專利名稱：一種反義顯像劑及其反義寡核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種反義顯像劑及其反義寡核苷酸。
背景技術(shù)：
核醫(yī)學(xué)顯像技術(shù)的優(yōu)勢，與傳統(tǒng)的影像技術(shù)(CT、MRI、B超等)比較，在于功能性成像。它能反映臟器、組織或病變的血流、功能、代謝等多方面信息，有利于疾病的早期診斷；同時，其靈敏度高，達到pmol水平，而MRI等的靈敏度一般在μmol水平；另外，隨著PET/CT的逐漸應(yīng)用，功能性顯像與解剖性成像的完美融合，更為疾病的診斷提供重要的手段。
近年來，以反義顯像為代表的分子核醫(yī)學(xué)是在活體內(nèi)以分子或生物大分子作為靶目標的分子成像技術(shù)，能從分子水平上揭示人體的生理、生化及代謝水平變化，實現(xiàn)了在分子水平上對人體內(nèi)生理或病理過程中進行無創(chuàng)、實時的功能顯像。
反義顯像是將放射性核素標記的人工合成的一段反義寡核苷酸引入體內(nèi)后，追蹤其與病變組織中過度表達的目標DNA或mRNA發(fā)生特異性結(jié)合的過程，從而達到在基因水平早期、定性診斷疾病的目的。
研究證明，在人類基因組中幾乎只有一段序列能特異地與給定的16-18個堿基的寡核苷酸互補雜交，雙鏈中如果有一個堿基錯配，其親合力就平均下降近500倍。反義顯像中所使用的反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide，ASON)只作用于特異mRNA分子，不會整合到靶細胞基因組中，所以它的安全性比較高；且反義探針自身沒有抗體，分子量很小，免疫原性低。
目前，反義顯像研究尚處于實驗研究階段，涉及的靶基因位置有針對c-myc，bcl-2，k-ras等原癌基因；研究主要是集中在細胞水平上，動物實驗未見有明顯、好的顯像效果。
端粒是由端粒DNA和端粒結(jié)合蛋白組成，其長度隨著細胞分裂的持續(xù)進行而不斷縮短，當(dāng)達到一個臨界長度，細胞染色體即失去穩(wěn)定性，阻止細胞進一步分裂的信號便發(fā)出，細胞將發(fā)生凋亡。與端粒合成有關(guān)的端粒酶，能夠通過為細胞染色體末端結(jié)構(gòu)即端粒加上必要的重復(fù)序列而使端粒維持一定的長度，不再隨細胞分裂而縮短。
研究發(fā)現(xiàn)，大約85％-90％惡性腫瘤細胞和永生化細胞中可以檢測到高表達的端粒酶活性，而在大多數(shù)的體細胞中則檢測不到端粒酶的活性。另一方面，在某些腫瘤類型，惡變前端粒酶即已被激活，隨著腫瘤的進展，端粒酶活性逐漸上升，因而端粒酶活性監(jiān)測可作為早期診斷或預(yù)警的一個指標。再者，端粒酶活性也可能是腫瘤患者預(yù)后評估的良好指標，至少在部分腫瘤是這樣，比如在胃癌患者，端粒酶往往與腫瘤尺寸、轉(zhuǎn)移情況和患者存活時間相關(guān)，端粒酶活性高者預(yù)后不良。
人類端粒酶主要包括三種成分，即人端粒酶RNA成分(hTR)，人端粒酶催化亞單位(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)以及端粒酶相關(guān)蛋白hTEP1(TP1/TLP1)。其中hTERT是端粒酶活性的決定因素，其上調(diào)可能是人腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵事件。hTR和hTERT基因的對照表達研究顯示，hTR基因可在增殖力強的胎兒細胞-非永生化細胞中表達，而hTERT基因僅在腫瘤細胞-永生化細胞中表達，因此hTERT基因更顯示出腫瘤特異診斷和治療的潛在應(yīng)用價值。
目前還沒有hTERT基因用于反義顯像中的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種反義顯像劑及其反義寡核苷酸。
本發(fā)明所提供的用于制備反義顯像劑的反義寡核苷酸，其核苷酸序列為序列表中序列1。反義寡核苷酸是根據(jù)人端粒酶催化亞單位(human telomerase reversetranscriptase，hTERT)mRNA設(shè)計的；具有18個核苷酸，可以與人端粒酶催化亞單位(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)特異性結(jié)合，抑制端粒酶的活性。
本發(fā)明所提供的反義顯像劑，是上述反義寡核苷酸經(jīng)放射性核素標記后得到的。
所述反義寡核苷酸為全程硫代修飾的核苷酸。
所述反義寡核苷酸的3′端還連接有一個伯胺(NH2)。
所述伯胺通過連接子與所述反義寡核苷酸連接，所述連接子為己基((CH2)6)。
所述放射性核素可為99mTc、131I、18F、111In、68Ga，188Re等；以99mTc為例，所述放射性核素99mTc是利用螯合劑NHS-MAG3標記到所述反義寡核苷酸上的。
本發(fā)明的反義顯像劑，是首次以一段針對hTERT mRNA的、具有18個堿基的反義序列(5′-TAGAGACGTGGCTCTTGA-3′，序列1)作為反義寡核苷酸，以放射性核素99mTc進行標記制備的反義分子探針；本發(fā)明的反義顯像劑，由于其反義寡核苷酸可以與人端粒酶催化亞單位(humantelomerase reverse transcriptase，hTERT)mRNA特異性結(jié)合的原理，可用于檢測各種實體腫瘤，如乳腺癌、膀胱癌、肝細胞癌、前列腺癌、胃癌、黑色素瘤、甲狀腺癌、結(jié)直腸癌等。
通過大量的驗證該反義顯像劑在腫瘤顯像中的應(yīng)用效果實驗表明，該反義顯像劑具有穩(wěn)定性高、特異性強的特點，能夠在活體上，通過顯像及時發(fā)現(xiàn)腫瘤并對其精確定位，實現(xiàn)識別惡性腫瘤，還具有早期性、靈敏性、定量性、無創(chuàng)性、安全性等特點。
本發(fā)明的反義顯像劑，根據(jù)其標記的反射性核素的不同，可達到不同的作用，實驗中以99mTc標記反義寡核苷酸為例，如應(yīng)用其它放射性核素(如131I、18F、111In、68Ga等)進行標記，亦能達到特異診斷腫瘤的目的；另外，如果應(yīng)用治療性的放射性核素(如188Re等)進行標記，還能達到特異治療腫瘤的目的。


圖1為99mTc-MAG3-ASON在室溫下、與生理鹽水孵育(室溫)、與人新鮮血清孵育(37℃)24小時內(nèi)于不同時相測定的放射性化學(xué)純度曲線2為99mTc-MAG3-ASON的穩(wěn)定性檢測結(jié)果圖3為顯像劑99mTc-MAG3-ASON的特異性檢測結(jié)果圖4為顯像劑99mTc-MAG3-ASON在荷瘤裸鼠體內(nèi)顯像照片具體實施方式
下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
實施例1、顯像劑99mTc-MAG3-hTERT ASON的制備1、hTERT ASON的設(shè)計針對人端粒酶催化亞單位(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)mRNA的一段起始于2331位置、含有18個堿基的序列(自GENBANK號為AF015950的第2331-2348位核苷酸)，即5′-TCAAGAGCCACGTCTCTA-3′(正義序列，hTERT SON)，設(shè)計反義寡核苷酸序列(即hTERT ASON)為5′-TAGAGACGTGGCTCTTGA-3′(序列表中序列1)。
人工合成該hTERT ASON序列，并對hTERT ASON進行全程硫代修飾，以增加反義寡核苷酸在體內(nèi)外的穩(wěn)定性，不易于被內(nèi)外核酸酶所降解；并在3′端連上一個伯胺(primary amine)，NH2與骨架之間以己基(CH2)6作為連接子，即結(jié)構(gòu)式為5′-ASON-(CH2)6-NH2-3′，在下文中簡稱ASON。上述修飾的原理是適用于核醫(yī)學(xué)研究的放射性核素大多數(shù)是金屬，而金屬核素標記單鏈寡核苷酸最有價值的方法就是在帶有伯胺的末端上衍生出反義寡核苷酸，加上一個合適的連接子，使空間障礙最小化，然后通過連接子進行放射性核素標記。本發(fā)明中在寡核苷酸的5′端NH2與骨架之間以己基(CH2)6作為連接子，滿足與螯合劑偶聯(lián)的需要。同理人工合成hTERT SON(正義序列)，將hTERT SON(正義序列)進行全程硫代修飾，并在3′端連上一個伯胺(primary amine)，NH2與骨架之間以己基(CH2)6作為連接子，即結(jié)構(gòu)式為5′-SON-(CH2)6-NH2-3′，在下文中簡稱SON(正義序列)。
2、99mTc標記ASON的制備利用雙功能螯合劑NHS-MAG3(巰基乙酰三甘氨酰-N-羥基丁二酰亞胺酯)進行99mTc標記；1)NHS-MAG3螯合反義寡核苷酸(MAG3-ASON)的合成在振蕩條件下，將NHS-MAG3(溶于無水DMF，濃度為20mg/ml)溶液加入ASON溶液(溶于HEPES緩沖液(0.1M，pH8.0)，濃度為5μg/μl)中，使二者的最終摩爾比(MAG3/ASON)為20∶1。室溫下靜置反應(yīng)60-120min。反應(yīng)產(chǎn)物通過Sephadex G25層析(0.7×28cm)純化，用PB緩沖液(50mM，pH7.2)洗脫，0.4ml/管收集。紫外分光光度計測定每管在260nm處的波長吸收情況(OD260nm)。合并紫外吸收值峰管(取最高峰1-2管)，以10μg/管的量分裝。冷凍干燥后，-20℃保存?zhèn)溆?3個月)。質(zhì)譜分析MAG3-ASON的合成結(jié)果。按照同樣的方法將NHS-MAG3(溶于無水DMF，濃度為20mg/ml)溶液加入SON溶液(溶于HEPES緩沖液(0.1M，pH8.0)，濃度為5μg/μl)中，使二者的最終摩爾比(MAG3/SON)為20∶1，按照MAG3-ASON的合成和純化的方法，反應(yīng)純化MAG3-SON，冷凍干燥后，-20℃保存?zhèn)溆?3個月)。
2)99mTc-MAG3-ASON(99mTc標記反義寡核苷酸(ASON))的制備在上述得到的MAG3-ASON或MAG3-SON分別溶于NH4OAc緩沖液(0.25M，pH5.2)，配成300-500μg/ml的MAG3-ASON溶液或300-500μg/ml的MAG3-SON溶液。在10μg的MAG3-ASON溶液或10μg的MAG3-SON溶液中分別加入50mg/ml的酒石酸鈉溶液，使酒石酸鈉的濃度為7μg/μl(標記時pH值為7.6)。再依次加入37-74MBq的新鮮99mTcO4-淋洗液和3-4μl新鮮配制的1g/L的SnCl2·2H2O溶液。室溫下靜置反應(yīng)30-60min，得到99mTc-MAG3-ASON標記液或99mTc-MAG3-SON標記液。
將反應(yīng)后的99mTc-MAG3-ASON標記液用紙層析方法測定99mTc-MAG3-ASON的標記率。標記率是指放射性核素被標記到待標記化合物上的量占放射性核素的總的投入量的百分比，最常用的測定分析方法之一是放射性紙層析。紙層析是以層析紙為固定相，以適當(dāng)?shù)恼归_液作為流動相，當(dāng)流動相隨著纖維素分子上行時，待測樣品(點在濾紙的下端)也隨之移動。由于樣品中各個組分的性質(zhì)不同，在固定相上的吸附能力和在流動相中的溶解度不同，因而各個組分隨流動相的移動速度也就不相同，即各個組分在固定相上的移動距離不一樣，從而使樣品中各個組分能有效地分開。常用比移值Rf來表示各組分移動的相對速度，即Rf＝待測組分和原點的距離(1)/流動相的前沿合原點的距離(L)。Rf在0-1之間。某一物質(zhì)在同一層析系統(tǒng)和同一層析條件下，其Rf值總是保持不變的。
99mTc標記反義寡核苷酸的產(chǎn)物中主要含有三種，即99mTc-MAG3-ASON、水解锝(99mTcO2)以及游離锝(99mTcO4-)，前者是所要得到的產(chǎn)物，而后兩者是放化雜質(zhì)，需要純化去除。采用新華一號濾紙(購自北京化學(xué)試劑公司)為固定相，分別以生理鹽水和丙酮為展開劑。在生理鹽水展開體系中，水解锝(99mTcO2)停留在層析紙的原點處，而99mTc-MAG3-ASON以及游離锝(99mTcO4-)上行至層析紙的前沿處。在丙酮展開體系中，水解锝(99mTcO2)與99mTc-MAG3-ASON停留在層析紙的原點處，而游離锝(99mTcO4-)上行至層析紙的前沿處。結(jié)合兩個展開體系，算出標記產(chǎn)物99mTc-MAG3-ASON的標記率。三種產(chǎn)物的Rf值如表1所示表1.99mTc-MAG3-ASON、99mTcO4-和99mTcO2的Rf值

具體方法是在層析紙距底邊2cm處用鉛筆輕畫出一條與底邊平行的起跑線，然后將待測樣品點在起跑線上，點樣的直徑小于0.5cm。將點過樣的兩張層析紙分別吊在裝有展開液(丙酮或生理鹽水)的層析瓶中，展開液的液面不能觸到樣品，大約浸到起跑線以下1cm即可，當(dāng)展開液在層析紙上展開到一定距離(15cm)時，取出，晾干。然后將層析紙分別由下到上逐段(每段1cm)剪開，逐段測量層析紙的放射性，其中總的放射性核素的放射量等于各段的總和。根據(jù)其比移值Rf，分別進行各組分的放射性測量，以丙酮為展開液的層析計算出游離锝(99mTcO4-)的標記率(游離锝(99mTcO4-)的放射量÷總的放射性核素的放射量×100％)，以生理鹽水展開液的層析計算出水解锝(99mTcO2)的標記率(水解锝(99mTcO2)的放射量÷總的放射性核素的放射量×100％)，則99mTc-MAG3-ASON標記率＝(1-游離锝(99mTcO4-)標記率-水解锝(99mTcO2)標記率)×100％。結(jié)果表明，在室溫下反應(yīng)30-60min后，反應(yīng)產(chǎn)物99mTc-MAG3-ASON的標記率達到76％±5％(n＝5)。
用放射性活度儀測定99mTc-MAG3-ASON的活度值，從而計算其比活度，比活度＝活度值/MAG3-ASON的質(zhì)量。結(jié)果表明，在室溫下反應(yīng)30-60min后，反應(yīng)產(chǎn)物99mTc-MAG3-ASON的比活度達到1 850KBq/μg(50μCi/μg)。
反應(yīng)產(chǎn)物99mTc-MAG3-ASON標記液或99mTc-MAG3-SON標記液通過SephadexG25層析純化，PB緩沖液(50mM，pH7.2)洗脫，每管0.4ml收集。分別測定各收集管在260nm處的吸光度和放射性計數(shù)，收集高峰管(OD260nm值和放射性活度值均最高的1-2管)即為標記產(chǎn)物99mTc-MAG3-ASON或99mTc-MAG3-SON。
測定計算標記產(chǎn)物99mTc-MAG3-ASON的放射性化學(xué)純度，計算方法與標記率的計算方法相同(標記率是針對在室溫下反應(yīng)后得到的反應(yīng)產(chǎn)物而言；而放射性化學(xué)純度是針對反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過純化、去除放化雜質(zhì)之后的標記產(chǎn)物而言，二者的概念不同，但是測定、計算方式相同)，結(jié)果表明99mTc-MAG3-ASON的放射性化學(xué)純度達到96％。
實施例2、顯像劑99mTc-MAG3-hTERT ASON的功能驗證1、顯像劑99mTc-MAG3-ASON的穩(wěn)定性檢測取100μl99mTc-MAG3-ASON分別放置在以下條件室溫下放置；溶于生理鹽水，室溫下孵育；溶于人新鮮血清，37℃中水孵育。在24小時內(nèi)于不同時相測定99mTc-MAG3-ASON放射性化學(xué)純度，具體方法與測定標記率一致，即紙層析方法測定，其中，以新華一號濾紙(北京化學(xué)試劑公司)為固定相，分別以生理鹽水和丙酮為展開劑，按照實施例1中的步驟2中的步驟2)所述的方法測定放射性化學(xué)純度。結(jié)果表明，各組處理24小時后，99mTc-MAG3-ASON放射性化學(xué)純度均大于93％，具體數(shù)據(jù)如圖1所示。
取100μl99mTc-MAG3-ASON溶于人新鮮血清在37℃中水孵育0h(對照)、1h、2h、4h或6h之后，采用酚/氯仿法分別從血清中提取出，經(jīng)過75％乙醇-20℃過夜沉淀，重新溶解于無菌注射用水中，取樣進行PAGE凝膠電泳檢測。結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明，在孵育不同時間時，均僅有18bp位置出現(xiàn)清晰的電泳條帶，說明99mTc-MAG3-ASON在血清中保持完整，不被降解，具有穩(wěn)定性。圖2中，泳道1-5分別是人新鮮血清孵育0h(對照)、1h、2h、4h或6h的PAGE凝膠電泳檢測；泳道M為分子量標準。
2、顯像劑99mTc-MAG3-ASON的特異性檢測用DMEM培養(yǎng)液，在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)HepG2細胞(人肝細胞癌細胞，端粒酶陽性，購自美國ATCC公司)，2-3天換液一次，4-5天傳代一次，倒置顯微鏡下觀察細胞的生存狀態(tài)。
取對數(shù)期生長的HepG2細胞進行99mTc-MAG3-ASON轉(zhuǎn)染實驗(通過脂質(zhì)體介導(dǎo))，以99mTc-MAG3-SON轉(zhuǎn)染細胞(通過脂質(zhì)體介導(dǎo))和無任一顯像劑轉(zhuǎn)染的細胞(DMEM+10％FBS培養(yǎng))作為對照組。具體轉(zhuǎn)染實驗步驟按照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染說明書(LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司)。
轉(zhuǎn)染24h后，以Trizol法提取細胞總RNA，RT-PCR法檢測不同處理組細胞的hTERT mRNA表達情況(β-actin為內(nèi)參基因)。先逆轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA(具體方法按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行，試劑盒購自BBI公司)。PCR引物分別是hTERT，擴增產(chǎn)物長度為202bp，上游引物為5’-TCTACCGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3’，下游引物為5’-GCTCCCACGACGTAGTCCATGTTCA-3’；內(nèi)參β-actin，擴增產(chǎn)物長度為540 bp，上游引物為5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’，下游引物為5’-GTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’。PCR擴增的體系為10×PCR buffer，5μl；dNTP(2mM)，5μl；上游引物(10pM)，2μl；下游引物(10pM)，2μl；Taq酶(2u/μl)，1μl；MgCl2(25mM)，2μl；第一鏈cDNA，2μl；補足適量的ddH2O(31μl)，使總體積達50μl。擴增程序為預(yù)變性94℃，4min；34個循環(huán)，包括變性94℃(30s)，退火61℃(30s)和延伸72℃(30s)；最后延伸72℃，5min。PCR產(chǎn)物以2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定(圖3中A)，并計算不同處理組hTERT mRNA表達量與β-actin表達量比值，制作柱形圖(圖3中B)。
結(jié)果如圖3中A和圖3中B所示，結(jié)果表明，99mTc-MAG3-ASON轉(zhuǎn)染組的條帶密度明顯降低(圖3中A中泳道3)；而未轉(zhuǎn)染組(圖3中A中泳道1)以及轉(zhuǎn)染99mTc-MAG3-SON組的條帶(圖3中A中泳道2)密度無明顯差異。通過不同處理組細胞的hTERT mRNA表達量與β-actin內(nèi)參基因表達量比較(柱形圖如圖3中B所示，也說明99mTc-MAG3-ASON轉(zhuǎn)染組(圖3中B中99mTc-MAG3-ASON)細胞hTERT mRNA表達量明顯降低，而未轉(zhuǎn)染組(圖3中B中10％FBS)以及轉(zhuǎn)染99mTc-MAG3-SON組的(圖3中B中99mTc-MAG3-SON)hTERT mRNA表達量有明顯差異。表明99mTc-MAG3-ASON確實作用于靶目標基因，能降低hTERT mRNA的表達，具有特異性。
3、顯像劑99mTc-MAG3-ASON在荷瘤裸鼠體內(nèi)生物分布建立荷MCF-7乳腺癌BALB/cnu/nu裸鼠的動物模型，具體方法為荷MCF-7乳腺癌腫瘤裸鼠一只(購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部)，無菌條件下，取出腫瘤瘤塊，滅菌生理鹽水沖洗，切成1mm3的小瘤塊，各取一塊接種在BALB/cnu/nu裸鼠(購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部)右上肢處，裸鼠在SPF環(huán)境中飼養(yǎng)，待腫瘤直徑長至1cm，進行實驗。每只MCF-7乳腺癌BALB/c nu/nu裸鼠尾靜脈注射10μCi99mTc-MAG3-ASON，分別于注射后的0.5h、1h、2h、4h和6h處死。取主要臟器組織(心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、膀胱、肌肉、骨、血液、腫瘤)，分別稱重，然后放置于干燥的玻璃管中，在γ計數(shù)儀中測定每個臟器組織的放射性計數(shù)，計算每個臟器的％ID(％ID表示各臟器組織的放射性攝取的相對值，＝(臟器組織計數(shù)-本底計數(shù))/(標準源計數(shù)-本底計數(shù))×100％)，其中本底是指天然環(huán)境、大氣中的放射性計數(shù)。標準源的制備方法是取用于注射動物同體積的同位素樣品(即99mTc-MAG3-ASON)，稀釋100倍后，再取相同體積作為標準源。結(jié)果表明99mTc-MAG3-ASON主要經(jīng)消化系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)排泄，因此腹腔臟器的放射性較大；4h之后，隨著血液清除以及放射性逐漸在腫瘤部位聚集，腫瘤/肌肉的放射性比值達到8。除肝、腎、胃、腸之外，其它臟器組織(如心、脾、骨、肺、肌肉等)的放射性均較小。
4、顯像劑99mTc-MAG3-ASON在荷瘤裸鼠體內(nèi)顯像檢測按照步驟3的方法，建立荷MCF-7乳腺癌BALB/c nu/nu裸鼠的動物模型。每只荷MCF-7乳腺癌BALB/c nu/nu裸鼠尾靜脈注射200μCi99mTc-MAG3-ASON(或99mTc-MAG3-SON(對照))，分別于注射后0.5h、1h、2h、4h、6h和8h進行SPECT顯像。顯像參數(shù)為矩陣256×256，放大倍數(shù)2，低能高分辨，采集105計數(shù)。結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明，在注射顯像劑99mTc-MAG3-ASON(或99mTc-MAG3-SON(對照))后4h時，注射99mTc-MAG3-ASON(實驗組)的裸鼠右上肢腫瘤部位有清晰的放射性濃聚區(qū)，而注射99mTc-MAG3-SON(對照組)的裸鼠右上肢腫瘤部位未有明顯的放射性濃聚區(qū)。由于顯像劑主要通過消化系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)排泄，因此在腹腔部位可見有明顯的放射性濃聚區(qū)。
按照同樣的方法，對其他放射性核素標記ASON，并進行動物反以顯像實驗，結(jié)果表明，本發(fā)明的反義寡核苷酸應(yīng)用其它放射性核素(如131I、18F、111In、68Ga等)進行標記，亦能達到特異診斷腫瘤的目的；另外，應(yīng)用治療性的放射性核素(如188Re等)進行標記，還能達到特異治療腫瘤的目的。
序列表<160>1<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1tagagacgtg gctcttga18
權(quán)利要求
1.一種反義顯像用的反義寡核苷酸，其核苷酸序列為序列表中序列1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反義寡核苷酸，其特征在于所述反義寡核苷酸為經(jīng)全程硫代修飾的核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的反義寡核苷酸，其特征在于反義寡核苷酸的3′端還連接有一個伯胺。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的反義寡核苷酸，其特征在于所述伯胺通過連接子與所述反義寡核苷酸連接，所述連接子為己基。
5.一種反義顯像劑，是權(quán)利要求1-4任一項所述反義寡核苷酸經(jīng)放射性核素標記后得到的。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的反義顯像劑，其特征在于所述放射性核素為99mTc、131I、18F、111In、68Ga或188Re。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的反義顯像劑，其特征在于所述放射性核素為99mTc。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的反義顯像劑，其特征在于所述放射性核素99mTc是利用螯合劑NHS-MAG3標記到所述反義寡核苷酸上的。
9.權(quán)利要求5-8中任一項所述的反義顯像劑在檢測和/或定位腫瘤中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述腫瘤為乳腺癌、膀胱癌、肝細胞癌、前列腺癌、胃癌、黑色素瘤、甲狀腺癌、結(jié)直腸癌或肺癌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種反義顯像劑及其反義寡核苷酸。該反義寡核苷酸，其核苷酸序列為序列表中序列1。該反義顯像劑，是所述反義寡核苷酸經(jīng)放射性核素標記后得到的。本發(fā)明的反義顯像劑具有穩(wěn)定性高、特異性強的特點，能夠在活體上實現(xiàn)識別惡性腫瘤，通過顯像及時發(fā)現(xiàn)腫瘤并對其精確定位，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C07H21/00GK101015703SQ20071006318
公開日2007年8月15日 申請日期2007年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月30日
發(fā)明者王榮福, 劉萌, 張春麗, 閆平, 郭鳳琴 申請人:北京大學(xué)第一醫(yī)院