專利名稱：?jiǎn)卧隼钏固厥暇怂釋游鰴z測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及快速檢測(cè)食品中單增李斯特氏菌的試劑盒和方法。
背景技術(shù)：
隨著國(guó)家對(duì)食品安全及進(jìn)出口貿(mào)易的日益重視，對(duì)食品安全檢測(cè)技術(shù)的要求也越來(lái)越高。根據(jù)《國(guó)家中長(zhǎng)期科學(xué)和技術(shù)發(fā)展規(guī)劃綱要O006-2020年)》對(duì)公共安全領(lǐng)域中食品安全與出入境檢驗(yàn)檢疫工作發(fā)展的要求，研究高效、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)已成為該領(lǐng)域課題的主要趨勢(shì)和目標(biāo)之一。根據(jù)世界衛(wèi)生組織掌握的資料，在食源性疾病危險(xiǎn)因素中，微生物性食物中毒仍是首要危害；在我國(guó)，據(jù)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心統(tǒng)計(jì)，我國(guó)流行的食源性疾病中，微生物性食物中毒居首位，2006-2009年間每年所占比例分別為46. 1%,37. 和31. 1%0單增李斯特氏菌是一種人畜共患病的病原菌。它能引起人、畜患病，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多。它廣泛存在于自然界中，食品中存在的單增李斯特氏菌對(duì)人類的安全具有危險(xiǎn)，該菌在4°C的環(huán)境中仍可生長(zhǎng)繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一，很多國(guó)家都已經(jīng)采取措施來(lái)控制食品中的單增李斯特氏菌，并制定了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。目前，致病微生物的檢測(cè)主要采用生物化學(xué)分析方法，但始終存在檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)，難以應(yīng)付日益增多的檢測(cè)樣本量以及滿足檢驗(yàn)檢疫工作高效率的要求。另一方面，隨著聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)的應(yīng)用，基于分子水平的檢驗(yàn)檢疫技術(shù)得到了長(zhǎng)足發(fā)展。熒光PCR方法除了需要高端的儀器設(shè)備外，使用的試劑價(jià)格昂貴，使得檢測(cè)成本大大提高，數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判斷需要專業(yè)有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員，不適合進(jìn)行廣泛的推廣；基因芯片技術(shù)不僅操作復(fù)雜，而且需要配備很多昂貴儀器，技術(shù)成本高，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求嚴(yán)，不利于普及推廣，結(jié)果判斷也不夠直觀；目前漸起的LAMP技術(shù)，由于靈敏度高，極易受到污染而產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，故要特別注意嚴(yán)謹(jǐn)操作，以及在產(chǎn)物的回收鑒定、克隆、單鏈分離方面均遜色于傳統(tǒng)的PCR方法，而且結(jié)果的判斷方法存在一定的缺陷。普通PCR方法可以采用多種方法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，最常用的包括凝膠電泳分析、分子雜交、限制性內(nèi)切酶分析、核酸序列分析。凝膠技術(shù)對(duì)相關(guān)人員及環(huán)境的毒害作用大，需要一系列復(fù)雜操作，而且點(diǎn)樣時(shí)操作誤差會(huì)使樣品漂移造成結(jié)果不準(zhǔn)確，不適合進(jìn)行大量樣本的檢測(cè)分析工作；分子雜交技術(shù)對(duì)操作人員技術(shù)要求較高，重現(xiàn)性不好；酶切分析技術(shù)操作復(fù)雜，增加污染幾率；核酸序列分析法周期長(zhǎng)、成本高不能滿足快速檢測(cè)的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題是提供食品中單增李斯特氏菌檢測(cè)用核酸層析試劑盒及其檢測(cè)方法和應(yīng)用；發(fā)明主要目的在于克服傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方法存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、步驟繁瑣等缺陷，而提供一種更加快速、簡(jiǎn)捷、安全的檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。
本發(fā)明設(shè)計(jì)試劑盒既可以保證PCR技術(shù)的靈敏度和特異性，還保留了免疫層析技術(shù)所具備的高效、便捷、低成本等特點(diǎn)。食品中單增李斯特氏菌檢測(cè)的試劑盒，包括細(xì)菌裂解液a、PCR反應(yīng)液b、陰性對(duì)照品C、陽(yáng)性對(duì)照品d、樣品稀釋液e和試紙條，所述試紙條所述試紙條由樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊順次搭接黏貼在底襯上組成。結(jié)合墊上包被膠體金顆粒標(biāo)記的鼠抗地高辛抗體，硝酸纖維素膜上有包被親和素的檢測(cè)線和包被羊抗鼠抗體的控制線；PCR反應(yīng)液b 中含有上游引物F和下游引物R，上游引物F為5 ‘ CCCCAAGTAGCAGGACAT 3 ‘，下游引物R 為5' AGATTACACTGGATAATT3'；所述上游引物F標(biāo)記生物素，下游引物R標(biāo)記地高辛。結(jié)合墊上包被膠體金顆粒粒徑為25nm，ImL膠體金顆粒標(biāo)記8. 4 μ g鼠抗地高辛抗體，形成的膠體金-抗體復(fù)合物在結(jié)合點(diǎn)墊上的包被量為2mL/30cm。硝酸纖維素膜上檢測(cè)線包被親和素濃度為0. 5mg/mL，包被量為1 μ L/cm ；控制線上包被羊抗鼠抗體濃度為lmg/mL，包被量為1 μ L/cm。細(xì)菌裂解液a 組成為=IOmM Tris-HCl, 1% Triton-100pH7. 0 ；PCR反應(yīng)液b組成如下25 μ L反應(yīng)體系包括以下組分5Xbuffer5μ L ；dNTP (各 2. 5mmol/L)2 μ L ；MgCl2 (25mmol/L)2 μ L ；引物 F(10umol/L)0. 5 μ L ；引物 R(10umol/L)0. 5 μ L ；Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L) 0. 2 μ L ；H2O12. 8 μ L0陰性對(duì)照品c 大腸埃希氏菌；陰性對(duì)照品c制備方法大腸埃希氏菌培養(yǎng)過(guò)夜后，稀釋到106CFU/mL，作為陰性對(duì)照品；陽(yáng)性對(duì)照品d 單增李斯特氏菌；陽(yáng)性對(duì)照品d制備方法陽(yáng)性菌培養(yǎng)過(guò)夜后，稀釋到106CFU/mL，作為陽(yáng)性對(duì)照品；樣品稀釋液e =PBS溶液(pH7. 2)組成為細(xì)菌裂解液a、PCR反應(yīng)液b、陰性對(duì)照品C、陽(yáng)性對(duì)照品d儲(chǔ)存于_20°C。樣品稀釋液e和試紙條常溫儲(chǔ)存于陰涼干燥處。所述試紙條外部設(shè)置塑料卡盒，塑料卡盒上依次設(shè)置凹孔和觀測(cè)口，所述試紙條的樣品墊放置于凹孔對(duì)應(yīng)處，硝酸纖維素膜上設(shè)置的質(zhì)控線和檢測(cè)線在觀測(cè)口對(duì)應(yīng)處；應(yīng)用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)食品中單增李斯特氏菌，包括以下步驟1)根據(jù)食品樣本的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)(GB4789. 30，SN/T0184等檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn))進(jìn)行增菌；幻提取DNA:
氯化鈉氯化鉀
B.5g 2g 2.9g 0.3g IOOOmL
十二水磷酸氫二鈉二水磷酸二氫鈉純水
3)從_20°C冰箱中取出PCR反應(yīng)液管b，待溶液溶化后2000r/min離心30s ；4)向反應(yīng)液管中加入2 μ L增菌液DNA，混勻；5)將上述反應(yīng)管置于普通PCR儀中，95°C變性30s后，95°C變性45s，60°C退火 45s，72°C延伸45s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，之后72°C延伸lOmin，完成PCR擴(kuò)增；6)將上述10 μ L的擴(kuò)增產(chǎn)物與90 μ L的樣品稀釋液e進(jìn)行混合；7)取出試紙條平放于水平桌面上，將上述混合液加在試紙條樣品墊處；8)反應(yīng)IOmin后，根據(jù)試紙條層析情況判斷檢測(cè)結(jié)果，完成食品樣本檢測(cè)。結(jié)果判定陰性對(duì)照僅出現(xiàn)一條紅線(在質(zhì)控線C)。陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)兩條紅線一條位于檢測(cè)線(T)，另一條位于質(zhì)控線(C)。出現(xiàn)兩條紅線，一條檢測(cè)線，一條質(zhì)控線，表示樣品中存在單增李斯特氏菌；根據(jù)試紙條顯色，直接讀取檢測(cè)結(jié)果。1)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)每個(gè)測(cè)試樣本至少出現(xiàn)一條質(zhì)控線，有或無(wú)檢測(cè)線。2)結(jié)果描述及判定(見圖1)僅在質(zhì)控線C出現(xiàn)一條紅線，表示樣品中單增李斯特氏菌或細(xì)菌拷貝數(shù)低于試劑盒最低檢測(cè)限；所述步驟⑵中提取DNA方法如下ImL增菌液3000r/min離心^iin沉淀培養(yǎng)物中的食品殘?jiān)∩锨逵?.5mL離心管中12000r/min，離心lOmin，棄去上清，使用200 μ L 裂解液a將底部沉淀重新懸起，然后在沸水浴中煮lOmin，取出后立即置于冰浴中5min。使用前3000r/min離心^iin取上清2 μ L作為模板進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。提取DNA也可采用市售基因組提取試劑盒進(jìn)行提取。本發(fā)明試劑盒的技術(shù)原理如下根據(jù)單增李斯特氏菌的遺傳背景信息，選擇保守、特異序列，篩選引物，并使用生物素、地高辛進(jìn)行引物修飾，使得陽(yáng)性核酸擴(kuò)增產(chǎn)物帶有雙標(biāo)記。同時(shí)膠體金試紙條上金標(biāo)結(jié)合墊上包被鼠抗地高辛抗體，層析膜的檢測(cè)線上包被能夠與生物素進(jìn)行特異結(jié)合的親和素，質(zhì)控線上包被羊抗鼠抗體。在層析過(guò)程中陽(yáng)性擴(kuò)增物的地高辛標(biāo)記與金標(biāo)結(jié)合墊上金標(biāo)復(fù)合物進(jìn)行結(jié)合，之后所帶的生物素標(biāo)記物與層析膜上檢測(cè)線上親和素結(jié)合，形成的“三明治”夾心結(jié)構(gòu)復(fù)合物被檢測(cè)線捕獲從而顯色，多余的金標(biāo)復(fù)合物繼續(xù)層析，達(dá)到控制線時(shí)與包被的羊抗鼠抗體結(jié)合，從而被控制線捕獲而顯色。陰性樣品則因?yàn)闆](méi)有雙標(biāo)記物的存在在層析過(guò)程中不能夠被檢測(cè)線捕獲從而不顯色。有益效果該試劑盒是將PCR擴(kuò)增技術(shù)和免疫層析技術(shù)相結(jié)合實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸產(chǎn)物的快速檢測(cè)， PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物不需要通過(guò)復(fù)雜的凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，在10-20min內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)對(duì)單增李斯特氏菌擴(kuò)增產(chǎn)物的分析，與熒光PCR及普通PCR方法相比具有以下特點(diǎn)1.操作簡(jiǎn)單只需將核酸產(chǎn)物與一定量PBS混合后滴加在試紙條樣品孔即可，無(wú)需其他操作；2.反應(yīng)速度快在10-20min內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)對(duì)單增李斯特氏菌擴(kuò)增產(chǎn)物的分析，縮短了檢測(cè)時(shí)間；
3.低成本檢測(cè)不需要復(fù)雜的儀器，普通PCR儀即可，也不需昂貴的特殊試劑，檢測(cè)成本低；4.降低了對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的要求由于該技術(shù)不需要復(fù)雜的儀器，操作過(guò)程簡(jiǎn)單，檢測(cè)結(jié)果肉眼判讀，所以任何人經(jīng)過(guò)自學(xué)或者簡(jiǎn)單的培訓(xùn)即可勝任。5.安全性該技術(shù)不需要用到特殊試劑，避開凝膠電泳中EB等污染物，對(duì)操作者和試驗(yàn)環(huán)境都是安全無(wú)害的。本發(fā)明所研究的核酸層析檢測(cè)試劑盒，使用試紙條直接檢測(cè)PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，該反應(yīng)模式既可以保證靈敏度和特異性，還保留了層析技術(shù)所具備的高效、便捷、低成本等特點(diǎn)，使得對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析時(shí)間只需要10-20min ；實(shí)現(xiàn)一步操作，完全省去制膠、電泳、 染色分析等一系列復(fù)雜操作及相關(guān)儀器設(shè)備，極大提高了擴(kuò)增產(chǎn)物分析的效率和成功率、 降低了檢測(cè)成本；同時(shí)還實(shí)現(xiàn)了對(duì)操作人員無(wú)毒害、對(duì)環(huán)境無(wú)污染。因此，核酸層析檢測(cè)技術(shù)符合國(guó)家對(duì)食品安全與出入境檢驗(yàn)檢疫中檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展要求，有利于提高食品安全與出入境檢驗(yàn)檢疫工作的效率與準(zhǔn)確率，有利于保證食品安全與進(jìn)出口貿(mào)易，從而在公共安全領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。


圖1 試劑盒結(jié)果判斷；圖2 試劑盒檢測(cè)特異性；圖3 試劑盒檢測(cè)靈敏度。圖4試劑盒結(jié)構(gòu)示意圖
具體實(shí)施例方式以下對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的的具體實(shí)施說(shuō)明，實(shí)施例1試劑盒的檢測(cè)特異性以綿羊李斯特氏菌⑴、英諾克李斯特氏菌(2)、西爾李斯特氏菌⑶、威氏李斯特氏菌G)、格氏李斯特氏菌( 為李斯特氏菌屬屬內(nèi)驗(yàn)證菌株，其它常見致病菌大腸埃希氏菌(6)、腸炎沙門氏菌(7)、枯草芽孢桿菌(8)、金黃色葡萄球菌(9)、福氏志賀氏菌(10)作為李斯特氏菌屬屬外驗(yàn)證菌株，提取其基因組作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以單增李斯特氏菌作為陽(yáng)性對(duì)照C+，檢測(cè)結(jié)果見圖2。從圖上結(jié)果可以看出只在陽(yáng)性對(duì)照(C+)處顯示陽(yáng)性，其余為陰性，說(shuō)明本發(fā)明的試劑盒特異性好，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。實(shí)施例2試劑盒的靈敏度以單增李斯特氏菌DNA為基礎(chǔ)，作梯度稀釋濃度分別為(/yL)lng、100pg、10pg、 lpg、IOOfg分別作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過(guò)試紙條進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照(C_)， 結(jié)果見圖3。從結(jié)果可以看出在Ipg處顯示為弱陽(yáng)，IOOfg處檢測(cè)線不顯色為陰性，說(shuō)明本發(fā)明試劑盒檢測(cè)單增李斯特氏菌靈敏度可達(dá)到lpg。實(shí)施例3樣品檢測(cè)從超市、市場(chǎng)購(gòu)買奶制品、蛋類、蔬菜、魚、蝦、雞肉、豬肉等共50份樣品，增菌后取增菌液提取基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用試紙條進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表2，與傳統(tǒng)微生物法GB 4789. 30-2010結(jié)果比較沒(méi)有顯著差異，符合率為97. 7%。表2樣品檢測(cè)試驗(yàn)
權(quán)利要求
1.一種單增李斯特氏菌核酸層析檢測(cè)試劑盒，包括細(xì)菌裂解液a、陰性對(duì)照品C、陽(yáng)性對(duì)照品d和試紙條，所述試紙條由樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊順次搭接黏貼在底襯上組成；其特征在于試劑盒還包括PCR反應(yīng)液b，PCR反應(yīng)液b中含有上游引物F和下游引物 R,上游引物 F 為 5，CCCCAAGTAGCAGGACAT 3 ‘，下游引物 R 為 5 ‘ AGATTACACTGGATAATT 3'；所述上游引物F標(biāo)記生物素，下游引物R標(biāo)記地高辛；所述結(jié)合墊上包被膠體金顆粒標(biāo)記的鼠抗地高辛抗體，硝酸纖維素膜上有包被親和素的檢測(cè)線和包被羊抗鼠抗體的控制線。
2.如權(quán)1所述單增李斯特氏菌核酸層析檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述結(jié)合墊上包被膠體金顆粒粒徑為25nm，ImL膠體金顆粒標(biāo)記8. 4 μ g鼠抗地高辛抗體，形成的膠體金_抗體復(fù)合物在結(jié)合點(diǎn)墊上的包被量為2mL/30cm。
3.如權(quán)1或2所述單增李斯特氏菌核酸層析檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述硝酸纖維素膜上檢測(cè)線包被親和素濃度為0. 5mg/mL，包被量為1 μ L/cm ；控制線上包被羊抗鼠抗體濃度為lmg/mL，包被量為1 μ L/cm。
4.如權(quán)1或3所述單增李斯特氏菌核酸層析檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述PCR反應(yīng)液 b組成如下25 μ L反應(yīng)體系包括以下組分5Xbuffer5 μ L ；dNTP(各 2. 5mmol/L)2μ L ；MgCl2 (25mmol/L)2μ L ；引物 F(10umol/L)0. 5 μ L ；引物 R(10umol/L)0. 5 μ L ；Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L) 0. 2 μ L ； H2O12. 8 μ L0
5.如權(quán)1或3所述單增李斯特氏菌核酸層析檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述試紙條外部設(shè)置塑料卡盒，塑料卡盒上依次設(shè)置凹孔和觀測(cè)口，所述試紙條的樣品墊放置于凹孔對(duì)應(yīng)處，硝酸纖維素膜上設(shè)置的質(zhì)控線和檢測(cè)線在觀測(cè)口對(duì)應(yīng)處。
6.如權(quán)1-5中任一權(quán)利要求所述單增李斯特氏菌核酸層析檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，包括如下步驟1)根據(jù)食品樣本的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行增菌；2)提取DNA3)取出PCR反應(yīng)液管b，待溶液溶化后2000r/min離心30秒；4)向反應(yīng)液管中加入2μ L增菌液DNA，混勻；5)將上述反應(yīng)管置于普通PCR儀中，95°C變性30s后，95°C變性45s，60°C退火45s， 72°C延伸45s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，之后72°C延伸lOmin，完成PCR擴(kuò)增；6)將上述10μ L的擴(kuò)增產(chǎn)物與90 μ L的樣品稀釋液e進(jìn)行混合；7)取出試紙條平放于水平桌面上，將上述混合液加在試紙條樣品墊中；8)反應(yīng)IOmin后，根據(jù)試紙條層析情況判斷檢測(cè)結(jié)果，完成食品樣本檢測(cè)；結(jié)果判定 出現(xiàn)兩條紅線，一條檢測(cè)線，一條質(zhì)控線，表示樣品中存在單增李斯特氏菌；僅出現(xiàn)一條紅線(在質(zhì)控線C)，則樣品中不存在單增李斯特氏菌。
7.一種單增李斯特氏菌核酸層析檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)食品中單增李斯特氏菌中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了單增李斯特氏菌核酸層析檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法和應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明是將分子生物學(xué)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)和免疫層析技術(shù)進(jìn)行結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)食品中單增李斯特氏菌的快速檢測(cè)。本發(fā)明試劑盒包括DNA提取、PCR擴(kuò)增及試紙條檢測(cè)共三部分。其中通過(guò)對(duì)引物的修飾，并在制備試紙條中選擇相應(yīng)的包被物和標(biāo)記物，從而實(shí)現(xiàn)分子生物學(xué)技術(shù)和免疫層析技術(shù)的結(jié)合，達(dá)到對(duì)食品中單增李斯特氏菌特異擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)，與傳統(tǒng)生化方法相比大大節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間，簡(jiǎn)化操作步驟，具有準(zhǔn)確、迅速、便捷、安全等特點(diǎn)，適宜大量樣品的檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/569GK102520172SQ201110410600
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月12日
發(fā)明者何艷玲, 唐慧林, 李瑾, 王麗麗, 趙瑜 申請(qǐng)人:北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司