專利名稱：HPPCn抗體、反義核苷酸及其干涉RNA在腫瘤診斷和治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)學(xué)、腫瘤學(xué)領(lǐng)域，具體而言涉及針對(duì)HPPCn的單克 隆抗體、反義核苷酸、干涉RNA及其衍生物的制備以及它們?cè)诟伟┰\斷和治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
Hepatopoietin PCn(HPPCn)是吳祖澤等從人胎肝cDNA文庫(kù)中克隆的一個(gè)肝 再生因子，能夠特異的促進(jìn)肝細(xì)胞增殖和部分肝切除小鼠的肝臟再生[Cui CP等人， Isolation and Functional Identification of a Novel Human Hepatic Growth Factor Hepatopoietin cn，Hepatology, 2008,47 (3) :986_995]，對(duì)四氯化碳引起的急性肝損傷和 肝纖維化具有保護(hù)作用[Cui CP 等人，Protective role of Hepatopoietin Cn on liver injury induced by CC14/Ethanol in rat, Hepatology Research,2009,39(2) :200_6]。HPPCn是富含亮氨酸酸性核蛋白(LANP)家族成員之一，LANP蛋白是一類(lèi)多功 能的酸性核蛋白，其成員包括PP32，PP32rl, PP32r2等。以往的研究顯示這些蛋白在 細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)降解、細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)以及細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生等過(guò)程中參與作用 [Malek SN 等人，Identification and preliminary characterization of two related proliferation-associated nuclear phosphoproteins. J. Biol. Chem 1990 ；265 (22) 13400-13409. Opal P等人，Generation and Characterization of LANP/pp32 Null Mice, Mole Cell Biol ；24 (8) :3140_9]，特別是pp32常被作為一種抑癌蛋白而備受關(guān)注。HPPCn作為L(zhǎng)ANP家族的一個(gè)新的成員，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用還沒(méi)有深入的 研究。申請(qǐng)人的研究發(fā)現(xiàn)HPPCn在腫瘤細(xì)胞，特別是肝癌細(xì)胞中的含量明顯高于正常細(xì)胞。 且HPPCn本身能夠明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)H印atopoietin PCn(HPPCn)在腫瘤細(xì)胞中的含量遠(yuǎn)高于正常細(xì) 胞，通過(guò)檢測(cè)HPPCn蛋白、DNA或RNA的表達(dá)可以有效地診斷腫瘤的發(fā)生。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)， HPPCn是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的主要活性因子，通過(guò)下調(diào)HPPCn的表達(dá)或抑制HPPCn的活性，能夠 使腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移受到抑制，而不影響正常細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移，從而達(dá)到抗腫瘤的 目的。本發(fā)明公開(kāi)了 HPPCn單克隆抗體的制備以及HPPCn相關(guān)的檢測(cè)方法，可以作為制備 腫瘤早期診斷試劑的主要成分和方法。本發(fā)明還公開(kāi)了能夠有效抑制HPPCn在腫瘤細(xì)胞中 表達(dá)的干涉RNA、反義核苷酸及其衍生物，以及可以抑制HPPCn生物活性的中和抗體，它們 可以作為制備抗腫瘤藥物的活性成分，具有非常廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值。因此，本發(fā)明首次提出以HPPCn為標(biāo)志物的腫瘤檢測(cè)和診斷方法和通過(guò)抑制 HPPCn表達(dá)和活性達(dá)到腫瘤治療目的的理論，并公開(kāi)了能夠特異抑制HPPCn表達(dá)的干涉RNA 和反義核苷酸以及能夠抑制HPPCn活性的中和抗體的制備，為人類(lèi)戰(zhàn)勝惡性腫瘤提供了一 種新的思路。
本發(fā)明一方面涉及與HPPCn表達(dá)相關(guān)的檢測(cè)方法，包括利用酶聯(lián)免疫吸附、免疫 組化、PCR, Northern Blot, Western Blot等方法檢測(cè)HPPCn蛋白，DNA或RNA在腫瘤細(xì)胞 或血清中的表達(dá)。本發(fā)明另一方面涉及能夠下調(diào)HPPCn在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的反義核苷酸、干涉RNA 或攜帶上述序列的載體及其衍生物。本發(fā)明再一方面涉及一種藥物組合，其含有本發(fā)明所述以HPPCn為靶的反義核苷 酸、干涉RNA或攜帶上述序列的載體藥物及其衍生物，它們可以作為制備抗腫瘤藥物的活 性成分。本發(fā)明再一方面涉及HPPCn的中和抗體及其相關(guān)的藥物組合，他們能夠抑制 HPPCn的活性，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，可以作為制備抗腫瘤藥物的活性成分。


結(jié)合附圖舉例說(shuō)明本發(fā)明，不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。圖1為肝癌細(xì)胞(52，T)和正常肝細(xì)胞(52，N)中的HPPCn基因的Northern印跡 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中，1 正常L02肝細(xì)胞系；2 :HepG2肝癌細(xì)胞系；3 原代培養(yǎng)的大鼠肝細(xì) 胞；4 :SMMC7721肝癌細(xì)胞系；5 :Bel7402肝癌細(xì)胞系；6 :HTC肝癌細(xì)胞系；7 :293細(xì)胞系；8 NIH3T3細(xì)胞系；9 =Hela細(xì)胞系；10 :HL60細(xì)胞系。
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例用來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不意味著對(duì)本發(fā)明的任何限制。實(shí)施例1 肝癌細(xì)胞中HPPCn的含量通過(guò)Northern Blot實(shí)驗(yàn)和免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞和正常細(xì)胞中HPPCn含 量，具體如下UNorthern Blot 用TRIZOL (GIBC0 BR公司)提取肝癌細(xì)胞(52，T)和相應(yīng)的正 常肝細(xì)胞(52，N)總RNA各30 μ g，用常規(guī)的Northen方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)用1 %的瓊脂糖凝膠進(jìn) 行RNA電泳后，將膠轉(zhuǎn)到尼龍膜上，在80°C烘烤2小時(shí)。用預(yù)雜交液(配方6XSSC，0.5% SDS，5XDenhardt，100y g/ml變性的蛙精DNA)對(duì)尼龍膜在65°C預(yù)雜交3小時(shí)。用含有32P 標(biāo)記的 HPPCn cDNA 的雜交液(配方:6XSSC，0. 5% SDS，5XDenhardt，100 μ g/ml 變性的蛙 精DNA)過(guò)夜雜交后，在65°C洗脫1小時(shí)。使尼龍膜在磷屏中放射自顯影后，掃描結(jié)果，并分 析數(shù)據(jù)。用18s的rRNA作為對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，HPPCn基因在肝癌細(xì)胞總RNA中的含量遠(yuǎn)高于其在正常肝細(xì)胞中 的含量。2.免疫組化法分別取肝癌病人的肝癌組織和癌旁組織，用4%的福爾馬林固定 48h以上，制備石蠟切片。將所得組織切片進(jìn)行免疫組化染色，具體方法如下(1)脫蠟組織切片在二甲苯中浸泡15分鐘。(2)水化組織切片依次浸入無(wú)水乙醇，95%乙醇，80%乙醇中各3分鐘，在蒸餾水 中沖洗。(3)去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶滴加3% H202室溫孵育10分鐘。磷酸鹽緩沖液(PBS) 洗滌。
(4)抗原修復(fù)在PBS中微波爐加熱5分鐘，自然冷卻。(5) 一抗孵育用PBS以1 300稀釋的抗HPPCn多克隆抗體(或單克隆抗體)， 37°C孵育1小時(shí)。PBS洗3次。(6) 二抗孵育加入用PBS以1 50稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，37°C孵 育30分鐘，PBS洗滌。(7)顯色加入新鮮配制的DAB顯色液，待顯色后自來(lái)水沖洗，光鏡下觀察并照相。結(jié)果表明肝癌組織樣本的細(xì)胞核和細(xì)胞漿中HPPCn顯色呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性，而大部分癌 旁組織樣本中HPPCn顯色呈弱陽(yáng)性或陰性。對(duì)30例肝癌病人癌組織和癌旁組織樣本進(jìn)行分 析，如表1所示，肝癌組織HPPCn顯色陽(yáng)性有28例，而癌旁組織HPPCn顯色陽(yáng)性僅有4例。 故HPPCn在肝癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁組織或正常組織。表IHPPCn在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)
權(quán)利要求
一種用于特異檢測(cè)HPPCn表達(dá)的單克隆抗體，多克隆抗體或DNA、RNA探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述抗體和探針在制備腫瘤診斷試劑中的應(yīng)用。
3.一種用于特異抑制HPPCn表達(dá)干涉RNA，其特征在于所述的干涉RNA序列如SEQ ID NO :1和 2所示。
4.一種用于特異抑制HPPCn表達(dá)反義核苷酸，其特征在于所述的反義核苷酸序列如 SEQ ID NO :1 和2 所示。
5.一種能夠用于中和HPPCn活性的單克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求2，3，4所述的干涉RNA，反義核苷酸及單克隆抗體在制備抗腫瘤藥物 中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種HPPCn的單克隆抗體、反義核苷酸、攜帶其干涉序列的載體及其衍生物以及它們?cè)诟伟┰\斷和治療中的用途。它們可以作為制備抗腫瘤藥物的活性成分，具有非常廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A61K48/00GK101957379SQ200910158049
公開(kāi)日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2009年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月17日
發(fā)明者吳祖澤, 崔春萍, 常菁, 王立生 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所;北京三有利科技發(fā)展有限公司