3引物溶液含有F3引物和Β3引物，所述F3引物的核苷酸序列為AAGTGCAAGT CATCAGCT，所述B3引物的核苷酸序列為CGGAAACCTT GTTACGACT,所述 F3引物和B3引物都為0. 4 0.6 μ M。該LAMP檢測試劑盒可以為100 X 25 μ 1反應(yīng)體系10 X ThermPol緩沖液2. 5 μ 1， dNTP 溶液 2.0 μ 1，Bst DNA 聚合酶液 1. 0 μ 1，MgSO4 溶液 0. 5 μ 1，F(xiàn)IP / BIP 引物溶液 0.5 μ 1, F3 / Β3引物溶液0. 5μ1，樣品DNA模板1 μ 1，余量用雙蒸水補(bǔ)足。ThermoPol反應(yīng)緩沖液(含 200mMTris-Hcl，100 mM KCl, 20 mM MgSO4 ； 100 mM (NH4)2SO4 ； 1. 0 % TritonX-IOO ；8M betaine)、dNTP 液和 Bst DNA 聚合酶液均購于 TaKaRa 公司。該LAMP檢測試劑盒還可以有陽性對照液和陰性對照液，陽性對照液含有刺激隱核蟲陽性DNA，陰性對照液為雙蒸水，用以對比、驗(yàn)證檢測。該LAMP檢測試劑盒的檢測方法，包括下述步驟
A、取寄生大黃魚的蟲體5(Γ150μ g用450 μ 1的TE緩沖液洗滌離心一次，倒掉上清液， 蟲體中再加入所述TE緩沖液450μ 1，濃度為20mg/mL的蛋白酶K溶液3μ 1，質(zhì)量百分濃度為20%的十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液20 μ 1，混勻，于37°C首次溫浴30min，首次溫浴結(jié)束， 加入濃度為5mol/L的NaCl溶液100 μ 1，溴化十六烷三甲基銨-氯化鈉混合液80 μ 1，混勻，于65°C再次溫浴lOmin，得到蟲體溫浴液，所述TE緩沖液的pH 8. 0，所述TE緩沖液中三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)的濃度為lOmmol/L，乙二胺四乙酸(EDTA)的濃度為 lmmol/L，所述溴化十六烷三甲基銨-氯化鈉混合液中溴化十六烷三甲基銨(CTAB)的質(zhì)量百分濃度為10%，NaCl的濃度為0. 7mol/L ；TE緩沖液可以自配，也可以從TaKaRa公司等購買，蛋白酶K溶液購于TaKaRa公司；
B、再次溫浴結(jié)束，蟲體溫浴液中加入與該蟲體溫浴液等體積的氯仿-異戊醇混合液， 混勻，10000r/min離心5min，保留上清，所述氯仿-異戊醇混合液中氯仿與異戊醇體積比為 24:1 ；
C、上述上清中加入與該上清等體積的酚-氯仿-異戊醇混合液混勻，10000r/min離心 5min,所得上清繼續(xù)用與所得上清等體積的所述酚-氯仿-異戊醇混合液混勻，10000r/min 離心5min，如此重復(fù)混勻、離心至無白色物質(zhì)為止，得到去雜上清，所述酚-氯仿-異戊醇混合液中酚、氯仿與異戊醇的體積比為25:24:1 ；
D、在上述去雜上清中加入該去雜上清兩倍體積的無水乙醇，室溫放置纊12min，然后在 40C，15000r/min離心20min，棄上清，沉淀用質(zhì)量百分濃度為70%的乙醇洗滌兩次，然后在空氣中晾曬5 20min，再加入所述TE緩沖液20 μ 1，_20°C保存，得到樣品DNA模板；
E、取樣品DNA模板1μ 1，與所述大黃魚刺激隱核蟲的LAMP檢測試劑盒組成25 μ 1反應(yīng)體系10 X ThermPol 緩沖液 2. 5 μ 1，dNTP 溶液 2. O μ 1，Bst DNA 聚合酶液 1. O μ 1，MgSO4 溶液0. 5μ1，ΡΙΡ / BIP引物溶液0. 5μ1，F(xiàn)3 / Β3引物溶液0. 5μ1，樣品DNA模板Ιμ ， 余量用雙蒸水補(bǔ)足；60 63°C下反應(yīng)，反應(yīng)完畢出現(xiàn)白色沉淀或反應(yīng)液渾濁則該蟲體為刺激隱核蟲。若反應(yīng)液清澈也未出現(xiàn)白色沉淀則不是刺激隱核蟲。有條件也可以取4.0μ1 的清澈與渾濁之間的反應(yīng)液，進(jìn)一步用經(jīng)溴化乙錠(EB)染色后的1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳， 在紫外燈下分析擴(kuò)增結(jié)果，顯示階梯狀的特異性條帶為陽性，無條帶為陰性。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于大黃魚刺激隱核蟲的LAMP檢測試劑盒及檢測方法，包括反應(yīng)緩沖液、MgSO4溶液、dNTP液、Bst DNA聚合酶液、FIP / BIP引物溶液、F3 / B3引物溶液和雙蒸水，F(xiàn)IP引物的核苷酸序列為ACTCGAAATC GGTAGGAGCG TGTACTGATT ACGTCCCTG, BIP 引物的核苷酸序列為 GATCCGGTGA ACCTTCTGGA TCCTTCCTCT AAGTGAAGTG, F3引物的核苷酸序列為AAGTGCAAGT CATCAGCT，B3引物的核苷酸序列為CGGAAACCTT GTTACGACT ；該LAMP檢測試劑盒對大黃魚刺激隱核蟲具有高靈敏度、高特異性，適用于海水養(yǎng)殖場中大黃魚刺激隱核蟲病的現(xiàn)場快速檢測；用該LAMP檢測試劑盒檢測大黃魚刺激隱核蟲具有操作簡單，對儀器要求簡單，結(jié)果易于觀察等優(yōu)點(diǎn)，為刺激隱核蟲病的早期防治提供技術(shù)支持。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。實(shí)施例1
大黃魚刺激隱核蟲的LAMP檢測試劑盒，包括lOXThermoPol反應(yīng)緩沖液250 μ 1、濃度為IOOmM的MgSO4溶液50 μ 1、濃度為10 mM的dNTP液200 μ 1、濃度為8 U / μ L的Bst DNA聚合酶液100 μ 1、引物濃度都為1.6 2. 4μ M的FIP / BIP引物溶液50 μ 1、濃度都為0.4 0.6μΜ的F3 / Β3引物溶液50 μ 1和雙蒸水2 X 300ml，F(xiàn)IP引物的核苷酸序列為 ACTCGAAATC GGTAGGAGCG TGTACTGATT ACGTCCCTG，BIP 引物的核苷酸序列為 GATCCGGTGA ACCTTCTGGA TCCTTCCTCT AAGTGAAGTG, F3 引物的核苷酸序列為 AAGTGCAAGT CATCAGCT, B3 引物的核苷酸序列為CGGAAACCTT GTTACGACT，F(xiàn)IP引物、BIP引物、F3引物和B3引物是 GENBANK，登陸號JN636814. 1的保守的18S-ITS2基因特異性片段，用primer explorer 4 軟件自動挑選及人工篩選(特異性和靈敏性試驗(yàn))后設(shè)計完成；引物由上海生工合成。實(shí)施例2
取寄生大黃魚的蟲體5(Γ150 μ g或含蟲體的大黃魚組織(肌肉、鰓、粘液等)Ig左右，用 450 μ 1 的 TE 緩沖液(ρΗ 8. 0，Tris-HCl 濃度 10mmol/L，EDTA 濃度 lmmol/L)洗滌離心一次，倒掉上清液，蟲體中再加入TE緩沖液450 μ 1，濃度為20mg/mL的蛋白酶K溶液3 μ 1， 質(zhì)量百分濃度為20%的SDS溶液20 μ 1，混勻，于37°C首次溫浴30min，首次溫浴結(jié)束，加入濃度為5mol/L的NaCl溶液100 μ 1，溴化十六烷三甲基銨-氯化鈉混合液(CTAB濃度10%， NaCl濃度0. 7mol/L ) 80 μ 1，混勻，于65°C再次溫浴lOmin，得到蟲體溫浴液；加入與該蟲體溫浴液等體積的氯仿-異戊醇混合液(體積比1)，混勻，10000r/min離心5min，保留上清，上清用與該上清等體積的酚-氯仿-異戊醇混合液(體積比25:24:1)混勻，IOOOOr/ min離心5min，離心所得上清繼續(xù)重復(fù)用與該所得上清等體積的所述酚_氯仿_異戊醇混合液混勻，10000r/min離心5min，按如此混勻、離心方法，經(jīng)5_6次重復(fù)混勻、離心，溶液已無白色物質(zhì)，得到去雜上清；去雜上清中加入該去雜上清兩倍體積的無水乙醇，室溫放置 8 12min，然后在4°C，15000r/min離心20min，棄上清，沉淀用質(zhì)量百分濃度為70%的乙醇洗滌兩次，然后在空氣中晾曬5 20min，再加入所述TE緩沖液20 μ 1，_20°C保存，得到樣品 DNA模板；取樣品DNA模板1 μ 1，與大黃魚刺激隱核蟲的LAMP檢測試劑盒組成25 μ 1反應(yīng)體系10 X ThermPol 緩沖液 2. 5 μ 1，dNTP 溶液 2. 0 μ 1，Bst DNA 聚合酶液 1. 0 μ 1，MgSO4 溶液0.5 μ 1，F(xiàn)IP / BIP引物溶液0. 5yl，F(xiàn)3 / B3引物溶液0. 5 μ 1，樣品DNA模板1 μ 1，余量用雙蒸水補(bǔ)足；60 63°C下反應(yīng)，反應(yīng)完畢出現(xiàn)白色沉淀或反應(yīng)液渾濁則該蟲體為刺激隱核蟲。實(shí)施例3
取大黃魚刺激隱核蟲，同時以海水養(yǎng)殖常見細(xì)菌哈維氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌及淡水小瓜蟲，瓣體蟲和本尼登蟲等寄生蟲為樣本測試LAMP反應(yīng)的特異性，用實(shí)施例2相同的提取和檢測方法進(jìn)行提取檢測，同時對大黃魚刺激隱核蟲提取的DNA用紫外分光光度計測得提取的刺激隱核蟲基因組DNA濃度，并以此為母液將DNA濃度以10—1 l(T8ng/y 1梯度稀釋，每種濃度取1 μ 1為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。LAMP檢測結(jié)果刺激隱核蟲樣本顯示為陽性，其他樣本均為陰性，表明本發(fā)明的試劑盒與其他海水養(yǎng)殖常見細(xì)菌及寄生蟲無交叉反應(yīng)，說明本發(fā)明的試劑盒對大黃魚刺激隱核蟲特異。LAMP檢測刺激隱核蟲最低檢出量為 10_7 ng/μ 1，說明本發(fā)明的試劑盒對大黃魚刺激隱核蟲靈敏。
權(quán)利要求
1.大黃魚刺激隱核蟲的LAMP檢測試劑盒，包括10XThermoPol反應(yīng)緩沖液、濃度為 IOOmM的MgSO4溶液、濃度為10 mM的dNTP液、濃度為8 U / μ L的Bst DNA聚合酶液、FIP / BIP引物溶液、F3 / Β3引物溶液和雙蒸水，其特征在于所述FIP / BIP引物溶液含有 FIP引物和BIP引物，所述FIP引物的核苷酸序列為ACTCGAAATC GGTAGGAGCG TGTACTGATT ACGTCCCTG,所述 BIP 引物的核苷酸序列為 GATCCGGTGA ACCTTCTGGA TCCTTCCTCT AAGTGAAGTG，所述FIP引物和所述BIP引物的濃度都為1. 6 2. 4μΜ，所述F3 / Β3引物溶液含有F3引物和Β3引物，所述F3引物的核苷酸序列為AAGTGCAAGT CATCAGCT，所述Β3引物的核苷酸序列為CGGAAACCTT GTTACGACT，所述F3引物和Β3引物都為0. 4 0. 6 μ M0
2.利用權(quán)利要求1所述的大黃魚刺激隱核蟲的LAMP檢測試劑盒檢測大黃魚刺激隱核蟲的方法，其特征在于包括下述步驟A、取寄生大黃魚的蟲體5(Γ 50μg，用450μ 1的TE緩沖液洗滌離心一次，倒掉上清液，蟲體中再加入所述TE緩沖液450 μ 1，濃度為20mg/mL的蛋白酶K溶液3 μ 1，質(zhì)量百分濃度為20%的十二烷基硫酸鈉溶液20μ 1，混勻，于37°C首次溫浴30min，首次溫浴結(jié)束，加入濃度為5mol/L的NaCl溶液100 μ 1，溴化十六烷三甲基銨-氯化鈉混合液80 μ 1，混勻， 于65°C再次溫浴lOmin，得到蟲體溫浴液，所述TE緩沖液的pH 8. 0，所述TE緩沖液中三羥甲基氨基甲烷-鹽酸的濃度為lOmmol/L，乙二胺四乙酸的濃度為lmmol/L，所述溴化十六烷三甲基銨-氯化鈉混合液中溴化十六烷三甲基銨的質(zhì)量百分濃度為10%，NaCl的濃度為 0.7mol/L ；B、再次溫浴結(jié)束，在蟲體溫浴液中加入與該蟲體溫浴液等體積的氯仿-異戊醇混合液，混勻，10000r/min離心5min，保留上清，所述氯仿-異戊醇混合液中氯仿與異戊醇體積比為24:1 ；C、上述步驟B的上清中加入該上清等體積的酚-氯仿-異戊醇混合液混勻，IOOOOr/ min離心5min，所得上清繼續(xù)用與所得上清等體積的所述酚-氯仿-異戊醇混合液混勻， lOOOOr/min離心5min，如此重復(fù)混勻、離心至無白色物質(zhì)為止，得到去雜上清，所述酚-氯仿-異戊醇混合液中酚、氯仿與異戊醇的體積比為25:24:1 ；D、在上述去雜上清中加入該去雜上清兩倍體積的無水乙醇，室溫放置纊12min，然后在 40C，15000r/min離心20min，棄上清，沉淀用質(zhì)量百分濃度為70%的乙醇洗滌兩次，然后在空氣中晾曬5 20min，再加入所述TE緩沖液20 μ 1，_20°C保存，得到樣品DNA模板；E、取樣品DNA模板1μ 1，與所述大黃魚刺激隱核蟲的LAMP檢測試劑盒組成25 μ 1反應(yīng)體系10 X ThermPol 緩沖液 2. 5 μ 1，dNTP 溶液 2. O μ 1，Bst DNA 聚合酶液 1. O μ 1，MgSO4 溶液0. 5 μ 1，F(xiàn)IP / BIP引物溶液0. 5 μ 1，F(xiàn)3 / Β3引物溶液0. 5 μ 1，樣品DNA模板1 μ 1， 余量用雙蒸水補(bǔ)足；60 63°C下反應(yīng)，反應(yīng)完畢出現(xiàn)白色沉淀或反應(yīng)液渾濁則該蟲體為刺激隱核蟲。
全文摘要
本發(fā)明公開了大黃魚刺激隱核蟲的LAMP檢測試劑盒及檢測方法，包括反應(yīng)緩沖液、MgSO4溶液、dNTP液、BstDNA聚合酶液、FIP/BIP引物溶液、F3/B3引物溶液和雙蒸水；該LAMP檢測試劑盒對大黃魚刺激隱核蟲具有高靈敏度、高特異性，適用于海水養(yǎng)殖場中大黃魚刺激隱核蟲病的現(xiàn)場快速檢測；用該LAMP檢測試劑盒檢測大黃魚刺激隱核蟲具有操作簡單，對儀器要求簡單，結(jié)果易于觀察等優(yōu)點(diǎn)，為刺激隱核蟲病的早期防治提供技術(shù)支持。
文檔編號C12Q1/68GK102443652SQ201110446008
公開日2012年5月9日 申請日期2011年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月28日
發(fā)明者周旻曦, 張繼挺, 王國良 申請人:寧波大學(xué)