專利名稱：用于多聚核苷酸檢測(cè)和定量的設(shè)備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)和定量多聚核苷酸的自動(dòng)化設(shè)備。
背景技術(shù)：
基因組的介入已經(jīng)在加速藥物發(fā)現(xiàn)的步伐方面起作用?；蚪M技術(shù)已經(jīng)在發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn)方面證實(shí)了它們的價(jià)值。該領(lǐng)域的進(jìn)一步改進(jìn)將提供更有效的工具，使更快、更節(jié)約成本地開發(fā)潛在的藥物。
藥物發(fā)現(xiàn)過程包括以下幾個(gè)步驟鑒定與疾病相關(guān)的潛在生化靶點(diǎn)，篩選活性化合物，并進(jìn)一步化學(xué)設(shè)計(jì)，臨床前測(cè)試，最后進(jìn)行臨床試驗(yàn)。該過程的效率仍離完美相去甚遠(yuǎn)花費(fèi)在研究和開發(fā)過程基金中的金錢估計(jì)約75％都是走向失敗。另外，產(chǎn)品開發(fā)中失敗發(fā)生地越晚，與該項(xiàng)目相關(guān)的損失也就越大。因此，有必要早期消除將會(huì)發(fā)生的失敗，以大大節(jié)省整個(gè)藥物開發(fā)過程的成本。這樣，原始分子靶點(diǎn)的質(zhì)量就成為了節(jié)省成本的藥物開發(fā)的決定性因素。
能夠影響靶點(diǎn)鑒定和證實(shí)有效性的一個(gè)方法是繪制轉(zhuǎn)錄譜。該方法對(duì)特定條件下的基因表達(dá)進(jìn)行比較例如疾病細(xì)胞和正常細(xì)胞之間、對(duì)照細(xì)胞和藥物處理細(xì)胞之間或治療響應(yīng)細(xì)胞和治療耐受細(xì)胞之間的基因表達(dá)。該方法產(chǎn)生的信息可以直接鑒別治療所靶向的特定基因，重要的是顯示疾病和治療中涉及的生化途徑。簡(jiǎn)要地說(shuō)，繪制轉(zhuǎn)錄圖譜不僅提供生化靶點(diǎn)，還同時(shí)提供評(píng)估這些靶點(diǎn)質(zhì)量的方法。另外，和基于細(xì)胞的篩選聯(lián)用，繪制轉(zhuǎn)錄圖譜將大大改變藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域。使用表型變化作為功能細(xì)胞系統(tǒng)的標(biāo)記物來(lái)篩選潛在藥物歷來(lái)都是成功的。例如，監(jiān)測(cè)培養(yǎng)物中腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)來(lái)鑒定抗癌藥物。同樣，細(xì)菌的生存能力被用于針對(duì)鑒定抗生素化合物的分析中。通常在不知道靶向生化途徑的前提下進(jìn)行這種篩選。事實(shí)上，鑒定到的有效化合物揭示出這種途徑，并指出真正的分子靶點(diǎn)，使隨后的下一代藥物的合理設(shè)計(jì)能夠進(jìn)行。
可以使用繪制轉(zhuǎn)錄圖譜的現(xiàn)代化工具來(lái)設(shè)計(jì)新的篩選方法，這些篩選方法將利用基因表達(dá)代替表型變化來(lái)評(píng)價(jià)藥物的有效性。例如，這些方法描述在美國(guó)專利No.5,262,311；5,665,547；5,599,672；5,580,726；6,045,988和5,994,076；以及Luehrsenet al.(1997)，Biotechniques，22168-74；Liang and Pardee(1998，Mol Biotechnol.10261-7)。對(duì)于諸如癡呆、輕度認(rèn)知障礙、抑郁等中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病領(lǐng)域中的藥物發(fā)現(xiàn)來(lái)說(shuō)，這類方法的價(jià)值是不可估量的，這些領(lǐng)域中表型篩選是不適用的，但易于建立期望的轉(zhuǎn)錄譜，并將之與特定的疾病相聯(lián)系。鑒定到的有效化合物將揭示出潛在的分子過程。另外，該方法可有助于開發(fā)現(xiàn)有藥物的改進(jìn)形式，這種改進(jìn)的藥物能同時(shí)作用于多個(gè)生化靶點(diǎn)，產(chǎn)生所需的藥理效果。在這種情況下，和根據(jù)對(duì)多靶點(diǎn)結(jié)合的優(yōu)化進(jìn)行篩選相比，轉(zhuǎn)錄應(yīng)答的變化對(duì)藥物作用是一種更好的標(biāo)記物。
在本發(fā)明之前，繪制轉(zhuǎn)錄譜最先進(jìn)的方法是基于使用DNA微陣列的技術(shù)，舉例來(lái)說(shuō)，這些技術(shù)評(píng)論在Greenberg，2001 Neurology 57755-61；Wu，2001，J Pathol.19553-65；Dhiman et al.，2001，Vaccine 2022-30；Bier et al.，2001 Fresenius J Anal Chem.371151-6；Mills et al.，2001，Nat Cell Biol.3E175-8中；并描述在美國(guó)專利No.5,593,839；5,837,832；5,856,101；6,203,989；6,271,957和6,287,778中。DNA微陣列是通過評(píng)價(jià)標(biāo)記多聚核苷酸樣品與結(jié)合在受試陣列表面上的DNA分子的雜交，同時(shí)比較給定樣品中幾千種基因表達(dá)的方法，其中所述標(biāo)記的多聚核苷酸樣品通過mRNA的逆轉(zhuǎn)錄獲得。雖然現(xiàn)有技術(shù)提供有關(guān)轉(zhuǎn)錄變化的有價(jià)值的信息，但離完美相去甚遠(yuǎn)，還存在有一些問題和缺陷。
首先，該技術(shù)局限于存在于微陣列中的基因集合。目前的指紋技術(shù)能夠在單個(gè)芯片上放置10,000-15,000個(gè)基因，該數(shù)目基本上是特定細(xì)胞類型中所表達(dá)的基因數(shù)目。由于細(xì)胞類型的多樣性，需要建立對(duì)特定細(xì)胞類型的特定陣列。雖然理論上是可能的，但該任務(wù)幾乎不可能實(shí)現(xiàn)，因?yàn)樾枰谥圃煳㈥嚵兄傲私獗磉_(dá)在這些細(xì)胞中的基因集合。
另外，組織樣品中轉(zhuǎn)錄物的數(shù)目要比細(xì)胞樣品中的大，并超出微陣列的容量。并且，基因表達(dá)的一些變化緣自替換式剪切，這進(jìn)一步增加了待分析的轉(zhuǎn)錄物數(shù)。克服這些困難的唯一可能是開發(fā)能夠涵蓋整個(gè)基因組，包括替換式剪切基因的多個(gè)陣列。這種方法將大大增加單次實(shí)驗(yàn)的成本，并需要大量生物樣品，可能大于能夠合理獲得的量。
其次，現(xiàn)有技術(shù)DNA微陣列不提供定量的準(zhǔn)確數(shù)據(jù)，必須通過獨(dú)立的方法(例如定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Q-PCR))來(lái)證實(shí)所觀察到的基因表達(dá)變化。
最后，可能是特別令人感興趣的稀有轉(zhuǎn)錄物不能通過使用現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域的檢測(cè)技術(shù)的微陣列來(lái)檢測(cè)。
毛細(xì)管電泳已被用來(lái)定量檢測(cè)基因表達(dá)。Rajevic等人(2001，Pflugers Arch.442(6Suppl 1)R190-2)公開了使用7個(gè)引物對(duì)來(lái)同時(shí)檢測(cè)大量癌基因表達(dá)的差異，從而檢測(cè)癌基因差異表達(dá)的方法。正義引物5’端標(biāo)記有熒光染料。通過在ABI-PRISM 310Genetic Analyzer上進(jìn)行毛細(xì)管電泳對(duì)多重?zé)晒釸T-PCR結(jié)果進(jìn)行了分析。Borson等人(1998，Biotechniques 25130-7)描述了在聯(lián)合定量競(jìng)爭(zhēng)性逆轉(zhuǎn)錄PCR(QC-RT-PCR)與毛細(xì)管電泳(CE)進(jìn)行產(chǎn)物快速分離和檢測(cè)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行低豐度mRNA轉(zhuǎn)錄物可靠定量的策略。George等人(1997，J Chromatogr B Biomed Sci Appl 69593-102)描述了應(yīng)用毛細(xì)管電泳系統(tǒng)(ABI 310)鑒定熒光差異顯示生成的EST模式。Odin等人(1999，J Chromatogr B Biomed Sci Appl 73447-53)描述了一種具有多色檢測(cè)能力的自動(dòng)化毛細(xì)管凝膠電泳，用于PCR擴(kuò)增的cDNA的分離和定量。
用于PCR擴(kuò)增和CE的獨(dú)立裝置是可以得到的。例如，PCR儀可購(gòu)自AppliedBiosystems(Foster City，CA)、Bio-Rad(Hercules，CA)、Eppendorf(Westbury，NY)，Roche(Indianapolis，IN)。CE裝置可購(gòu)自Applied Biosystems(Foster City，CA)、BeckmanCoulter(Fullerton，CA)和Spectrumedix Corporation(State College，PA)。
美國(guó)專利No.6,126,804公開了使用一次性的小型裝置現(xiàn)場(chǎng)鑒定微生物和DNA片段的設(shè)備，該設(shè)備在一個(gè)小的手持包裝上/中包含有集成的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)酶反應(yīng)孔、所附著的毛細(xì)管電泳(CE)通道、檢測(cè)器和讀取裝置。但是，該設(shè)備是專門為現(xiàn)場(chǎng)使用而設(shè)計(jì)的。另外，現(xiàn)有技術(shù)中尚未有裝置能提供簡(jiǎn)單、靈敏的設(shè)備來(lái)定量檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)樣品中的基因表達(dá)譜。
為了克服這些局限性，本技術(shù)領(lǐng)域中需要開發(fā)替代設(shè)備來(lái)繪制轉(zhuǎn)錄譜，其將(1)不需要在分析前事先了解表達(dá)的基因集合的序列，而在分析過程中/后其本身將提供該信息；(2)測(cè)定表達(dá)轉(zhuǎn)錄物水平的定量變化；(3)檢測(cè)稀有基因的表達(dá)；和(4)是自動(dòng)化的。在本技術(shù)領(lǐng)域中需要有一種簡(jiǎn)單而靈敏的設(shè)備來(lái)定量檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)樣品中的基因表達(dá)譜。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種繪制表達(dá)譜的設(shè)備，其包括擴(kuò)增反應(yīng)混合物中的多聚核苷酸以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增裝置；通過第一連接裝置連接到擴(kuò)增裝置的分析裝置，所述的第一連接裝置能夠?qū)⒎磻?yīng)混合物中的部分樣品從擴(kuò)增裝置轉(zhuǎn)移到檢測(cè)和定量擴(kuò)增產(chǎn)物的分析裝置，其中所述的第一連接裝置是機(jī)器手(robotic arm)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述設(shè)備還包括通過第二連接裝置連接到擴(kuò)增裝置的多聚核苷酸提取裝置，所述第二連接裝置能夠?qū)⑻崛〉亩嗑酆塑账針悠窂亩嗑酆塑账崽崛⊙b置轉(zhuǎn)移到擴(kuò)增裝置。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述設(shè)備還包括級(jí)分收集器。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的級(jí)分收集器通過第四連接裝置與分析裝置相連，能夠收集定量產(chǎn)物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述設(shè)備還包括鑒定定量產(chǎn)物序列的序列鑒定儀，其中序列鑒定儀通過第五連接裝置和分析裝置相連，所述的第五連接裝置能夠?qū)⒍慨a(chǎn)物從分析裝置轉(zhuǎn)移到序列鑒定儀。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的設(shè)備還包括鑒定定量產(chǎn)物序列的序列鑒定儀，其中序列鑒定儀通過第五連接裝置和級(jí)分收集器相連，所述的第五連接裝置能夠?qū)⑹占漠a(chǎn)物從級(jí)分收集器轉(zhuǎn)移到序列鑒定儀。
本發(fā)明還提供了一種繪制表達(dá)譜的設(shè)備，其包括擴(kuò)增反應(yīng)混合物中的多聚核苷酸以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增裝置；通過第一連接裝置連接到擴(kuò)增裝置的分析裝置，所述的第一連接裝置能夠?qū)⒎磻?yīng)混合物中的部分樣品從擴(kuò)增裝置轉(zhuǎn)移到檢測(cè)和定量擴(kuò)增產(chǎn)物的分析裝置；通過第二連接裝置連接到擴(kuò)增裝置的多聚核苷酸提取裝置，所述第二連接裝置能夠?qū)⑻崛〉亩嗑酆塑账針悠窂亩嗑酆塑账崽崛⊙b置轉(zhuǎn)移到擴(kuò)增裝置。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述設(shè)備還包括級(jí)分收集器。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的級(jí)分收集器通過第四連接裝置與分析裝置相連，能夠收集定量產(chǎn)物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述設(shè)備還包括鑒定定量產(chǎn)物序列的序列鑒定儀，其中序列鑒定儀通過第五連接裝置連接到分析裝置，所述的第五連接裝置能夠?qū)⒍慨a(chǎn)物從分析裝置轉(zhuǎn)移到序列鑒定儀。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的設(shè)備還包括鑒定定量產(chǎn)物序列的序列鑒定儀，其中序列鑒定儀通過第五連接裝置連接到級(jí)分收集器，所述的第五連接裝置能夠?qū)⑹占漠a(chǎn)物從級(jí)分收集器轉(zhuǎn)移到序列鑒定儀。
本發(fā)明還提供了一種繪制表達(dá)譜的設(shè)備，其包括擴(kuò)增反應(yīng)混合物中的多聚核苷酸以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增裝置；通過第一連接裝置連接到擴(kuò)增裝置的分析裝置，所述的第一連接裝置能夠?qū)⒎磻?yīng)混合物中的部分樣品從擴(kuò)增裝置轉(zhuǎn)移到檢測(cè)和定量擴(kuò)增產(chǎn)物的分析裝置；通過第三連接裝置連接到分析裝置的數(shù)據(jù)生成裝置，所述的第三連接裝置能夠?qū)⑿盘?hào)從分析裝置轉(zhuǎn)移到數(shù)據(jù)生成裝置。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述設(shè)備還包括通過第二連接裝置連接到擴(kuò)增裝置的多聚核苷酸提取裝置，所述的第二連接裝置能夠?qū)⑻崛〉亩嗑酆塑账針悠窂亩嗑酆塑账崽崛⊙b置轉(zhuǎn)移到擴(kuò)增裝置。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述設(shè)備還包括級(jí)分收集器。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的級(jí)分收集器通過第四連接裝置連接到分析裝置，能夠收集定量產(chǎn)物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述設(shè)備還包括鑒定定量產(chǎn)物序列的序列鑒定儀，其中序列鑒定儀通過第五連接裝置連接到分析裝置，所述的第五連接裝置能夠?qū)⒍慨a(chǎn)物從分析裝置轉(zhuǎn)移到序列鑒定儀。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的設(shè)備還包括鑒定定量產(chǎn)物序列的序列鑒定儀，其中序列鑒定儀通過第五連接裝置連接到級(jí)分收集器，所述的第五連接裝置能夠?qū)⑹占漠a(chǎn)物從級(jí)分收集器轉(zhuǎn)移到序列鑒定儀。
本發(fā)明還提供了一種繪制表達(dá)譜的設(shè)備，其包括擴(kuò)增反應(yīng)混合物中的多聚核苷酸以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增裝置；通過第一連接裝置連接到擴(kuò)增裝置的分析裝置，所述的第一連接裝置能夠?qū)⒎磻?yīng)混合物中的部分樣品從擴(kuò)增裝置轉(zhuǎn)移到檢測(cè)和定量擴(kuò)增產(chǎn)物的分析裝置；能夠收集定量產(chǎn)物的級(jí)分收集器。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的級(jí)分收集器通過第四連接裝置連接到分析裝置，能夠收集定量產(chǎn)物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述設(shè)備還包括通過第二連接裝置連接到擴(kuò)增裝置的多聚核苷酸提取裝置，所述第二連接裝置能夠?qū)⑻崛〉亩嗑酆塑账針悠窂亩嗑酆塑账崽崛⊙b置轉(zhuǎn)移到擴(kuò)增裝置。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的設(shè)備還包括鑒定定量產(chǎn)物序列的序列鑒定儀，其中序列鑒定儀通過第五連接裝置連接到級(jí)分收集器，所述的第五連接裝置能夠?qū)⑹占漠a(chǎn)物從級(jí)分收集器轉(zhuǎn)移到序列鑒定儀。
本發(fā)明還提供了一種繪制表達(dá)譜的設(shè)備，其包括擴(kuò)增反應(yīng)混合物中的多聚核苷酸以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增裝置；通過第一連接裝置連接到擴(kuò)增裝置的分析裝置，所述的第一連接裝置能夠?qū)⒎磻?yīng)混合物中的部分樣品從擴(kuò)增裝置轉(zhuǎn)移到檢測(cè)和定量擴(kuò)增產(chǎn)物的分析裝置；鑒定定量產(chǎn)物序列的序列鑒定儀，其中序列鑒定儀通過第五連接裝置連接到分析裝置，所述的第五連接裝置能夠?qū)⒍慨a(chǎn)物從分析裝置轉(zhuǎn)移到序列鑒定儀。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述設(shè)備還包括通過第二連接裝置連接到擴(kuò)增裝置的多聚核苷酸提取裝置，所述第二連接裝置能夠?qū)⑻崛〉亩嗑酆塑账針悠窂亩嗑酆塑账崽崛⊙b置轉(zhuǎn)移到擴(kuò)增裝置。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述設(shè)備還包括級(jí)分收集器。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的級(jí)分收集器通過第四連接裝置連接到分析裝置，能夠收集定量產(chǎn)物，其中所述的級(jí)分收集器還通過另一個(gè)第五連接裝置連接到序列鑒定儀，所述的第五連接裝置能夠?qū)⑹占漠a(chǎn)物從級(jí)分收集器轉(zhuǎn)移到序列鑒定儀。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的擴(kuò)增裝置和分析裝置還能夠進(jìn)行多聚核苷酸的序列鑒定。
本發(fā)明還提供了一種繪制表達(dá)譜的設(shè)備，其包括擴(kuò)增反應(yīng)混合物中的多聚核苷酸以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增裝置；檢測(cè)和定量擴(kuò)增產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳儀，其中所述毛細(xì)管電泳儀的毛細(xì)管浸在反應(yīng)混合物中，將反應(yīng)混合物的部分樣品從擴(kuò)增裝置轉(zhuǎn)移到毛細(xì)管電泳儀。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述設(shè)備還包括通過第二連接裝置連接到擴(kuò)增裝置的多聚核苷酸提取裝置，所述第二連接裝置能夠?qū)⑻崛〉亩嗑酆塑账針悠窂亩嗑酆塑账崽崛⊙b置轉(zhuǎn)移到擴(kuò)增裝置。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述設(shè)備還包括級(jí)分收集器。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的級(jí)分收集器通過第四連接裝置和毛細(xì)管電泳儀相連，以收集定量產(chǎn)物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述設(shè)備還包括鑒定定量產(chǎn)物序列的序列鑒定儀，其中序列鑒定儀通過第五連接裝置連接到毛細(xì)管電泳儀，所述的第五連接裝置能夠?qū)⒍慨a(chǎn)物從毛細(xì)管電泳儀轉(zhuǎn)移到序列鑒定儀。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的設(shè)備還包括鑒定定量產(chǎn)物序列的序列鑒定儀，其中序列鑒定儀通過第五連接裝置連接到級(jí)分收集器，所述的第五連接裝置能夠?qū)⑹占漠a(chǎn)物從級(jí)分收集器轉(zhuǎn)移到序列鑒定儀。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的擴(kuò)增裝置和毛細(xì)管電泳儀能夠進(jìn)行多聚核苷酸的序列鑒定。
在本發(fā)明的設(shè)備中，所述的擴(kuò)增裝置優(yōu)選是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增裝置。
還優(yōu)選的是，在每個(gè)PCR循環(huán)結(jié)束時(shí)，第一連接裝置能夠?qū)⒎磻?yīng)混合物的部分樣品從擴(kuò)增裝置轉(zhuǎn)移到分析裝置。
優(yōu)選的是，反應(yīng)混合物包含一個(gè)或多個(gè)PCR擴(kuò)增引物，所述引物與反應(yīng)管內(nèi)壁或微滴定板的孔內(nèi)壁化學(xué)連接。
在本發(fā)明的設(shè)備中，所述的擴(kuò)增裝置還優(yōu)選能夠進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生cDNA。
優(yōu)選的是，用于逆轉(zhuǎn)錄的一個(gè)或多個(gè)引物與反應(yīng)管內(nèi)壁或微滴定板孔的內(nèi)壁化學(xué)連接。
優(yōu)選的是，所述設(shè)備能夠檢測(cè)和定量一種或多種熒光標(biāo)記物所產(chǎn)生的信號(hào)。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，第一、第二、第四或第五連接裝置是機(jī)器手。
在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，第一、第二、第四或第五連接裝置是管或通道。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，第一、第二、第四和第五連接裝置為單一的連接裝置，例如將樣品從一個(gè)裝置轉(zhuǎn)移到另一個(gè)裝置的機(jī)器手。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在第一、第二、第四或第五連接裝置上施加電流，使之能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)移。
在本發(fā)明的設(shè)備中，分析裝置優(yōu)選為毛細(xì)管電泳儀。
優(yōu)選的是，所述設(shè)備中的多聚核苷酸提取裝置能夠從一種或多種生物材料中分離總RNA或mRNA。
本發(fā)明將在下列方面發(fā)現(xiàn)廣泛的用途，如生物學(xué)和生物醫(yī)藥研究；治療試劑和診斷標(biāo)記物的鑒定；經(jīng)過遺傳修飾的細(xì)胞和生物有機(jī)體的分析；未知疾病的鑒定；DNA的分析和生物樣品的鑒定。這些應(yīng)用的非限制性例子包括定量PCR、實(shí)時(shí)PCR、DNA測(cè)序、繪制轉(zhuǎn)錄譜和基因型分析。


將參照附圖進(jìn)一步解釋本發(fā)明，其中在多個(gè)附圖中相同的結(jié)構(gòu)用相同的附圖標(biāo)記來(lái)表示。所示的附圖不按比例繪制，其重點(diǎn)通常是為了說(shuō)明本發(fā)明的原理。
圖1是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案繪制表達(dá)譜的一種設(shè)備的示意圖。設(shè)備10由擴(kuò)增裝置64和分析裝置68組成，所述的分析裝置68通過第一連接裝置66和擴(kuò)增裝置64相連。
圖2是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案繪制表達(dá)譜的一種設(shè)備的示意圖。設(shè)備10由多聚核苷酸提取裝置20、擴(kuò)增裝置64和分析裝置68組成。第一連接裝置66將擴(kuò)增裝置64和分析裝置68連接，而第二連接裝置40將多聚核苷酸提取裝置20和擴(kuò)增裝置64連接。
圖3是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案繪制表達(dá)譜的一種設(shè)備的示意圖。設(shè)備10由擴(kuò)增裝置64、分析裝置68和數(shù)據(jù)生成裝置120組成。第一連接裝置66將擴(kuò)增裝置64和分析裝置68連接，第二連接裝置40將多聚核苷酸提取裝置20和擴(kuò)增裝置64連接，第三連接裝置80將分析裝置68和數(shù)據(jù)生成裝置120連接。
圖4是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案繪制表達(dá)譜的一種設(shè)備的示意圖。設(shè)備10由擴(kuò)增裝置64和分析裝置68組成。擴(kuò)增裝置64能夠在擴(kuò)增反應(yīng)之前進(jìn)行多聚核苷酸的逆轉(zhuǎn)錄。第一連接裝置66將擴(kuò)增裝置64和分析裝置68連接。
圖5是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案繪制表達(dá)譜的一種設(shè)備的示意圖。設(shè)備10由擴(kuò)增裝置64和分析裝置68組成。分析裝置68能夠進(jìn)行數(shù)據(jù)生成。第一連接裝置66將擴(kuò)增裝置64和分析裝置68連接。
圖6是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案繪制表達(dá)譜的一種設(shè)備的示意圖。設(shè)備10由擴(kuò)增裝置64和分析裝置68組成，它們都位于同一個(gè)機(jī)殼60中。機(jī)殼60中的第一連接裝置66將擴(kuò)增裝置64和分析裝置68連接。
圖7是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案繪制表達(dá)譜的一種設(shè)備的示意圖。設(shè)備10由多聚核苷酸提取裝置20、擴(kuò)增裝置64、分析裝置68和數(shù)據(jù)生成裝置120組成。第一連接裝置66將擴(kuò)增裝置64和分析裝置68連接，第二連接裝置40將多聚核苷酸提取裝置20和擴(kuò)增裝置64連接，第三連接裝置80將分析裝置68和數(shù)據(jù)生成裝置120連接。
圖8是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案繪制表達(dá)譜的一種設(shè)備的示意圖。設(shè)備10由擴(kuò)增裝置64、分析裝置68和級(jí)分收集器160組成。第一連接裝置66將擴(kuò)增裝置64和分析裝置68連接，第四連接裝置140將分析裝置68和級(jí)分收集器160連接。
圖9是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案繪制表達(dá)譜的一種設(shè)備的示意圖。設(shè)備10由擴(kuò)增裝置64、分析裝置68和序列鑒定儀200組成。第一連接裝置66將擴(kuò)增裝置64和分析裝置68連接，第五連接裝置180將擴(kuò)增裝置64和序列鑒定儀200連接。
圖10是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案繪制表達(dá)譜的一種設(shè)備的示意圖。設(shè)備10由擴(kuò)增裝置64、分析裝置68、級(jí)分檢測(cè)器和序列鑒定儀200組成。第一連接裝置66將擴(kuò)增裝置64和分析裝置68連接，第四連接裝置140將分析裝置68和級(jí)分收集器160連接，第五連接裝置180將級(jí)分收集器160和序列鑒定儀200連接。
圖11是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案繪制表達(dá)譜的一種設(shè)備的示意圖。設(shè)備10由擴(kuò)增裝置64和分析裝置68組成，其中分析裝置68還充當(dāng)序列鑒定儀200。第一連接裝置66將擴(kuò)增裝置64和分析裝置68連接。
圖12是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案繪制表達(dá)譜的一種設(shè)備的示意圖。設(shè)備10由擴(kuò)增裝置64、分析裝置68、序列鑒定儀200和數(shù)據(jù)生成裝置120組成。第一連接裝置66將擴(kuò)增裝置64和分析裝置68連接，第五連接裝置180將擴(kuò)增裝置64和序列鑒定儀200連接，第三連接裝置80將序列鑒定儀200和數(shù)據(jù)生成裝置連接。
圖13是使用根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案的設(shè)備繪制表達(dá)譜過程的示意圖。
雖然上述

了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，如討論部分所提到的，本發(fā)明的其他實(shí)施方案也可加以考慮。本文通過代表性方式而非限制性方式給出了本發(fā)明的說(shuō)明性實(shí)施方案。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以設(shè)計(jì)許多其他屬于本發(fā)明原理的范圍之內(nèi)的改動(dòng)和實(shí)施方案。
具體實(shí)施例方式
本文使用了下列術(shù)語(yǔ)和定義本文所用的“樣品”指從其天然環(huán)境中分離且包含多聚核苷酸的生物材料。根據(jù)本發(fā)明的“樣品”可以由純的或分離的多聚核苷酸組成，或可以包含生物樣品，如含有多聚核苷酸的組織樣品、生物流體樣品或細(xì)胞樣品。生物流體包括但不局限于血液、血漿、唾液、尿液、腦脊液、灌洗液和白血球電泳法(leukophoresis)樣品。本發(fā)明的樣品可以是包含多聚核苷酸的任何植物、動(dòng)物、細(xì)菌或病毒材料，或源自它們的任意材料。
本文所用的“制備的樣品”指為了分離或合成多聚核苷酸，即DNA(如基因組DNA或cDNA)或RNA(如總RNA或mRNA)的目的來(lái)源于樣品的制備物。
本文所用的“部分樣品(aliquot)”指從制備的完整樣品或反應(yīng)混合物中取出的樣品體積。部分樣品的體積小于樣品或反應(yīng)混合物的總體積，優(yōu)選為1μl-5μl的體積。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于取出的各部分樣品來(lái)說(shuō)，加入包含反應(yīng)所必需試劑(如緩沖液、鹽、核苷酸和聚合酶)的等體積反應(yīng)緩沖液。
本文所用的“連接裝置”指連接兩個(gè)儀器、能夠?qū)⒘黧w和/或信號(hào)從一個(gè)儀器轉(zhuǎn)移到另一個(gè)儀器的裝置。
本文所用的“機(jī)器手”指將樣品、包含樣品的管或板從一個(gè)位置物理轉(zhuǎn)移到另一個(gè)位置的裝置，優(yōu)選由微處理器控制。每個(gè)位置可以是根據(jù)本發(fā)明有用的模塊設(shè)備中的一個(gè)單元。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)有用的機(jī)器手的例子是Mitsubishi RV-E2 RoboticArm。控制機(jī)器手的軟件通?？蓮臋C(jī)器手廠商獲得。
本文所用的“反應(yīng)室”指用于放置正在進(jìn)行或?qū)⒁M(jìn)行反應(yīng)(例如，擴(kuò)增反應(yīng)或提取過程)的反應(yīng)物的流體室?！胺磻?yīng)室”可以包括任意的合適材料，即表現(xiàn)出最小非特異性吸收的材料，或處理后表現(xiàn)出最小非特異性吸收的材料，例如包括但不局限于玻璃、塑料、尼龍、陶瓷或其組合?！胺磻?yīng)室”可以和至少一個(gè)連接裝置連接，所述的連接裝置用于轉(zhuǎn)移材料進(jìn)/出反應(yīng)室。
本文所用的“表達(dá)”指在細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中生成蛋白質(zhì)或核苷酸序列，包括從編碼所述產(chǎn)物的DNA轉(zhuǎn)錄成RNA產(chǎn)物，轉(zhuǎn)錄后修飾和/或翻譯成蛋白質(zhì)產(chǎn)物或多肽，以及可能的翻譯后修飾。
本文所用的“繪制表達(dá)譜”指檢測(cè)多個(gè)樣品間表達(dá)譜差異。
本文所用的“表達(dá)譜差異”指基因表達(dá)的量(即豐度)和質(zhì)的差異。如果在一個(gè)樣品中通過檢測(cè)多聚核苷酸的已知方法(例如，電泳)檢測(cè)到了某個(gè)基因的表達(dá)，而在另一個(gè)樣品中未檢測(cè)到其表達(dá)，則存在有“表達(dá)譜差異”?；蛘撸绻麅蓚€(gè)樣品間基因表達(dá)量的差異(即增加或降低)為約20％、約30％、約50％、約70％、約90％、約100％(約2倍)或更多，直至并包括約1.2倍、2.5倍、5倍、10倍、20倍、50倍或更多，則存在有“表達(dá)譜差異”。兩個(gè)樣品間具有表達(dá)譜差異的基因是在兩個(gè)樣品中差異表達(dá)的基因。
本文所用的“多個(gè)”指兩個(gè)或多個(gè)。根據(jù)本發(fā)明，多個(gè)可以是3個(gè)或更多，100個(gè)或更多，或者1000個(gè)或更多，例如最多達(dá)對(duì)應(yīng)于樣品中所有mRNA的cDNA的數(shù)目。
本文所用的“擴(kuò)增產(chǎn)物”指部分特定多聚核苷酸序列和/或其互補(bǔ)序列的多拷貝多聚核苷酸，核苷酸序列對(duì)應(yīng)于模板多聚核苷酸序列和其互補(bǔ)序列。根據(jù)本發(fā)明的“擴(kuò)增產(chǎn)物”可以是DNA或RNA，可以是雙鏈或單鏈。
本文所用的“合成”和“擴(kuò)增”可以互換使用，指產(chǎn)生特定多聚核苷酸序列的拷貝或增加特定多聚核苷酸序列的拷貝數(shù)或量的反應(yīng)?？梢圆患酉拗频赝ㄟ^聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、特異多聚核苷酸基擴(kuò)增(NSBA)的體外方法或本領(lǐng)域所公知的其他方法進(jìn)行。例如，多聚核苷酸擴(kuò)增可以是使用聚合酶和一對(duì)寡核苷酸引物生成含量大于起始存在量的任意特定多聚核苷酸序列的過程，即生成靶多聚核苷酸序列或靶多聚核苷酸的過程。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“級(jí)分收集”指用于收集來(lái)自緩慢流動(dòng)源，如色譜柱或電泳儀的液體樣品的裝置，其中液體的組成隨時(shí)間而變化。一般來(lái)說(shuō)，級(jí)分收集器包括能夠支持多個(gè)分離收集管的支架面，和能夠選擇性將液體樣品導(dǎo)向各個(gè)收集管的分配頭。通過這種方式，樣品的不連續(xù)液體級(jí)分被收集到各個(gè)管中進(jìn)行后續(xù)的分析或使用。在毛細(xì)管電泳中，可以通過將毛細(xì)管的末端和電極浸在含有液體的收集管中、施加電流使多聚核苷酸洗脫到收集管中進(jìn)行級(jí)分收集。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“序列鑒定儀”指能夠鑒別多聚核苷酸的核苷酸序列的儀器，即DNA測(cè)序儀器。
本文所用的“標(biāo)記物”或“可檢測(cè)標(biāo)記物”指能夠用來(lái)提供可檢測(cè)(優(yōu)選可定量)信號(hào)并可以可操作連接到多聚核苷酸的任意原子或分子。標(biāo)記物可以提供能夠通過熒光、放射性、比色、比重測(cè)定、X射線衍射或吸收、磁力、酶活性、質(zhì)譜、結(jié)合親和力、雜交射頻、納米晶體等檢測(cè)的信號(hào)。本發(fā)明的引物可被標(biāo)記以使擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物可通過“檢測(cè)”可檢測(cè)標(biāo)記物而被“檢測(cè)”。“定性或定量”檢測(cè)指在標(biāo)記物所產(chǎn)生的信號(hào)量(強(qiáng)度)或數(shù)目的基礎(chǔ)上進(jìn)行可視或自動(dòng)化分析。
本文所用的“分離的”或“純化的”多聚核苷酸指已經(jīng)從其正常細(xì)胞(例如，染色體)環(huán)境取出或在非天然環(huán)境中合成(例如人工合成)的天然存在序列。因此，“分離的”或“純化的”序列可以在無(wú)細(xì)胞溶液中，或在不同的細(xì)胞環(huán)境中。術(shù)語(yǔ)“純化的”并非意味著序列是僅存在核苷酸，而是指基本不含與之天然結(jié)合的非核苷酸或多聚核苷酸材料(約90-95％純度，直到99-100％純度)，因而區(qū)分于分離的染色體。
本文所用的“cDNA”指在RNA依賴的DNA聚合酶(例如，逆轉(zhuǎn)錄酶)作用下從RNA模板生成的互補(bǔ)或拷貝多聚核苷酸?！癱DNA克隆”指攜帶在克隆載體中，與目的RNA分子互補(bǔ)的雙鏈DNA序列。
本文所用的“基因組DNA”指染色體DNA，與拷貝自RNA轉(zhuǎn)錄物的互補(bǔ)DNA相對(duì)。本文所用的“基因組DNA”可以是單一細(xì)胞中存在的所有DNA，或者是單一細(xì)胞中DNA的一部分。
本發(fā)明涉及繪制基因表達(dá)譜的自動(dòng)化設(shè)備。該設(shè)備能夠提供對(duì)多個(gè)樣品以及一個(gè)樣品的高通量表達(dá)分析。因而單一自動(dòng)化儀器包括在單一系統(tǒng)中傳統(tǒng)上由技術(shù)員使用移液器、孵箱、多聚核苷酸擴(kuò)增裝置、分析裝置(例如，凝膠電泳系統(tǒng))和數(shù)據(jù)獲得系統(tǒng)所完成的功能。本發(fā)明的設(shè)備能夠進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)、分析、定量和/或可視化。
除非指明，本發(fā)明的實(shí)施采用分子生物學(xué)、微生物學(xué)的傳統(tǒng)技術(shù)和重組DNA技術(shù)，這些技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，在文獻(xiàn)中作有解釋。例如，參見Sambrook，F(xiàn)ritsch & Maniatis，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，Second Edition；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，ed.，1984)；Polynucleotide Hybridization(B.D.Harnes & S.J.Higgins，eds.，1984)；A Practical Guide to Molecular Cloning(B.Perbal，1984)；和a series，Methods in Enzymology(Academic Press，Inc)；Short Protocols InMolecular Biology，(Ausubel et al.，ed.，1995)。本發(fā)明的實(shí)施還涉及美國(guó)專利No.5,965,409；5,665,547；5,262,311；5,599,672；5,580,726；6,045,998；5,994,076；5,962,211；6,217,731；6,001,230；5,963,456；5,246,577；5,126,025；5,364,521和4,985,129中所公開的技術(shù)和組合物。這里上下文中所提到的所有專利、專利申請(qǐng)和出版物都通過引用并入本文。
本發(fā)明的繪制基因表達(dá)譜的設(shè)備如圖1中10所示。設(shè)備10由擴(kuò)增裝置64和分析裝置68組成，所述的分析裝置68通過第一連接裝置66和擴(kuò)增裝置64相連。從感興趣樣品中提取的多聚核苷酸在擴(kuò)增裝置64中擴(kuò)增。然后通過第一連接裝置66將擴(kuò)增多聚核苷酸產(chǎn)物中的部分樣品轉(zhuǎn)移到分析裝置68中。分析裝置68進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)和定量。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述設(shè)備能夠進(jìn)行多聚核苷酸的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過電泳進(jìn)行分析。優(yōu)選采用毛細(xì)管電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物。
如圖2所示，本發(fā)明中繪制表達(dá)譜的設(shè)備還能夠制備用于擴(kuò)增反應(yīng)的DNA模板。設(shè)備10包括多聚核苷酸提取裝置20、擴(kuò)增裝置64和分析裝置68。第一連接裝置66將擴(kuò)增裝置64和分析裝置68連接，第二連接裝置40將多聚核苷酸提取裝置20和擴(kuò)增裝置64連接。生物樣品引入到多聚核苷酸提取裝置20中，多聚核苷酸從生物材料提取。提取的多聚核苷酸通過第二連接裝置40轉(zhuǎn)移到擴(kuò)增裝置64中，使得多聚核苷酸在擴(kuò)增裝置64中得以擴(kuò)增。擴(kuò)增多聚核苷酸產(chǎn)物的部分樣品通過第一連接裝置66轉(zhuǎn)移到分析裝置68中。分析裝置68進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)和定量。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，多聚核苷酸提取裝置從生物材料中提取RNA。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，在多聚核苷酸提取裝置20中進(jìn)行mRNA從生物樣品的提取。
所述設(shè)備的分析裝置68能夠生成所需的表達(dá)譜繪制數(shù)據(jù)，基本如圖5所示。設(shè)備10由擴(kuò)增裝置64和分析裝置68組成，所述的分析裝置68通過第一連接裝置66和擴(kuò)增裝置64相連。從感興趣樣品提取的多聚核苷酸在擴(kuò)增裝置64中得以擴(kuò)增。然后，擴(kuò)增多聚核苷酸產(chǎn)物的部分樣品通過第一連接裝置66轉(zhuǎn)移到分析裝置68中。分析裝置68進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)和定量，生成表達(dá)譜繪制數(shù)據(jù)。
作為替代實(shí)施方案，本發(fā)明中繪制表達(dá)譜的設(shè)備還可以包括分離的數(shù)據(jù)生成裝置，如圖3所示。設(shè)備10由擴(kuò)增裝置64、分析裝置68和數(shù)據(jù)生成裝置120組成，第一連接裝置66將擴(kuò)增裝置64和分析裝置68連接，第三連接裝置80將分析裝置68和數(shù)據(jù)生成裝置120連接。
如圖4所示，繪制表達(dá)譜的設(shè)備的擴(kuò)增裝置能夠通過逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。設(shè)備10由擴(kuò)增裝置64和分析裝置68組成。第一連接裝置66將擴(kuò)增裝置64和分析裝置68連接。將提取的RNA(例如，總RNA或mRNA)引入到擴(kuò)增裝置64中，在擴(kuò)增裝置64中從RNA合成cDNA。然后，合成的cDNA在擴(kuò)增裝置64中得以擴(kuò)增。擴(kuò)增多聚核苷酸產(chǎn)物的部分樣品通過第一連接裝置66轉(zhuǎn)移到分析裝置68中。分析裝置68進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)和定量。
多聚核苷酸提取裝置20如圖2和圖7所示，根據(jù)本發(fā)明的多聚核苷酸提取裝置20能夠直接從生物樣品(例如，細(xì)胞樣品或組織樣品)中提取多聚核苷酸(即DNA或RNA)。
優(yōu)選的是，多聚核苷酸提取裝置20被設(shè)計(jì)以提供提取的多聚核苷酸，來(lái)用作擴(kuò)增裝置64中逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和/或PCR擴(kuò)增反應(yīng)的模板。在一個(gè)實(shí)施方案中，多聚核苷酸提取裝置20提供制備的多聚核苷酸，其質(zhì)量和體積對(duì)應(yīng)于用來(lái)擴(kuò)增多聚核苷酸的現(xiàn)有或?qū)⒂邢到y(tǒng)的要求。可通過商業(yè)途徑獲得的擴(kuò)增系統(tǒng)包括但不局限于AppliedBiosystems(Forster City，CA)的GeneAmp PCR System 9700；Hercules，CA的iCyclerThermal Cycler；Eppendorf的Eppendorf Mastercycler Gradient；Cepheid(Sunnyvale，CA)的Smart Cycler TD System；Roche(Indianapolis，IN)的LightCycler；AMPLICORTM自動(dòng)化PCR系統(tǒng)(Roche，Indianapolis，IN)和這些儀器的后繼產(chǎn)品。提取裝置可被設(shè)計(jì)來(lái)提供任意適當(dāng)輸出體積的流體，其包含提取的多聚核苷酸，例如約100ml至約750μl，優(yōu)選500ml至約500μl，較優(yōu)選約1μl至約250μl，更優(yōu)選約1μl至約100μl。
在一個(gè)實(shí)施方案中，多聚核苷酸提取裝置20能夠從生物材料中分離mRNA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多聚核苷酸提取裝置20能夠從多個(gè)生物材料中分離mRNA。
提取多聚核苷酸的技術(shù)和試劑是本領(lǐng)域所公知的，例如，在Basic Methods inMolecular Biology，(1986，Davis et al.，Elsevier，NY)和Current Protocols in MolecularBiology(1997，Ausubel et al.，John Weley & Sons，Inc.)中所描述的。
使用上述多聚核苷酸提取技術(shù)的各種多聚核苷酸提取設(shè)備都可以和本發(fā)明聯(lián)用。例如，日本專利申請(qǐng)No.125972/1991描述了一種多聚核苷酸提取設(shè)備，其設(shè)計(jì)用來(lái)預(yù)防病毒感染和提高提取效率，包括多關(guān)節(jié)的工業(yè)機(jī)器人和DNA提取及純化所必須的外周元件。日本專利申請(qǐng)No.131076/1992公開了一種提取設(shè)備，其通過轉(zhuǎn)移多聚核苷酸提取容器至離心機(jī)的裝置的緊湊排列，以提高多聚核苷酸從小量血液或其他生物材料中的提取效率。日本專利申請(qǐng)No.47278/1997公開了一種提取設(shè)備，其采用帶有真空泵而非離心機(jī)的過濾系統(tǒng)。為了實(shí)現(xiàn)完全自動(dòng)化的提取裝置，可將離心機(jī)或真空泵和相關(guān)的硬件組建成儀器。
在一個(gè)實(shí)施方案中，多聚核苷酸提取裝置20是一種多聚核苷酸提取設(shè)備。本發(fā)明的多聚核苷酸提取設(shè)備可以包括(1)一組提取容器，每個(gè)提取容器包括一個(gè)反應(yīng)管，其中將生物材料、試劑溶液和磁力載體混合并反應(yīng)、一個(gè)用于收集非必需組分溶液的放泄杯和一個(gè)多聚核苷酸回收管，都固定在支架上；(2)將溶液引入每個(gè)提取容器的分配裝置；(3)混合反應(yīng)管中溶液和磁力載體的攪拌裝置；(4)使容器中磁力載體保持靜態(tài)的控制裝置；(5)從反應(yīng)管中排出溶液而使磁力載體保持不動(dòng)的排出裝置；(6)加熱反應(yīng)管中溶液和磁力載體的加熱裝置；和(7)連續(xù)轉(zhuǎn)移容器到給定位置的轉(zhuǎn)移裝置。這種設(shè)備描述在美國(guó)專利No.6,281,008中，其整體內(nèi)容通過引用并入本文。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，多聚核苷酸提取裝置20是一種自動(dòng)化多聚核苷酸分離儀器。該儀器包括可移動(dòng)的盒(cassette)，其中所述盒包括可分離的樣品轉(zhuǎn)移/存儲(chǔ)帶(strip)。所述的盒可以密封或開放，優(yōu)選是密封的。優(yōu)選的盒還具有可移動(dòng)的輸入轉(zhuǎn)移條(transfer bar)，并裝在箱中。該儀器還包括具有頂側(cè)、外側(cè)、內(nèi)側(cè)的中空體、用于放置所述盒的至少一個(gè)狹槽和用于放置樣品容器的至少一個(gè)孔。另外，所述盒包括將盒移出/入箱的裝置，以及活化輸入轉(zhuǎn)移樣品條的裝置。優(yōu)選的儀器還包括和這些裝置相通的、存儲(chǔ)或生成加壓空氣的空氣噴嘴，和密封所述盒的樣品輸入通道的裝置。另外，該儀器還包括位于內(nèi)部的閥驅(qū)動(dòng)器，用于開啟或關(guān)閉所述盒中的閥，和一個(gè)或多個(gè)泵驅(qū)動(dòng)器，用于移動(dòng)流體出/入所述盒中的流體室。該儀器還優(yōu)選包括磁鐵、電源、用戶界面和條碼讀取裝置。優(yōu)選的是，該儀器還包括位于狹槽或孔中的感應(yīng)裝置，當(dāng)所述盒或樣品容器已經(jīng)插到其中時(shí)，其顯示狹槽或孔已被占據(jù)的信號(hào)。這種儀器公開在美國(guó)專利No.6,281,008中，其整體內(nèi)容通過引用并入本文。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，多聚核苷酸提取裝置20還包括存儲(chǔ)裝置。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多聚核苷酸提取裝置20還包括將帶與盒的其他部分分離的分離裝置。分離裝置優(yōu)選為一種刀，其具有與之相通的加熱裝置，其用途是將帶與盒的其他部分密封。優(yōu)選的裝置具有多個(gè)孔；更優(yōu)選的是，所述裝置具有約24個(gè)孔，或48個(gè)孔，或96個(gè)孔，或386個(gè)孔。所述裝置優(yōu)選包括具有下述部分的盒(1)位于輸入轉(zhuǎn)移樣品條上的一個(gè)或多個(gè)樣品輸入端口，其分別連續(xù)地與該裝置中相同數(shù)目的孔相通，其中所述端口還與盒的樣品輸入存儲(chǔ)庫(kù)相通；(2)一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)流道，其分別連續(xù)地通過流體交換通道與相同數(shù)目的樣品輸入存儲(chǔ)庫(kù)相通；(3)與流體交換通道相通的流體室，其中流體室是反應(yīng)試劑的供應(yīng)室、樣品池或反應(yīng)室；(4)控制流體交換通道中流體流動(dòng)的閥；和(5)樣品轉(zhuǎn)移/存儲(chǔ)條，其具有至少一個(gè)與反應(yīng)流道相通的流體室。
多聚核苷酸提取裝置20用來(lái)從任意生物樣品中制備多聚核苷酸。用于本發(fā)明上下文中的生物樣品可以是包含多聚核苷酸，即RNA或DNA的任意材料。這種樣品可以是一個(gè)完整的生物有機(jī)體，如昆蟲；或多個(gè)生物有機(jī)體，如分析細(xì)菌或酵母時(shí)；或者樣品可以是生物有機(jī)體的一部分，如組織、體液或分泌物?？梢詮闹蝎@得多聚核苷酸組分的適當(dāng)組織包括但不局限于皮膚、骨、肝臟、腦、葉、根等；即可以是活的或死亡的生物有機(jī)體的任意組織。所述的組織可以基本上不被原生物有機(jī)體的其他組織污染，或可以被污染，或甚至被來(lái)自不同生物有機(jī)體的組織污染。優(yōu)選的是，從中獲得特定生物樣品的生物有機(jī)體的來(lái)源在實(shí)施本發(fā)明方法之前是已知的；但是，并不總是能夠獲得這種知識(shí)，如法醫(yī)樣品。
生物樣品還可以是臨床樣品或樣本。例如，由外源材料所致的疾病或病癥可以通過測(cè)試來(lái)自某種臨床樣本中樣品的多聚核苷酸中特定病原體的存在來(lái)驗(yàn)證，例如通過鑒定該病原體所具有的特征性多聚核苷酸序列來(lái)驗(yàn)證，所述的樣品如尿液、排泄物、脊髓液、唾液、血液或血液組分、或任意其他的合適樣本。還可以測(cè)試個(gè)體中某些先天性遺傳性疾病或病癥的存在或傾向。這些遺傳性疾病包括但不局限于亨丁頓舞蹈癥、Tay Sach’s癥等，檢驗(yàn)分離自適當(dāng)臨床樣品，如受試個(gè)體任意細(xì)胞材料的多聚核苷酸中的這種遺傳疾病或傾向所特有的多聚核苷酸序列，但需要說(shuō)明的是，單獨(dú)使用和胚系干細(xì)胞相比具有重排DNA或更少可測(cè)DNA的細(xì)胞，如紅細(xì)胞和抗體形成細(xì)胞可能并不足以進(jìn)行這種檢驗(yàn)。
通過多聚核苷酸提取裝置提取，即分離的多聚核苷酸是任意合適的多聚核苷酸，其中適用性取決于所需測(cè)試的類型。例如，測(cè)試個(gè)體中某種病原體的存在時(shí)，優(yōu)選測(cè)試識(shí)別性多聚核苷酸序列或取自臨床樣品的DNA組分中發(fā)現(xiàn)的序列，如果受試個(gè)體感染了該病原體的話，病原體和宿主的已知生物學(xué)特征將提示能夠發(fā)現(xiàn)病原體?；蛘?，對(duì)于測(cè)試特定基因是否在個(gè)體中表達(dá)時(shí)，可以尋找識(shí)別性多聚核苷酸序列或取自組織的RNA組分中的序列來(lái)驗(yàn)證這種表達(dá)，其中潛在的生物學(xué)/病理學(xué)特征指示表達(dá)應(yīng)該被發(fā)現(xiàn)或不應(yīng)該被發(fā)現(xiàn)，與待測(cè)病癥或疾病相對(duì)應(yīng)。根據(jù)表達(dá)受監(jiān)控的基因，還可以使用本領(lǐng)域中公知的方法提純RNA組分，使之主要包括多聚腺苷化的或非多聚腺苷化的RNA物質(zhì)。作為替代方案，或進(jìn)一步的方案，還可以在本發(fā)明的范圍內(nèi)選擇RNA物質(zhì)的大小類型。
生物樣品可以新鮮取自個(gè)體或從自然界分離，或者將這種樣品保存在適當(dāng)?shù)臈l件下，例如在冰上。例如，可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法從個(gè)體中采集血液樣品，例如用位于個(gè)體靜脈內(nèi)、與標(biāo)準(zhǔn)排出管相連的皮下針將血液從個(gè)體抽到管中。該血液可以直接使用或保存在冰上。優(yōu)選的是存在抗凝劑，如肝素、檸檬酸鹽或EDTA。對(duì)于長(zhǎng)期保存來(lái)說(shuō)，優(yōu)選將樣品冷凍、凍干，或涂到適當(dāng)?shù)幕|(zhì)上并在其上干燥，例如DNA的保存。這種適當(dāng)?shù)幕|(zhì)包括任何吸收紙，如Whatman濾紙，或可釋放性地結(jié)合DNA的處理膜材料。優(yōu)選的膜包括在IsoCode.TM.Stix商品中(Schleicher & Schuell，Inc.，Keene，N.H.)，除了能夠可逆地結(jié)合DNA，其還能夠可逆地結(jié)合血色素(某些多聚核苷酸擴(kuò)增方法的抑制劑)。根據(jù)本發(fā)明，基質(zhì)結(jié)合的多聚核苷酸可以從基質(zhì)中提取，然后以與新鮮樣品相同的方式純化。
優(yōu)選的是，多聚核苷酸提取裝置20能夠從一種或多種生物樣品中進(jìn)行核酸提取。在一個(gè)實(shí)施方案中，借助包括能夠插入儀器狹槽中的可移取盒的裝置來(lái)實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。優(yōu)選的是，該裝置包括適于同時(shí)、先后或以交錯(cuò)方式運(yùn)行四個(gè)的不同盒(例如，每個(gè)盒對(duì)應(yīng)一個(gè)樣品)的狹槽。
樣品制備裝置還可用作擴(kuò)增反應(yīng)混合物的容器，從而在每次將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到分析裝置之后，向反應(yīng)混合物補(bǔ)充與部分樣品等量的擴(kuò)增反應(yīng)混合物。
擴(kuò)增裝置64如圖1所示，根據(jù)本發(fā)明的擴(kuò)增裝置64可以是能夠擴(kuò)增多聚核苷酸的任意儀器，優(yōu)選通過多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增的儀器。通常，PCR反應(yīng)通過熱循環(huán)儀進(jìn)行。有用的熱循環(huán)儀包括但不局限于Applied Biosystems(Forster City，CA)的GeneAmpPCR System 9700；Bio-Rad(Hercules，CA)的iCycler Thermal Cycler；Eppendorf的Eppendorf Mastercycler Gradient；Cepheid(Sunnyvale，CA)的Smart Cycler TD System；Roch(Indianapolis，IN)的LightCycler；AMPLICORTM自動(dòng)化PCR系統(tǒng)(Roche，Indianapolis，IN)。根據(jù)本發(fā)明有用的PCR儀包括但不局限于在美國(guó)專利No.5,475,610；5,602,756；5,720,923；5,779,977；5,827,480；6,033,880；6,326,147；6,1716,785中公開的儀器，其整體內(nèi)容都通過引用并入本文。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的目的是制備與初始供應(yīng)的小量“模板”DNA相同的大量DNA。該反應(yīng)涉及復(fù)制DNA鏈，并在隨后的循環(huán)中使用這些拷貝產(chǎn)生其他的拷貝。理想情況下，每個(gè)循環(huán)都使DNA的量加倍，從而導(dǎo)致存在于擴(kuò)增反應(yīng)混合物中的“靶”或“模板”DNA鏈的拷貝數(shù)以幾何級(jí)數(shù)增加。
例如，典型的PCR溫度循環(huán)需要反應(yīng)混合物被精確地控制在每個(gè)孵育溫度下一定時(shí)間，相同或相似的循環(huán)重復(fù)多次。典型的PCR程序開始于將樣品在約94℃下保持約30秒，以使反應(yīng)混合物變性。然后，將反應(yīng)混合物的溫度降至約30℃-約60℃，保持1分鐘，使引物雜交。然后，反應(yīng)混合物的溫度升高至約50℃-約72℃的溫度，保持約2分鐘，以促進(jìn)延伸產(chǎn)物的合成。這就完成一個(gè)循環(huán)。再次將反應(yīng)混合物的溫度升高至約94℃來(lái)對(duì)前面循環(huán)(變性)中形成的延伸產(chǎn)物進(jìn)行鏈分離，從而開始下一個(gè)PCR循環(huán)。通常，重復(fù)所述循環(huán)25-30次。本領(lǐng)域中可以理解的是，PCR反應(yīng)中PCR循環(huán)的溫度和循環(huán)數(shù)可以根據(jù)反應(yīng)目的和模板特征加以改變，例如TM?；镜腜CR方案和策略是本領(lǐng)域中所公知的，例如，描述在Basic Methods in MolecularBiology，(1986，Davis et al.，Elsevier，NY)和Current Protocols in Molecular Biology(1997，Ausubel et al.，John Weley & Sons，Inc.)中。
在一個(gè)實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物保存在用蓋封閉的一次性塑料管中。這種管的典型樣品體積約為50-100微升。通常，所述儀器使用裝有樣品DNA和反應(yīng)混合物的許多管，其插入到金屬模具中稱作樣品孔的孔中。為了進(jìn)行PCR過程，金屬模具的溫度根據(jù)用戶在PCR方案文件中指定的預(yù)定溫度和時(shí)間加以控制。電腦和相關(guān)的電子器件根據(jù)用戶在PCR方案文件中提供的限定了循環(huán)時(shí)間、循環(huán)溫度和循環(huán)次數(shù)等的數(shù)據(jù)進(jìn)行控制。金屬模具改變溫度時(shí)，各孔中的樣品也隨之發(fā)生相同的溫度改變。
一般說(shuō)來(lái)，希望形成金屬模具內(nèi)各位置之間均一的溫度，因?yàn)槟＞呓饘賰?nèi)存在的溫度梯度會(huì)使在循環(huán)的特定時(shí)間上一些樣品具有和其他樣品相比不同的溫度。還希望將從樣品模具向樣品熱傳遞的延遲減到最小，因?yàn)檫@種延遲對(duì)于所有樣品來(lái)說(shuō)并不相同。當(dāng)設(shè)計(jì)本發(fā)明的PCR儀時(shí)應(yīng)考慮這些因素。
在一個(gè)實(shí)施方案中，PCR儀的金屬模具足夠大，能夠容納以工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)微滴定板形式排列的96個(gè)樣品管。微滴定板是生物化學(xué)領(lǐng)域和生物技術(shù)領(lǐng)域中處理、加工和分析大量小樣品時(shí)廣泛使用的裝置。有用的微滴定板可以包含24孔、48孔、96孔、196孔或384孔。典型地，微滴定板是寬為35/8英寸、長(zhǎng)5英寸、具有96個(gè)相同樣品孔的板，以9毫米的間隔以8孔乘12孔的矩形排列?？梢垣@得具有各種材料、樣品孔形狀和體積的微滴定板，優(yōu)化用于許多不同的用途。優(yōu)選的是，微滴定板以9毫米的間隔具有全部外形尺寸和同樣8×12排列的孔。可以獲得能夠以這種標(biāo)準(zhǔn)微滴定板格式自動(dòng)處理、加工和分析樣品的各種儀器。本領(lǐng)域中微滴定板是可以通過商業(yè)途徑獲得的，例如得自MWG biotech Inc.(HighPoint，NC)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域中公知的方法制造微孔板，例如美國(guó)專利No.5,602,756中描述的方法，其通過引用并入本文。
優(yōu)選的是，用于微滴定板的管是薄壁樣品管，以減小樣品模具的樣品溫度變化和反應(yīng)混合物的相應(yīng)溫度變化之間的延遲。與所用的任何熱交換器相接觸的樣品管部分的壁厚度應(yīng)盡可能薄，只要能夠承受PCR循環(huán)的熱應(yīng)力和正常使用的應(yīng)力即可。通常，樣品管由可以高壓滅菌的聚丙烯如Himont PD701制成，圓錐部分的壁厚度為0.009-0.012英寸加減0.001英寸。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，PCR儀加熱或冷卻樣品模具導(dǎo)致樣品與樣品之間的均一性，和快速的熱循環(huán)速率、不受控的環(huán)境溫度改變，其他操作條件如電源電壓和冷卻溫度的變化無(wú)關(guān)。如下文所述，可以使用加熱蓋來(lái)防止冷凝和樣品體積損失。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，PCR儀防止樣品在接近其沸點(diǎn)的溫度下孵育時(shí)反應(yīng)混合物中溶劑的損失。加熱板覆蓋樣品管的頂部，并和提供氣密密封的每個(gè)樣品管的各個(gè)蓋相接觸。來(lái)自熱板的熱量加熱每個(gè)樣品管的上部和蓋至高于冷凝點(diǎn)的溫度，使任何樣品管中都不發(fā)生冷凝和回流。冷凝意味著較多的熱傳遞，因?yàn)楫?dāng)水蒸汽冷凝時(shí)散發(fā)與蒸發(fā)熱等量的熱量。如果冷凝的發(fā)生不均一，則會(huì)導(dǎo)致樣品與樣品之間較大的溫度變化。加熱板防止在樣品管中發(fā)生任何冷凝，從而可以將潛在的溫度誤差來(lái)源降至最小。使用加熱板還減小了試劑用量。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的擴(kuò)增裝置64還能夠進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)指體外酶催化的反應(yīng)，其中發(fā)生與RNA模板互補(bǔ)的DNA鏈的模板依賴性聚合。逆轉(zhuǎn)錄通過將退火的寡核苷酸引物延伸至RNA模板進(jìn)行，最通常使用病毒逆轉(zhuǎn)錄酶如AMV(鳥白血病病毒)逆轉(zhuǎn)錄酶或MMLV(莫洛尼氏小鼠白血病病毒)逆轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄條件和方法是本領(lǐng)域所公知的。逆轉(zhuǎn)錄示例性的條件如下AMV逆轉(zhuǎn)錄酶——于37℃下，在包含50mM Tris-HCl，pH 8.3，75mM KCl，3mMMgCl2，10mM DTT，0.8mM dNTP，50單位逆轉(zhuǎn)錄酶和1-5μg模板RNA的緩沖液中反應(yīng)；MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶——于37℃下，在包含50mM Tris-HCl，pH 8.3，30mM KCl，8mM MgCl2，10mM DTT，0.8mM dNTP，50單位逆轉(zhuǎn)錄酶和1-5μg模板RNA的緩沖液中反應(yīng)。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，逆轉(zhuǎn)錄使用96孔板進(jìn)行，其中cDNA使用與微孔板的孔內(nèi)壁化學(xué)連接的一種或多種寡核苷酸引物加以合成。合成這種化學(xué)連接的寡核苷酸的技術(shù)公開在McGall et al.，International application No.PCT/US93/03767；Pease etal.，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.，915022-5026；Southern and Maskos，Internationalapplication PCT/GB89/01114；Maskos and Southern(同上)；Southern et al.，(1992)Genomics，131008-1017；和Maskos and Southern，(1993)Polynucleotides Research，214663-4669中，每個(gè)文獻(xiàn)的整體內(nèi)容都通過引用并入本文。
在某些實(shí)施方案中，使用與微滴定板的孔內(nèi)壁化學(xué)連接的一種或多種寡核苷酸進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。在其他的實(shí)施方案中，使用與微滴定板的孔內(nèi)壁或反應(yīng)管的內(nèi)壁化學(xué)連接的至少一個(gè)寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。結(jié)果是合成的cDNA或擴(kuò)增的多聚核苷酸產(chǎn)物與微滴定板的內(nèi)壁結(jié)合，易于分離和純化。
寡核苷酸還可以在單一(或幾個(gè))固相支持物上合成，如在微滴定板的孔內(nèi)壁或反應(yīng)管的內(nèi)壁上合成，形成均勻包被有合成寡核苷酸的區(qū)域的陣列。合成這種陣列的技術(shù)公開在McGall et al.，International application No.PCT/US93/03767；Pease et al.，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.，915022-5026；Southern and Maskos，Internationalapplication PCT/GB89/01114；Maskos and Southern(同上)；Southern et al.，(1992)Genomics，131008-1017；和Maskos and Southern，(1993)Polynucleotides Research，214663-4669中。
在一個(gè)實(shí)施方案中，擴(kuò)增裝置生成標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物。例如，可以使用標(biāo)記的引物生成擴(kuò)增產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明方法標(biāo)記的多聚核苷酸(例如，寡核苷酸引物)被標(biāo)記在5’端、3’端、或兩端、或內(nèi)部。標(biāo)記物可以是“直接的”，例如染料，放射性標(biāo)記物。標(biāo)記物還可以是“間接的”，例如抗體表位、生物素、地高辛、堿性磷酸酶(AP)、辣根過氧化物酶(HRP)。為了檢測(cè)“間接標(biāo)記物”，必須加入其他組分，如標(biāo)記的抗體或酶底物，從而使捕獲的、釋放的、標(biāo)記的多聚核苷酸片段可視化。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸引物用熒光標(biāo)記物標(biāo)記。適當(dāng)?shù)臒晒鈽?biāo)記物包括熒光染料，如若丹明和衍生物(如Texas Red)、熒光素和衍生物(如5-溴甲基熒光素)、LuciferYellow、IAEDANS、7-Me2N-香豆素-4-乙酸酯、7-OH-4-CH3-香豆素-3-乙酸酯、7-NH2-4-CH3-香豆素-3-乙酸酯(AMCA)、monobromobimane、三磺酸芘，如CascadeBlue和monobromorimethy-amminobimane(例如，參見DeLuca，ImmunofluorescenceAnalysis，in Antibody As a Tool，Marchalonis，et al.，eds.，John Wiley & Sons，Ltd.，(1982)，其通過引用并入本文)。
分析裝置68——毛細(xì)管電泳儀毛細(xì)管電泳是分析本發(fā)明擴(kuò)增產(chǎn)物的優(yōu)選方法。如圖1所示，本發(fā)明提供了一種設(shè)備，其包括擴(kuò)增裝置64和分析裝置68，例如毛細(xì)管電泳儀。毛細(xì)管電泳儀是本領(lǐng)域所公知的。根據(jù)本發(fā)明有用的毛細(xì)管電泳儀包括但不局限于Applied Biosystems(Foster City，CA)的ABI PRISM3100 Genetic Analyzer、ABI PRISM3700 DNAAnalyzer、ABI PRISM377 DNA Sequencer、ABI PRISM310 Genetic Analyzer；Amersham Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)的MegaBACE 100 Capillary ArrayElectrophoresis System；Beckman Coulter(Fullerton，CA)的CEQTM8000 GeneticAnalytic System；Caliper Technologies(Mountain View，CA)的Agilent 2100Bioanalyzer；Convergent Bioscience Ltd.(Toronto，Canada)的iCE280 System。有用的毛細(xì)管電泳重復(fù)(repeat)儀可以如美國(guó)專利No.6,217,731；6,001,230；5,963,456；5,246,577；5,126,025；5,364,521；4,985,129；5,202,010；5,045,172；5,560,711；6,027,624；5,228,969；6,048,444；5,616,228；6,093,300；6,120,667；6,103,083；6,132,582；6,027,627；5,938,908和5,916,428所述，其整體內(nèi)容都通過引用并入本文。
在毛細(xì)管電泳中，包含背景電解液的兩個(gè)池通過含有相同溶液的毛細(xì)管相連通。每個(gè)池都配有電極。待分析樣品作為一個(gè)短的區(qū)帶引入毛細(xì)管的一端。對(duì)于樣品的引入來(lái)說(shuō)，毛細(xì)管的一端通常轉(zhuǎn)移到一個(gè)池中，將所需量的樣品溶液注入毛細(xì)管，然后將該毛細(xì)管末端轉(zhuǎn)移到背景溶液中。借助池中的電極，對(duì)毛細(xì)管施加電場(chǎng)，通常為200-1000V/cm，使帶電的粒子在毛細(xì)管中遷移。如果粒子在電場(chǎng)中具有不同的速度，則不同的粒子彼此分離。粒子區(qū)帶在不同的時(shí)間通過毛細(xì)管另一端的檢測(cè)器，其信號(hào)得以測(cè)定。
在一個(gè)實(shí)施方案中，毛細(xì)管電泳儀提供多個(gè)毛細(xì)管、電極/毛細(xì)管陣列、多腔管、管架、光學(xué)檢測(cè)區(qū)、毛細(xì)管束和高壓T裝置。毛細(xì)管的樣品端安置在電極/毛細(xì)管陣列中，第二末端由高壓T裝置所接收。
優(yōu)選的是，電極/毛細(xì)管陣列包括電極和毛細(xì)管的樣品端，其從毛細(xì)管電泳儀的底部突出。電極和毛細(xì)管樣品端的排列應(yīng)能夠浸入到96孔或384孔微滴定板的相應(yīng)樣品孔中。這需要96或384個(gè)毛細(xì)管，以充分利用微滴定板上的每個(gè)孔。
還優(yōu)選的是，毛細(xì)管位于牢固安置在管架上的相應(yīng)多腔管中。毛細(xì)管的暴露部分并排排列，不受多腔管的保護(hù)，然后通過帶有照相機(jī)裝置的光學(xué)檢測(cè)區(qū)。照相機(jī)裝置捕獲在暴露的毛細(xì)管中遷移的樣品圖像。然后將毛細(xì)管暴露的第二末端捆在一起，安裝到高壓T裝置上。
在一個(gè)實(shí)施方案中，擴(kuò)增裝置64和分析裝置68位于相同的機(jī)殼60中，如圖6所示。機(jī)殼60中的第一連接裝置66將擴(kuò)增裝置64和分析裝置68連接。
數(shù)據(jù)生成裝置120如圖5所示，本發(fā)明的分析裝置68可以進(jìn)行數(shù)據(jù)生成。作為替代方案，數(shù)據(jù)由圖3所示單獨(dú)的數(shù)據(jù)生成裝置120生成。
數(shù)據(jù)生成可以通過本領(lǐng)域中公知的方法實(shí)現(xiàn)，如美國(guó)專利No.6,217,731；6,001,230；5,963,456；5,246,577；5,126；025；5,364,521；4,985,129；5,202,010；5,045,172；5,560,711；6,027,624；5,228,969；6,048,444；5,616,228；6,093,300；6,120,667；6,103,083；6,132,582；6,027,627；5,938,908；5,900934；6,184,990和5,916,428中所述，其整體內(nèi)容都通過引用并入本文。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的數(shù)據(jù)生成裝置包括信號(hào)檢測(cè)儀、監(jiān)視器和連接控制電路與監(jiān)視器的計(jì)算機(jī)處理器。計(jì)算機(jī)處理器包括配置來(lái)與控制電路通信的輸入/輸出(I/O)界面，和儲(chǔ)存在監(jiān)視器上顯示圖形用戶界面的顯示程序的第一計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)器。
優(yōu)選的是，數(shù)據(jù)生成裝置能夠檢測(cè)和定量熒光團(tuán)所產(chǎn)生的熒光信號(hào)。所述的熒光團(tuán)包括但不局限于若丹明和衍生物(如Texas Red)、熒光素和衍生物(如5-溴甲基熒光素)、Lucifer Yellow、IAEDANS、7-Me2N-香豆素-4-乙酸酯、7-OH-4-CH3-香豆素-3-乙酸酯、7-NH2-4-CH3-香豆素-3-乙酸酯(AMCA)、monobromobimane、三磺酸芘，如Cascade Blue和monobromorimethy-amminobimane。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的裝置安裝有凹面反射鏡，其位于毛細(xì)管流動(dòng)池的一側(cè)，作為第一高數(shù)值孔徑(N.A.)收集器；透鏡收集器，其位于流動(dòng)池的相對(duì)側(cè)，作為第二高N.A.收集器；和光學(xué)纖維，其緊靠流動(dòng)池，用于發(fā)送激發(fā)光，使流動(dòng)池中所含的樣品發(fā)出發(fā)射光。反射鏡具有能反射發(fā)射光的凹面，收集器具有接收發(fā)射光的近凸面和校準(zhǔn)發(fā)射光的遠(yuǎn)凸面。這種排列能夠獲得跨越流動(dòng)池兩側(cè)的較大立體收集角，因此收集效率增加。可以使用兩個(gè)或多個(gè)光學(xué)纖維從不同的光源發(fā)送發(fā)射光。光學(xué)纖維與反射鏡、收集器的光軸呈平面正交排列，以減小發(fā)散的背景光的影響，從而提高信噪比。校準(zhǔn)的發(fā)射光可以通過例如光倍增管檢測(cè)器檢測(cè)。
級(jí)分的集器160在本發(fā)明中，所述的設(shè)備可以包括與分析裝置相連的級(jí)分收集器，以從分析裝置收集任何所需的多聚核苷酸樣品。如圖8所示，級(jí)分收集器160可以通過第四連接裝置140和分析裝置68相連。另外，如圖10所示，級(jí)分收集器160還可以通過第五連接裝置180和序列鑒定儀200相連。
傳統(tǒng)上，將級(jí)分收集器大致分為兩類。在第一類中，收集管以一般的矩形陣列排列，操作分配頭以選擇性地流入各個(gè)收集管。在第二類中，收集管以螺旋模式排列，安裝在通常為環(huán)形的轉(zhuǎn)盤上。當(dāng)分配頭放射狀移動(dòng)時(shí)，轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)動(dòng)，以沿螺旋模式跟蹤各收集管。本發(fā)明中可以使用任何級(jí)分收集器。這種級(jí)分收集器的例子包括但不局限于美國(guó)專利No.4,862,932；3,004,567；3,945,412；4,495,975；4,171,715中公開的級(jí)分收集器，每個(gè)專利的整體內(nèi)容通過引用并入本文。
已經(jīng)開發(fā)了級(jí)分收集器來(lái)滿足高通量分析系統(tǒng)的需要，這些收集器也可以整合到本發(fā)明的設(shè)備中。例如，美國(guó)專利No.6,309,541(其整體內(nèi)容通過引用并入本文)公開了自動(dòng)的級(jí)分收集裝置，其將微滴定板維持在固定的位置上，將樣品部分分配到微孔板中的選定孔中。級(jí)分收集裝置包括一個(gè)分配針，樣品部分可以通過該分配針分配到一次性的膨脹室中，然后分配入微滴定板中。分配針安裝在適于延伸至一次性膨脹室的分配頭上，樣品部分可以冷凝至膨脹室中，然后分配到微滴定板。
本發(fā)明中有用的另一種類型級(jí)分收集器是借助電泳的級(jí)分收集器，例如，它們描述在美國(guó)專利No.5,541,420；5,635,045；5,439,573；4,964,961；4,608,147；4,049,534；4,040940；3,989,612(每個(gè)專利的整體內(nèi)容通過引用并入本文)中。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的級(jí)分收集器具有以指定間隔分布的一個(gè)或多個(gè)電泳泳道，以通過電泳分離樣品，然后將分離的組分從電泳泳道中洗脫。使一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)移毛細(xì)管樣品的管的末端以指定的間隔靠近電泳泳道的末端，轉(zhuǎn)移洗脫自每個(gè)電泳泳道的分離組分。任選的是，使用連接裝置向間隙處提供緩沖液，通過緩沖液的鞘流動(dòng)(sheathflow)將分離的組分?jǐn)y帶至樣品轉(zhuǎn)移管。
其他有用的級(jí)分收集器包括但不局限于美國(guó)專利申請(qǐng)No.6,106,710；6,004,443；5,205,154和6,355,164，每個(gè)專利的整體內(nèi)容通過引用并入本文。
序列鑒定儀200本發(fā)明的設(shè)備還可以包括序列鑒定儀，以提供所需多聚核苷酸的序列，例如通過分析裝置鑒定的目的多聚核苷酸的序列。如圖10所示，序列鑒定儀200可以和級(jí)分收集器160相連，以鑒定所收集的每個(gè)級(jí)分中的多聚核苷酸序列。在如圖9和圖12所示的另一個(gè)實(shí)施方案中，序列鑒定儀200通過第五連接裝置180和分析裝置相連。在如圖11所示的另一個(gè)實(shí)施方案中，分析裝置68本身可以充當(dāng)序列鑒定儀。優(yōu)選的是，包含目的多聚核苷酸的樣品加載到分析裝置上進(jìn)行其序列分析。DNA測(cè)序通常通過Sanger等人(Proc.Nat.Acad.Sci.USA 745463，1977)的方法進(jìn)行，涉及從單鏈DNA模板與引物以酶法合成單鏈DNA。單鏈DNA模板和與模板相雜交的引物一起提供。使用DNA聚合酶將引物延伸，通過摻入適當(dāng)?shù)逆溄K止試劑，例如雙脫氧核苷酸，每個(gè)反應(yīng)都終止于特定的堿基(鳥嘌呤G、腺嘌呤A、胸腺嘧啶T或胞嘧啶C)。然后根據(jù)在多聚核苷酸的每個(gè)位置上摻入的鏈終止劑，確定多聚核苷酸的核苷酸序列。但是，還建立了其他的DNA測(cè)序儀和方法，也可用作本發(fā)明的序列鑒定儀。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述設(shè)備中不存在單獨(dú)的序列鑒定儀。擴(kuò)增裝置和分析裝置(如毛細(xì)管電泳儀)行使序列鑒定的功能?？梢韵驍U(kuò)增反應(yīng)中加入測(cè)序試劑混合物以進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，將部分測(cè)序反應(yīng)物轉(zhuǎn)移到分析裝置(例如，毛細(xì)管電泳儀)中進(jìn)行序列鑒定。用于測(cè)序反應(yīng)和序列鑒定的方法和試劑是本領(lǐng)域所公知的，例如參見Short Protocols In Molecular Biology，(Ausubel et al.，1995，同上)。
本發(fā)明中有用的序列鑒定儀可以包括但不局限于美國(guó)專利No.6,270,961；6,025,136；5,955,030；5,846,727；5,821,058；5,608,063；5,643,798；5,556,790；5,453,247；5,332,666；5,306,618；5,288,644；5,242,796；5,221,518和5,122,345中公開的序列鑒定儀，每個(gè)專利的整體內(nèi)容通過引用并入本文。
鑒定到的目的多聚核苷酸的序列可以和各種數(shù)據(jù)庫(kù)，如Genbank中的已有序列相比較。
連接裝置40、66、80、140或180本發(fā)明的連接裝置40、66、80、140或180能夠使兩個(gè)儀器之間的流體和/或信號(hào)相通，如圖1-12所示。優(yōu)選的是，本發(fā)明的連接裝置可以水平移動(dòng)和垂直移動(dòng)以轉(zhuǎn)移流體。連接裝置可以是管或通道，或機(jī)器手。連接裝置可以包含兩個(gè)或多個(gè)管。所述的兩個(gè)或多個(gè)管可以結(jié)合在一起。連接裝置所結(jié)合的區(qū)室，如擴(kuò)增裝置的反應(yīng)室可以是封閉的(除了連接裝置存在時(shí))，或者具有一個(gè)或多個(gè)開放側(cè)，同時(shí)使可用體積和本發(fā)明的目標(biāo)和目的相一致。例如，可以使用能夠施加選定電壓水平，包括接地電壓的電壓控制器將樣品通過連接裝置電動(dòng)轉(zhuǎn)移?？梢允褂枚鄠€(gè)分壓器和多個(gè)繼電器來(lái)行使電壓控制器的功能，以獲得選定的電壓水平。使用電動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)是樣品操作的可行方法，作為泵機(jī)制發(fā)揮作用。本發(fā)明還需要使用電滲流、以受控且可重復(fù)的方式混合各種流體。當(dāng)合適的流體置于由相應(yīng)合適的材料制成的管中時(shí)，管表面的官能團(tuán)可以離子化。電滲作用可以用作程序控制的泵機(jī)制。
例如，還可以使用蠕動(dòng)泵來(lái)實(shí)現(xiàn)泵作用，其機(jī)制是一個(gè)輥向下推動(dòng)流體室的可變形膜以減小室體積，擠壓流體室的可變形膜以減小其體積的活塞和其他泵作用模式是本領(lǐng)域所公知的。這些機(jī)制包括微機(jī)電裝置，如Shoji et al al.，“Fabrication of a Pumpfor Integrated Chemical Analyzing Systems，”Electronic and Communications in Japan，Part 2，70，52-59(1989)或Esashi et al.，“Normally closed microvalve and pump fabricatedon a silicon Wafer，”Sensors and Actuators，20，163-169(1989)中所報(bào)道的微機(jī)電裝置。
用于本發(fā)明的連接裝置40、66、140或180可以是機(jī)器手。機(jī)器手有形地將樣品、包含樣品的管或板從一個(gè)位置轉(zhuǎn)移到另一個(gè)位置。易于作為常規(guī)程序?qū)嵤┳詣?dòng)化的取樣過程，并避免人為取樣誤差(即，樣品大小的誤差和跟蹤樣品特性的誤差)和人為取樣污染的可能性。能夠從熱循環(huán)儀中取出部分樣品的機(jī)器手是本領(lǐng)域中可以得到的。例如，Mitsubishi RV-E2 Robotic Arm可以和SciCloneTMLiquid Handler或RobbinsScientific Hydra 96 pippttor聯(lián)用。優(yōu)選的是，本發(fā)明的機(jī)器手可以包括機(jī)動(dòng)化平臺(tái)，其能夠水平移動(dòng)和垂直移動(dòng)以轉(zhuǎn)移樣品。
在一個(gè)實(shí)施方案中，第一連接裝置66將擴(kuò)增裝置64和分析裝置68相連，使流體可以轉(zhuǎn)運(yùn)并進(jìn)行特定的分析。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一連接裝置66能夠自動(dòng)將流體樣品加到分析裝置68的加樣孔中。置于加樣孔中的樣品體積或樣品“塞(plug)”下降到分析通道中，在此處進(jìn)行所需的分析。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，分析裝置68是毛細(xì)管電泳裝置。因此，對(duì)于這種操作來(lái)說(shuō)，主通道或分析通道通常包括篩分基質(zhì)、置于其中的緩沖液或介質(zhì)，以優(yōu)化樣品中組份的電泳分離。但是，通過閱讀本申請(qǐng)可以理解，所述的分析裝置68還可以是各種非CE儀，可用于對(duì)樣品進(jìn)行許多不同分析反應(yīng)中的任意反應(yīng)。
優(yōu)選的是，用來(lái)轉(zhuǎn)移樣品的連接裝置66能夠在擴(kuò)增過程中從擴(kuò)增反應(yīng)物中取出部分樣品。連接裝置66可以包括移液tip頭或針，其在一次取樣后就除掉，或在每次取樣后引入一個(gè)或多個(gè)洗滌針或tip頭的步驟。作為替代方案，連接裝置可以將用于毛細(xì)管電泳的毛細(xì)管直接和擴(kuò)增反應(yīng)物接觸，以將部分樣品加到毛細(xì)管中。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在每個(gè)PCR循環(huán)結(jié)束時(shí)，第一連接裝置66將PCR擴(kuò)增反應(yīng)混合物的部分樣品從擴(kuò)增裝置轉(zhuǎn)移到分析裝置。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二連接裝置40將多聚核苷酸提取裝置和擴(kuò)增裝置相連。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二連接裝置還可以用于將包含dNTP、引物、必要試劑和DNA聚合酶的混合物補(bǔ)充至擴(kuò)增反應(yīng)混合物，其濃度與起始反應(yīng)混合物相同。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用不同的連接裝置補(bǔ)充擴(kuò)增反應(yīng)混合物。這種連接裝置可以以本申請(qǐng)中所述的相同方式制造，以轉(zhuǎn)移流體。
優(yōu)選的是，本發(fā)明的第一連接裝置能夠?qū)U(kuò)增反應(yīng)混合物的部分樣品加到分析裝置上，如加到毛細(xì)管電泳儀上。這種加樣功能可以通過本領(lǐng)域中公知的方法實(shí)現(xiàn)，例如美國(guó)專利No.6,280,589；6,192,768；6,190,521；6,132,582和6,033,546中所公開的方法，其整體內(nèi)容都通過引用并入本文。
在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品作為樣品塞注入連接裝置中，連接裝置包括至少一個(gè)電解緩沖液通道和樣品供應(yīng)和排放通道。供應(yīng)和排放通道在分析裝置68的各個(gè)供應(yīng)口和排放口處進(jìn)入電解液通道。供應(yīng)口和排放口之間的距離在幾何學(xué)上限定樣品體積。樣品塞向電解液通道的注入通過跨供應(yīng)和排放通道施加電場(chǎng)一段時(shí)間而電動(dòng)完成，其中所述的時(shí)間至少應(yīng)使具有最小電泳遷移率的樣品組分包含在幾何學(xué)上限定的體積中。每個(gè)供應(yīng)和排放通道都傾向電解液通道。提供了將樣品電動(dòng)注入樣品體積的裝置。供應(yīng)源和排放通道對(duì)電解緩沖液的流動(dòng)阻力至少比電解液通道的流動(dòng)阻力低約5％。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用本領(lǐng)域中公知的水力方法將樣品引入第一連接裝置。樣品通過壓力差注入到毛細(xì)管中。壓力差通過將毛細(xì)管末端置于不同的水平上而產(chǎn)生，由此產(chǎn)生水力壓力差，或者借助氣體在可密封的樣品池中產(chǎn)生超壓力，超壓力將樣品溶液注射入毛細(xì)管中。通過選擇壓力差和其有效時(shí)間來(lái)控制通過毛細(xì)管的樣品量。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過將樣品注射毛細(xì)管放置在毛細(xì)管區(qū)帶電泳設(shè)備中毛細(xì)管的入口端附近，借助固定的或可移動(dòng)的樣品注射毛細(xì)管來(lái)注射樣品，其方式應(yīng)使樣品溶液完全包圍入口端。借助電泳電流或以其他的方式將樣品轉(zhuǎn)移到分離毛細(xì)管中，預(yù)定的時(shí)間后，將溶液從入口端附近取出，其中樣品溶液換為背景溶液。
但是，在一個(gè)不同的實(shí)施方案中，不使用第一連接裝置將擴(kuò)增裝置和毛細(xì)管電泳分析裝置連接。相反，通過將電泳儀的毛細(xì)管和電極直接浸在PCR反應(yīng)物中，將擴(kuò)增多聚核苷酸樣品的一部分加到電泳儀上。優(yōu)選的是，可以在電極上施加一定的電流一段時(shí)間，迫使多聚核苷酸樣品在上述電動(dòng)力的作用下進(jìn)入毛細(xì)管。施加電流的時(shí)間，例如，約0.001秒、0.01秒、0.1秒、1秒或10秒或更長(zhǎng)，取決于毛細(xì)管需要取來(lái)用于毛細(xì)管電泳分析的樣品體積。該實(shí)施方案提供了將樣品加到分析裝置上的更簡(jiǎn)單方法。
第三連接裝置80將分析裝置68和位于分析裝置外部的數(shù)據(jù)生成裝置120連接。
第四連接裝置140用在一個(gè)實(shí)施方案中，將分析裝置68和級(jí)分收集器160連接。但是，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，在分析裝置和級(jí)分收集器之間不使用連接裝置。
第五連接裝置180用在某些實(shí)施方案中，將序列鑒定儀200和分析裝置68或級(jí)分收集器160連接，從而可以獲得目的多聚核苷酸的序列鑒定。
在某些實(shí)施方案中，第一、第二、第四和第五連接裝置可以是單一的連接裝置，例如，將流體從一個(gè)儀器轉(zhuǎn)移到另一個(gè)儀器的機(jī)器手。單一的機(jī)器手將流體從一個(gè)儀器轉(zhuǎn)移到第二個(gè)儀器，自我洗滌和清洗，然后將流體從一個(gè)儀器轉(zhuǎn)移到第三個(gè)儀器。
可用于制造本發(fā)明連接裝置的適當(dāng)基材可以由各種材料的任意一種或材料的組合制成。通常，連接裝置使用本領(lǐng)域中公知的固體基材制成，例如二氧化硅基基材，如玻璃、石英、硅或多晶硅，以及其他公知的基材，即砷化鎵。作為替代方案，聚合物基材可以用于制造本發(fā)明的連接裝置，包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚氨酯、聚氯乙烯(PVC)、聚苯乙烯、聚砜、聚碳酸酯、聚甲基戊烯、聚丙烯、聚乙烯、聚偏二氟乙烯、ABS(丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物)和類似材料。
本發(fā)明提供用于繪制轉(zhuǎn)錄譜的自動(dòng)化設(shè)備。所述設(shè)備能夠擴(kuò)增目標(biāo)多聚核苷酸，對(duì)目標(biāo)多聚核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。所述設(shè)備還能夠進(jìn)行多聚核苷酸提取和逆轉(zhuǎn)錄。所述設(shè)備還能夠鑒定目的多聚核苷酸(例如，在兩個(gè)或多個(gè)樣品中差異表達(dá)的基因)，并對(duì)目的多聚核苷酸進(jìn)行序列鑒定。
圖13所示為使用本發(fā)明的設(shè)備繪制表達(dá)譜過程的示意圖。例如，該過程可以使用圖10所示的設(shè)備進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，圖10中所有的儀器都位于一個(gè)機(jī)殼中。可以分別提取RNA，或通過如圖2所示與擴(kuò)增裝置相連的多聚核苷酸提取裝置進(jìn)行提取(步驟1)。擴(kuò)增裝置64能夠進(jìn)行cDNA合成和擴(kuò)增(例如，通過PCR，步驟2)。在每個(gè)PCR循環(huán)結(jié)束時(shí)，取出擴(kuò)增產(chǎn)物的部分樣品，在分析裝置68上進(jìn)行分析(例如，毛細(xì)管電泳儀，步驟3)。差異表達(dá)的多聚核苷酸可以通過級(jí)分收集器160收集(步驟4)，一個(gè)或多個(gè)差異表達(dá)的多聚核苷酸的序列可以通過序列鑒定儀200鑒定(步驟5)。對(duì)于步驟5來(lái)說(shuō)，可以加入測(cè)序試劑總混合物，測(cè)序反應(yīng)混合物可以根據(jù)本領(lǐng)域中的公知方法進(jìn)行孵育。在一個(gè)實(shí)施方案中，隨后將測(cè)序反應(yīng)混合物加到分析裝置68(例如，毛細(xì)管電泳儀)上進(jìn)行序列鑒定。在另一個(gè)實(shí)施方案中，級(jí)分收集器60所收集的部分級(jí)分可以返回到擴(kuò)增裝置64上進(jìn)行隨后的反應(yīng)。然后將反應(yīng)產(chǎn)物加到分析裝置68上進(jìn)行序列鑒定。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的設(shè)備用于分析基因組DNA樣品(例如，對(duì)基因的基因組拷貝數(shù)進(jìn)行定量)。這種技術(shù)和基于探針的分析或在整個(gè)基因組基礎(chǔ)上的染色體組型分析相比具有更低的成本和更高的分辨率?；蚪MDNA分析的過程可以與RNA分析的過程(如上所述)類似，只是使用基因組DNA時(shí)不需要進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和cDNA合成。基因組DNA分析的過程可以自2個(gè)或多個(gè)待比較的樣品中分離基因組DNA開始。樣品可以分成多份(如5、10、20或30或更多份)。每一份可以用不同的引物組(例如，對(duì)于所有待分析樣品份來(lái)說(shuō)，共5、10、20或30或更多個(gè)引物組)擴(kuò)增。對(duì)于每個(gè)引物組來(lái)說(shuō)，一個(gè)引物可以與共有重復(fù)序列互補(bǔ)，或只是隨機(jī)序列，其具有樣品特異性序列標(biāo)簽，從而具有樣品特異性。其他引物可以是隨機(jī)引物。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)或多個(gè)樣品在相同的條件下使用相同的引物擴(kuò)增，隨之形成PCR產(chǎn)物梯帶，其來(lái)自于隨機(jī)散布在整個(gè)基因組中的基因座位點(diǎn)。然后測(cè)定每個(gè)PCR產(chǎn)物的量，在樣品之間進(jìn)行比較。這樣就可以鑒定到基因組范圍的不同基因座位點(diǎn)處拷貝數(shù)的差異。這些差異指示為局部復(fù)制或擴(kuò)增；三染色體性；和喪失雜合性。
作為替代方案，基因座特異性引物組(即，在靶基因座處識(shí)別特異序列的引物)可用于PCR擴(kuò)增，確定兩個(gè)或多個(gè)樣品之間特定基因座位點(diǎn)處的拷貝數(shù)變化。
上述實(shí)施方案說(shuō)明了在制造和實(shí)施本發(fā)明中本發(fā)明人所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)和使用的技術(shù)。應(yīng)該認(rèn)為這些實(shí)施方案包括報(bào)告實(shí)施本發(fā)明的技術(shù)并說(shuō)明其有用性的技術(shù)內(nèi)容。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解本文所公開的技術(shù)和實(shí)施方案僅是優(yōu)選的實(shí)施方案，一般來(lái)說(shuō)可以采用多種等價(jià)的方法和技術(shù)來(lái)獲得相同的結(jié)果。
本文上面所述所有參考文獻(xiàn)的整體內(nèi)容都通過引用并入本文。
權(quán)利要求
1.一種繪制表達(dá)圖譜的設(shè)備，包括擴(kuò)增反應(yīng)混合物中的多聚核苷酸以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增裝置；和通過第一連接裝置與所述擴(kuò)增裝置相連的分析裝置，所述的第一連接裝置將反應(yīng)混合物的部分樣品從所述的擴(kuò)增裝置轉(zhuǎn)移到檢測(cè)和定量所述擴(kuò)增產(chǎn)物的所述分析裝置；其中所述的第一連接裝置是機(jī)器手。
2.權(quán)利要求1的設(shè)備，其還包括通過第二連接裝置和所述擴(kuò)增裝置相連的多聚核苷酸提取裝置，所述的第二連接裝置將提取的多聚核苷酸樣品從所述的多聚核苷酸提取裝置轉(zhuǎn)移到所述的擴(kuò)增裝置。
3.權(quán)利要求1的設(shè)備，其還包括級(jí)分收集器。
4.權(quán)利要求3的設(shè)備，其中所述的級(jí)分收集器通過第四連接裝置和所述的分析裝置相連，以收集定量產(chǎn)物。
5.權(quán)利要求1的設(shè)備，其還包括鑒定定量產(chǎn)物序列的序列鑒定儀，其中所述的序列鑒定儀通過第五連接裝置和所述的分析裝置相連，所述的第五連接裝置將定量產(chǎn)物從所述的分析裝置轉(zhuǎn)移到所述的序列鑒定儀。
6.權(quán)利要求3的設(shè)備，其還包括鑒定定量產(chǎn)物序列的序列鑒定儀，其中所述的序列鑒定儀通過第五連接裝置和所述的級(jí)分收集器相連，所述的第五連接裝置將收集的產(chǎn)物從所述的級(jí)分收集器轉(zhuǎn)移到所述的序列鑒定儀。
7.一種繪制表達(dá)圖譜的設(shè)備，包括擴(kuò)增反應(yīng)混合物中的多聚核苷酸以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增裝置；通過第一連接裝置與所述擴(kuò)增裝置相連的分析裝置，所述的第一連接裝置將反應(yīng)混合物的部分樣品從所述的擴(kuò)增裝置轉(zhuǎn)移到檢測(cè)和定量所述擴(kuò)增產(chǎn)物的所述分析裝置；和通過第二連接裝置和所述擴(kuò)增裝置相連的多聚核苷酸提取裝置，所述的第二連接裝置將提取的多聚核苷酸樣品從所述的多聚核苷酸提取裝置轉(zhuǎn)移到所述的擴(kuò)增裝置。
8.權(quán)利要求7的設(shè)備，其還包括級(jí)分收集器。
9.權(quán)利要求8的設(shè)備，其中所述的級(jí)分收集器通過第四連接裝置和所述的分析裝置相連，以收集定量產(chǎn)物。
10.權(quán)利要求7的設(shè)備，其還包括鑒定定量產(chǎn)物序列的序列鑒定儀，其中所述的序列鑒定儀通過第五連接裝置和所述的分析裝置相連，所述的第五連接裝置將定量產(chǎn)物從所述的毛細(xì)管電泳儀轉(zhuǎn)移到所述的序列鑒定儀。
11.權(quán)利要求8的設(shè)備，其還包括鑒定定量產(chǎn)物序列的序列鑒定儀，其中所述的序列鑒定儀通過第五連接裝置和所述的級(jí)分收集器相連，所述的第五連接裝置將收集的產(chǎn)物從所述的級(jí)分收集器轉(zhuǎn)移到所述的序列鑒定儀。
12.一種繪制表達(dá)圖譜的設(shè)備，包括擴(kuò)增反應(yīng)混合物中的多聚核苷酸以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增裝置；通過第一連接裝置與所述擴(kuò)增裝置相連的分析裝置，所述的第一連接裝置將反應(yīng)混合物的部分樣品從所述的擴(kuò)增裝置轉(zhuǎn)移到檢測(cè)和定量所述擴(kuò)增產(chǎn)物的所述分析裝置；和通過第三連接裝置和所述分析裝置相連的數(shù)據(jù)生成裝置，所述的第三連接裝置將信號(hào)從所述分析裝置轉(zhuǎn)移到所述的數(shù)據(jù)生成裝置。
13.權(quán)利要求12的設(shè)備，其還包括通過第二連接裝置和所述擴(kuò)增裝置相連的多聚核苷酸提取裝置，所述的第二連接裝置將提取的多聚核苷酸樣品從所述的多聚核苷酸提取裝置轉(zhuǎn)移到所述的擴(kuò)增裝置。
14.權(quán)利要求12的設(shè)備，其還包括級(jí)分收集器。
15.權(quán)利要求14的設(shè)備，其中所述的級(jí)分收集器通過第四連接裝置和所述的分析裝置相連，以收集定量產(chǎn)物。
16.權(quán)利要求12的設(shè)備，其還包括鑒定定量產(chǎn)物序列的序列鑒定儀，其中所述的序列鑒定儀通過第五連接裝置和所述的分析裝置相連，所述的第五連接裝置將定量產(chǎn)物從所述的分析裝置轉(zhuǎn)移到所述的序列鑒定儀。
17.權(quán)利要求12的設(shè)備，其還包括鑒定定量產(chǎn)物序列的序列鑒定儀，其中所述的序列鑒定儀通過第五連接裝置和所述的級(jí)分收集器相連，所述的第五連接裝置將收集的產(chǎn)物從所述的級(jí)分收集器轉(zhuǎn)移到所述的序列鑒定儀。
18.一種繪制表達(dá)圖譜的設(shè)備，包括擴(kuò)增反應(yīng)混合物中的多聚核苷酸以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增裝置；通過第一連接裝置與所述擴(kuò)增裝置相連的分析裝置，所述的第一連接裝置將反應(yīng)混合物的部分樣品從所述的擴(kuò)增裝置轉(zhuǎn)移到檢測(cè)和定量所述擴(kuò)增產(chǎn)物的所述分析裝置；和收集定量產(chǎn)物的級(jí)分收集器。
19.權(quán)利要求18的設(shè)備，其中所述的級(jí)分收集器通過第四連接裝置和所述的分析裝置相連，以收集定量產(chǎn)物。
20.權(quán)利要求18的設(shè)備，其還包括通過第二連接裝置和所述擴(kuò)增裝置相連的多聚核苷酸提取裝置，所述的第二連接裝置將提取的多聚核苷酸樣品從所述的多聚核苷酸提取裝置轉(zhuǎn)移到所述的擴(kuò)增裝置。
21.權(quán)利要求18的設(shè)備，其還包括鑒定定量產(chǎn)物序列的序列鑒定儀，其中所述的序列鑒定儀通過第五連接裝置和所述的級(jí)分收集器相連，所述的第五連接裝置將收集的產(chǎn)物從所述的級(jí)分收集器轉(zhuǎn)移到所述的序列鑒定儀。
22.一種繪制表達(dá)圖譜的設(shè)備，包括擴(kuò)增反應(yīng)混合物中的多聚核苷酸以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增裝置；通過第一連接裝置與所述擴(kuò)增裝置相連的分析裝置，所述的第一連接裝置將反應(yīng)混合物的部分樣品從所述的擴(kuò)增裝置轉(zhuǎn)移到檢測(cè)和定量所述擴(kuò)增產(chǎn)物的所述分析裝置；和鑒定定量產(chǎn)物序列的序列鑒定儀，其中所述的序列鑒定儀通過第五連接裝置和所述的分析裝置相連，所述的第五連接裝置將定量產(chǎn)物從所述的分析裝置轉(zhuǎn)移到所述的序列鑒定儀。
23.權(quán)利要求22的設(shè)備，其還包括通過第二連接裝置和所述擴(kuò)增裝置相連的多聚核苷酸提取裝置，所述的第二連接裝置將提取的多聚核苷酸樣品從所述的多聚核苷酸提取裝置轉(zhuǎn)移到所述的擴(kuò)增裝置。
24.權(quán)利要求22的設(shè)備，其還包括級(jí)分收集器。
25.權(quán)利要求24的設(shè)備，其中所述的級(jí)分收集器通過第四連接裝置和所述的分析裝置相連，以收集定量產(chǎn)物，其中所述的級(jí)分收集器還通過另一個(gè)第五連接裝置和所述的序列鑒定儀相連，所述的第五連接裝置將收集的產(chǎn)物從所述的級(jí)分收集器轉(zhuǎn)移到所述的序列鑒定儀。
26.權(quán)利要求1、7、12、18和22中任意一項(xiàng)的設(shè)備，其中所述的擴(kuò)增裝置和所述的分析裝置還能夠進(jìn)行多聚核苷酸的序列鑒定。
27.一種繪制表達(dá)圖譜的設(shè)備，包括擴(kuò)增反應(yīng)混合物中的多聚核苷酸以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增裝置；和檢測(cè)和定量所述擴(kuò)增產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳儀，其中所述毛細(xì)管電泳儀的毛細(xì)管浸在所述的反應(yīng)混合物中，將所述反應(yīng)混合物的部分樣品從所述的擴(kuò)增裝置轉(zhuǎn)移到所述的毛細(xì)管電泳儀。
28.權(quán)利要求27的設(shè)備，其還包括通過第二連接裝置和所述擴(kuò)增裝置相連的多聚核苷酸提取裝置，所述的第二連接裝置將提取的多聚核苷酸樣品從所述的多聚核苷酸提取裝置轉(zhuǎn)移到所述的擴(kuò)增裝置。
29.權(quán)利要求27的設(shè)備，其還包括級(jí)分收集器。
30.權(quán)利要求27的設(shè)備，其中所述的級(jí)分收集器通過第四連接裝置和所述的毛細(xì)管電泳儀相連，以收集定量產(chǎn)物。
31.權(quán)利要求27的設(shè)備，其還包括鑒定定量產(chǎn)物序列的序列鑒定儀，其中所述的序列鑒定儀通過第五連接裝置和所述的毛細(xì)管電泳儀相連，所述的第五連接裝置將定量產(chǎn)物從所述的毛細(xì)管電泳儀轉(zhuǎn)移到所述的序列鑒定儀。
32.權(quán)利要求27的設(shè)備，其中向毛細(xì)管電泳儀的電極上施加電流，使浸在所述反應(yīng)混合物中的所述毛細(xì)管電泳儀的毛細(xì)管將所述反應(yīng)混合物的部分樣品從所述的擴(kuò)增裝置轉(zhuǎn)移到所述的毛細(xì)管電泳儀。
33.權(quán)利要求27的設(shè)備，其中所述的擴(kuò)增裝置和所述的毛細(xì)管電泳儀還能夠進(jìn)行多聚核苷酸的序列鑒定。
34.權(quán)利要求29的設(shè)備，其還包括鑒定定量產(chǎn)物序列的序列鑒定儀，其中所述的序列鑒定儀通過第五連接裝置和所述的級(jí)分收集器相連，所述的第五連接裝置將收集的產(chǎn)物從所述的級(jí)分收集器轉(zhuǎn)移到所述的序列鑒定儀。
35.權(quán)利要求1、7、12、18、22和27中任意一項(xiàng)的設(shè)備，其中所述的擴(kuò)增裝置是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增裝置。
36.權(quán)利要求35的設(shè)備，其中所述的第一連接裝置在每個(gè)PCR循環(huán)結(jié)束時(shí)將反應(yīng)混合物的部分樣品從所述的擴(kuò)增裝置轉(zhuǎn)移到所述的分析裝置。
37.權(quán)利要求1、7、12、18、22和27中任意一項(xiàng)的設(shè)備，其中所述的擴(kuò)增裝置能夠進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，生成cDNA。
38.權(quán)利要求37的設(shè)備，其中用于逆轉(zhuǎn)錄的一個(gè)或多個(gè)引物與反應(yīng)管內(nèi)壁或微滴定板的孔內(nèi)壁化學(xué)連接。
39.權(quán)利要求1、7、12、18、22和27中任意一項(xiàng)的設(shè)備，其中所述的設(shè)備能夠檢測(cè)和定量一種或多種熒光標(biāo)記物所產(chǎn)生的信號(hào)。
40.權(quán)利要求1、7、12、18、22和27中任意一項(xiàng)的設(shè)備，其中所述的第一、第二、第四或第五連接裝置是機(jī)器手。
41.權(quán)利要求1、7、12、18、22和27中任意一項(xiàng)的設(shè)備，其中所述的第一、第二、第三、第四或第五連接裝置是管或通道。
42.權(quán)利要求1、7、12、18、22和27中任意一項(xiàng)的設(shè)備，其中所述的第一、第二、第四和第五連接裝置是單一的連接裝置。
43.權(quán)利要求1、7、12、18、22和27中任意一項(xiàng)的設(shè)備，其中電流施加在所述的第一、第二、第四或第五連接裝置上，以進(jìn)行轉(zhuǎn)移。
44.權(quán)利要求1、7、12、18和22中任意一項(xiàng)的設(shè)備，其中所述的分析裝置是毛細(xì)管電泳儀。
45.權(quán)利要求2、7、12、20、23和28中任意一項(xiàng)的設(shè)備，其中所述的多聚核苷酸提取裝置從一種或多種生物材料中分離總RNA或mRNA。
全文摘要
用于表達(dá)譜分析、將生物材料進(jìn)行多聚核苷酸提取、擴(kuò)增和分析的設(shè)備。該設(shè)備包括擴(kuò)增多聚核苷酸的擴(kuò)增裝置和對(duì)擴(kuò)增的多聚核苷酸產(chǎn)物進(jìn)行定量的分析裝置。設(shè)備中的擴(kuò)增裝置還可以提取多聚核苷酸以制備擴(kuò)增用模板，或?qū)Χ慷嗑酆塑账岙a(chǎn)物進(jìn)行序列鑒定。級(jí)分收集器可以包括在所述設(shè)備中，以在序列鑒定前收集定量的多聚核苷酸產(chǎn)物。分析裝置還能夠進(jìn)行數(shù)據(jù)生成，或者作為替代方案，通過與所述設(shè)備聯(lián)用的分離的數(shù)據(jù)生成裝置來(lái)生成數(shù)據(jù)。所述設(shè)備中的裝置通過連接裝置相連，這些連接裝置能夠傳輸用作擴(kuò)增和分析的流體或信號(hào)。
文檔編號(hào)G01N35/00GK1668766SQ03817245
公開日2005年9月14日 申請(qǐng)日期2003年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月20日
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