專利名稱：識別靶多核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測靶多核苷酸以及測定其序列的方法，特別是涉及表征存在于所述靶多核苷酸中的突變的方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)已認(rèn)識到很多病變均歸因于受試者基因組中所存在的突變。即便某種病變的癥狀并不明顯，但是特定突變的存在可能表示將來患該病變的風(fēng)險增加。因此，進(jìn)行了很多鑒定與具體疾病相關(guān)的突變的研究，并且進(jìn)行了開發(fā)診斷測試的研究，目的在于幫助預(yù)測患所述疾病的可能性。
盡管很多疾病相關(guān)突變已被表征，但仍需尋求一種測定具體受試者中是否存在特定靶序列特別是含有突變的靶序列的高效可靠的方法。一般而言，可通過對從患者獲得的基因組DNA進(jìn)行測序并將此序列信息與對照相比較來鑒定突變。
通常用于大規(guī)模DNA測序的主要方法是鏈終止法。該方法最初由Sanger和Coulson(Sanger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1977；745463-5467)所開發(fā)，它有賴于四種核苷酸的雙脫氧衍生物的使用，所述雙脫氧衍生物在聚合酶反應(yīng)中被摻入新生多核苷酸鏈中。一旦摻入，所述雙脫氧衍生物就會終止聚合酶反應(yīng)，然后通過凝膠電泳分離產(chǎn)物，并對其進(jìn)行分析以揭示具體雙脫氧衍生物摻入鏈中的位置。
盡管所述方法被廣泛應(yīng)用并且可獲得可靠的結(jié)果，但是發(fā)現(xiàn)該方法速度慢、勞動強度大且花費大。
US-A-5302509公開了一種對固定在固體支持物上的多核苷酸進(jìn)行測序的方法。所述方法有賴于在DNA聚合酶的存在下，將具有不同熒光標(biāo)記的3-封閉堿基A、G、C和T摻入至所固定的多核苷酸。聚合酶可摻入與靶多核苷酸互補的堿基，但是卻被3’-封閉基團(tuán)阻止進(jìn)一步加入。然后測定所摻入堿基的標(biāo)記，并通過化學(xué)斷裂除去封閉基團(tuán)，使得進(jìn)行進(jìn)一步聚合。但是，這種需要除去封閉基團(tuán)的操作耗費時間，并且必須高效進(jìn)行。
很多現(xiàn)有技術(shù)中存在的另一個困難是它們并不能表征存在于單基因組中的多種突變。因此，這樣一種方法是有益的，所述方法中僅在單次分析過程中就可表征多種突變并且此方法可檢測任何突變(從單個點突變到整個染色體重排)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于這樣一種發(fā)現(xiàn)樣本中是否存在靶多核苷酸分子可通過如下方法檢測所述靶多核苷酸與至少兩種多核苷酸探針雜交，其中至少一種多核苷酸探針編碼靶序列上的信息；連接探針以形成單個含有信息的多核苷酸并檢測連接產(chǎn)物。所述靶多核苷酸的序列可通過解碼所述連接得到多核苷酸中的信息來確定。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，鑒定樣本中是否存在單鏈靶多核苷酸的方法包括如下步驟(i)雜交條件下將所述靶多核苷酸與至少第一種和第二種多核苷酸探針相接觸，其中每一種多核苷酸探針包含與所述靶多核苷酸的相鄰非重疊區(qū)互補的第一區(qū)域；(ii)將雜交至所述靶多核苷酸的那些第一種和第二種多核苷酸連接在一起；(iii)任選擴(kuò)增任何所連接的多核苷酸；和(iv)通過檢測任何所連接的多核苷酸，測定所述靶多核苷酸是否存在于原始樣本中，其中所述第一種和第二種多核苷酸中的至少一種包含具有確定多核苷酸序列的第二區(qū)域，并且所述第一區(qū)域的每個單獨核苷酸由所述第二區(qū)域的至少兩個核苷酸表示，并通過測定所述第一種和第二種多核苷酸探針中的至少一種的第二區(qū)域來鑒定所連接多核苷酸。
本發(fā)明的第二方面為測定靶多核苷酸上的序列的順序提供了可能。根據(jù)此方面，確定靶多核苷酸上的至少兩個靶序列的順序的方法包括如下步驟(i)雜交條件下將所述靶多核苷酸與至少第一種和第二種多核苷酸探針相接觸，其中每一種多核苷酸探針包含與所述靶多核苷酸的非相鄰區(qū)域互補的第一區(qū)域；(ii)進(jìn)行聚合酶反應(yīng)，以在至少兩種探針之間摻入核苷酸，由此形成第三種多核苷酸，并；(iii)通過檢測任何第三種多核苷酸，測定所述靶多核苷酸上兩個所述靶序列的順序以及兩者之間的距離，其中所述第一種和第二種多核苷酸包含具有確定多核苷酸序列的第二區(qū)域，并且所述第一區(qū)域的每個單獨核苷酸由所述第二區(qū)域的至少兩個核苷酸表示，并且所述第三種多核苷酸中探針的順序以及之間的距離可通過測定所述第一種和第二種多核苷酸探針的第二區(qū)域來鑒定。
本發(fā)明能在單次反應(yīng)中檢測多種靶分子并表征多種特定突變。從單點突變到整個染色體重排的任何突變均可被表征。每種突變的信息編碼于在分析過程結(jié)束之際可被分離和表征的分子內(nèi)。
具體實施例方式
本發(fā)明用于檢測靶多核苷酸和表征所述靶多核苷酸中的突變。靶多核苷酸與至少兩種多核苷酸探針相接觸，所述多核苷酸探針可與靶多核苷酸的不同區(qū)域雜交。所雜交的探針通過共價連接形成含有關(guān)于靶多核苷酸上的信息的單個多核苷酸，然后檢測并表征所述單個多核苷酸。若所述靶序列不存在于樣本中，就不會發(fā)生雜交并且不會檢測到探針。
設(shè)計大量與多種不同靶序列雜交的多核苷酸探針，將其同時或先后加入樣本中。優(yōu)選地，樣本為基因組DNA樣本。實施本發(fā)明的方法可鑒定該樣本是否含有與該探針互補的任何靶序列；就與兩種或多種探針雜交的每個靶序列而言，將產(chǎn)生含有至少兩種探針的所連接得到的多核苷酸。該方法可在一次分析過程中表征多種突變。
術(shù)語“多核苷酸”為本領(lǐng)域所熟知，用來指一系列連接的核酸分子例如DNA或RNA。核酸類似物如PNA、LNA(鎖核酸)以及2’-O-methRNA也在本發(fā)明范圍內(nèi)。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言顯而易見的是，靶多核苷酸的最常見來源為從受試者獲得的基因組DNA。為了使寡核苷酸探針與靶多核苷酸雜交，雜交時探針和靶標(biāo)均必須為單鏈。
本文所使用的術(shù)語“堿基”指每種核酸單體A、T(U)、G或C。這些縮寫表示核苷酸堿基腺嘌呤、胸腺嘧啶(尿嘧啶)、鳥嘌呤和胞嘧啶。多核苷酸為RNA時，尿嘧啶代替胸腺嘧啶，或者可使用dUTP將其摻入DNA中，這些也為本領(lǐng)域所知。
本文所使用的術(shù)語“突變體”是指至少有一個核苷酸不同于對照序列的序列。突變可為一個或多個特定核酸堿基的置換、缺失或插入。優(yōu)選地，本發(fā)明用于鑒定存在于基因組DNA片段的一種或多種單核苷酸多態(tài)性(SNP)。本文所使用的術(shù)語“多態(tài)性”是指不同基因組之間或之中或受試者之間或之中兩個或多個可供選擇的基因組序列或等位基因發(fā)生改變。一個SNP為一個堿基變化。一般而言，一個SNP是指多態(tài)位點的一個核苷酸由另一個核苷酸所替換。單個核苷酸的缺失或單個核苷酸的插入同樣也引起單核苷酸多態(tài)性。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，檢測到跨越一個以上堿基的突變。
本發(fā)明需要可與靶多核苷酸的不同的、非重疊區(qū)域雜交的多核苷酸探針。每種探針大小可相同，或者每種探針大小可不同。優(yōu)選地，與探針雜交的靶多核苷酸區(qū)域長2個至50個堿基，更優(yōu)選長3個至20個堿基。
至少有兩種探針與靶多核苷酸雜交。優(yōu)選地，2種至10種探針雜交，更優(yōu)選2種、3種或4種。雜交后，可將探針連接在一起形成單個多核苷酸，所述單個多核苷酸含有與探針雜交的所述靶多核苷酸序列上的信息。
每種探針可與同一靶序列互補，即多種單個探針被加至該靶序列上，或者可加入與不同靶序列互補的探針。正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解的那樣，兩個或多個同一探針的使用可鑒定靶多核苷酸中的序列重復(fù)。三聯(lián)體重復(fù)與幾種遺傳病相關(guān)，例如脆性X綜合征與CGG三聯(lián)體重復(fù)有關(guān)，強直性肌營養(yǎng)不良與CTG重復(fù)有關(guān)，杭廷頓舞蹈病(Huntingdon′s disease)與CAG重復(fù)有關(guān)。這些疾病一般涉及到患病個體中重復(fù)序列的數(shù)目的增加。因此可設(shè)計與這些重復(fù)序列雜交的探針。該探針可與單個重復(fù)雜交，即與重復(fù)三聯(lián)體的3個堿基雜交，或者可與多個重復(fù)雜交。探針的雜交以及隨后由探針連接形成的單個多核苷酸的特征將表明存在的重復(fù)數(shù)目，因此可用于診斷與重復(fù)序列發(fā)生改變相關(guān)的病癥。
或者，探針可與不同靶序列互補。這些探針可跨越約一個突變的區(qū)域，或每個探針可與不同突變互補，使得可鑒定單個連接得到的多核苷酸的多種突變。若靶多核苷酸中突變位置是已知的或者受到質(zhì)疑，但是具體突變并非已知也并未受到質(zhì)疑，那么可加入跨越推定突變位點并含有不同序列的很多探針。例如，對于具體SNP，可使用四種不同探針，每種探針在推定突變位點含有不同堿基。只有與靶標(biāo)互補的探針才會雜交和連接。因此，對連接得到的多核苷酸進(jìn)行檢測就可鑒定出推定突變位點的序列。
優(yōu)選地，靶多核苷酸中被懷疑發(fā)生突變的一個或多個核苷酸與探針的一個或多個末端堿基互補。例如，探針可與含有SNP的區(qū)域雜交，并且探針中的末端堿基雜交至由于SNP而發(fā)生改變的靶標(biāo)的核苷酸位置。更優(yōu)選地，結(jié)合至SNP位點的探針中的末端堿基將與另一探針共價連接。這就保證了探針的最大特異性，原因在于只有即將被連接的每種探針的末端堿基與靶多核苷酸雜交，探針之間才會發(fā)生連接。若在靶多核苷酸中突變跨越一個以上的堿基，那么互補堿基可包含在單個探針中，或者分布于兩個或多個探針中。例如，若突變涉及到靶標(biāo)中兩個相鄰堿基，那么可對探針進(jìn)行設(shè)計，使得互補堿基兩個均在一種探針的末端，或者，使得第一個突變的堿基與上游探針中的最后一個堿基互補，而第二個突變的堿基與下游探針的第一個堿基互補。
每種探針與靶多核苷酸互補的區(qū)域在本文稱為“第一區(qū)域”?！盎パa”意味著它們在嚴(yán)格雜交條件下與靶標(biāo)雜交。嚴(yán)格雜交條件對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的，這種條件的一個實例是在溶液中于42℃過夜孵育，所述溶液含有50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl，15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5×Denhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml變性的被剪切的鮭精DNA；然后于約65℃在0.1×SSC中洗滌。顯而易見的是，探針的第一區(qū)域并不必完全與靶序列互補，前提是它們充分互補至足以雜交。但是，參與到連接反應(yīng)的每種探針的末端核苷酸必須與靶多核苷酸互補，目的在于使得該探針與另一探針或與也和此靶多核苷酸雜交的其它多核苷酸之間出現(xiàn)連接。最優(yōu)選的是每種探針的第一區(qū)域與該靶多核苷酸中的區(qū)域100％互補。
除了與靶多核苷酸雜交的探針的第一區(qū)域外，與該靶標(biāo)雜交的至少一種探針還含有編碼第一區(qū)域上的信息的第二區(qū)域，由此含有與探針雜交的序列的信息。該第二區(qū)域編碼了靶多核苷酸上的信息。表征含有探針的連接得到的多核苷酸時，該第二區(qū)域或一系列第二區(qū)域示出了所述靶多核苷酸的序列。因此，每種連接得到的多核苷酸必須含有至少一種探針第二區(qū)域。
第二區(qū)域具有確定的多核苷酸序列，第一區(qū)域的每個單獨核苷酸由第二區(qū)域中的至少兩個核苷酸表示。優(yōu)選第二區(qū)域包含不同的核酸序列“單元”。第一區(qū)域中的每個核苷酸由第二個區(qū)域中的不同的且預(yù)先確定的單元或者單元的唯一組合所表示。每個單元優(yōu)選包含兩個或多個核苷酸堿基，優(yōu)選包含2至50個堿基，更優(yōu)選2至20個堿基，最優(yōu)選4至10個堿基，例如6個堿基。優(yōu)選地，每個單元中至少含有兩個不同堿基。在一個優(yōu)選的實施方案中，每個單元中有3個不同堿基。第二區(qū)域中的單元可根據(jù)WO-A-00/39333中的公開內(nèi)容設(shè)計，該文獻(xiàn)的內(nèi)容通過援引納入本文。
對該單元的設(shè)計應(yīng)使其滿足能在“讀出”步驟中區(qū)分出不同的單元，所述“讀出”步驟包括在聚合反應(yīng)中或者在互補寡核苷酸雜交時摻入具有可檢測標(biāo)記的核苷酸。例如，第一區(qū)域中的每個堿基由一個單元中的一系列堿基所表示，在所述“單元”中，一個堿基在讀出步驟期間與所引入的標(biāo)記核苷酸互補，一個堿基作為“間隔物”在摻入的標(biāo)記之間起間隔作用，而一個堿基作為終止信號。
在一個優(yōu)選的實施方案中，具有獨特序列的兩個單元用來表示探針第一區(qū)域上全部四種可能的堿基。根據(jù)該實施方案，這兩個單元可用作二元系統(tǒng)，一個單元表示為“0”，而另一個單元表示為“1”。探針第一區(qū)域中的每個堿基可由第二區(qū)域中兩個單元的組合表征。例如，如

圖1所示，腺嘌呤可表示為“0”+“0”，胞嘧啶表示為“0”+“1”，鳥嘌呤表示為“1”+“0”，胸腺嘧啶表示為“1”+“1”。需對這些單元進(jìn)行區(qū)分，因此可將“終止”信號摻入每個單元。根據(jù)第一區(qū)域中的堿基在奇數(shù)位置還是在偶數(shù)位置，還優(yōu)選使用不同的單元表示“1”和“0”。
下面給出示例奇數(shù)模板序列“0”TTTTTTA(CCC)“1”TTTTTTG(CCC)
偶數(shù)模板序列“0”CCCCCCA(TTT)“1”CCCCCCG(TTT)在本實例中，帶有下劃線的堿基是聚合酶反應(yīng)中標(biāo)記核苷酸的靶標(biāo)，圓括號中的堿基用作終止信號，剩下的堿基用來在標(biāo)記之間提供間隔作用。
聚合酶反應(yīng)期間引入奇數(shù)位置(1、3、5等)的核苷酸混合物由FluorX-dUTP、Fluor Y-dCTP和dATP(混合物中不含dGTP)組成。對于“0”而言，沒有Fluor Y的互補堿基，對于“1”而言，沒有Fluor X的互補堿基。因此，在聚合酶反應(yīng)期間，若存在單元“0”，則通過監(jiān)測Fluor X就能對其進(jìn)行檢測，而若存在“1”，則通過監(jiān)測Fluor Y就能對其進(jìn)行檢測。
所有偶數(shù)位置(2、4、6等)的核苷酸混合物包括相同的兩種熒光標(biāo)記的核苷酸，但使用dGTP，而非dATP，并用一個或多個T堿基定義終止信號。
每個單元被“讀”之后，能通過引入缺失的互補核苷酸(如dGTP或dATP)來重新開始該過程，目的在于為在終止序列進(jìn)行摻入提供可能。下一個讀出步驟之前將未摻入的核苷酸洗去。
使用本領(lǐng)域已知的方法可將每種多核苷酸的第一區(qū)域轉(zhuǎn)化成為多核苷酸探針的第二區(qū)域。在本發(fā)明中，優(yōu)選在使用探針之前進(jìn)行該轉(zhuǎn)化，這樣探針在加入靶標(biāo)之時含有第二區(qū)域。可采用WO-A-00/39333(其內(nèi)容通過援引納入本文)所公開的使用限制酶的轉(zhuǎn)化方法。例如，可將第一區(qū)域連接至在插入點附近帶有IIS類限制性酶切位點的載體中，或者可通過對第一區(qū)域進(jìn)行改造使其含有這樣的位點。然后將合適的IIS類限制酶用來切割限制性位點，由此在第一區(qū)域得到懸突端。
然后可將含有一個或多個該單元的合適接頭用來連接到懸突端的一個或多個堿基。一旦接頭的懸突端和所切割的載體被雜交，那么這些分子就可被連接。這只能在全部懸突端達(dá)到完全互補時才能實現(xiàn)。然后，平端連接可實現(xiàn)將接頭的另一末端與載體連接。通過合適設(shè)置其它II類限制性酶切位點(或其它合適的限制性酶切位點)(可與先前使用的酶相同或不同)，可實現(xiàn)切割，由此在第一種接頭指向的序列下游的靶序列形成懸突端。通過這種方式，相鄰或重疊序列可被連續(xù)轉(zhuǎn)化成攜帶確定序列單元的序列。
使用該轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，每種多核苷酸探針的第二區(qū)域優(yōu)選使用二元系統(tǒng)形成，其中兩個連續(xù)單元用來定義第一區(qū)域中的具體堿基。
至少兩種探針與靶多核苷酸雜交后，將它們連接在一起。該探針可根據(jù)本發(fā)明的第一方面直接連接，也可根據(jù)本發(fā)明的第二方面通過間插多核苷酸間接連接(參見下文對每一方面的進(jìn)一步描述)。適合連接的條件對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的；優(yōu)選的條件是在適合連接酶活性的條件下加入連接酶。兩種探針連接時，優(yōu)選兩個第一區(qū)域被連接在一起。這樣，連接得到的多核苷酸就含有這兩個第一區(qū)域，兩側(cè)為這兩個第二區(qū)域。在該實施方案中，探針的第二區(qū)域分別在第一種探針和第二種探針的相反的末端，即第一種探針的3’端，在第二種探針的5’端。
含有共價連接的探針的單個多核苷酸可任選被擴(kuò)增。擴(kuò)增的優(yōu)選方法為聚合酶反應(yīng)。適合進(jìn)行聚合酶反應(yīng)的條件對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。通常的條件是在適合聚合酶活性的條件下，將聚合酶、寡核苷酸引物和游離核苷酸加至靶(模板)序列(即所連接的探針分子)。在一個優(yōu)選的實施方案中，聚合酶反應(yīng)是定量的。定量聚合酶反應(yīng)是本領(lǐng)域所熟知的，它使得可在每個循環(huán)之后監(jiān)測擴(kuò)增得到的產(chǎn)物的量?？傊?，可對熒光信號摻入到擴(kuò)增產(chǎn)物的情況進(jìn)行監(jiān)測，擴(kuò)增產(chǎn)物的量越多，熒光信號越強。定量實時PCR的試劑盒可商購，常用試劑盒的實例包括TaqMan(Applied Biosystem Inc.)和SYBR Green(Molecular ProbesInc.)。
對含有連接探針的單分子的檢測可通過在“讀出”步驟中檢測探針的第二區(qū)域進(jìn)行，其中由每種探針的第二區(qū)域所表示的信息，即探針雜交的靶多核苷酸的序列可被測定。若探針與突變靶序列雜交，則存在于靶多核苷酸中的突變可得到揭示。讀出步驟可通過使用任何合適的技術(shù)進(jìn)行。優(yōu)選的實施方案描述于WO 00/39333。
常規(guī)測序過程可被用作讀出步驟來鑒定探針的第二區(qū)域，并由此鑒定任何突變。另外，第二區(qū)域可具有使得不同探針得以區(qū)分的可檢測標(biāo)記。標(biāo)記可在讀出步驟檢測，以鑒定設(shè)計聚合物。優(yōu)選的標(biāo)記為熒光團(tuán)，它可通過使用常規(guī)技術(shù)被連接到每種探針的第二區(qū)域。
如上所述，讀出步驟可通過用選定的具有可檢測標(biāo)記的核苷酸，或者利用包含了用于后續(xù)間接標(biāo)記的基團(tuán)的核苷酸，采用聚合酶鏈反應(yīng)以摻入與每種探針的第二區(qū)域堿基互補的堿基，并對摻入情況進(jìn)行監(jiān)測來完成。
讀出聚合酶反應(yīng)優(yōu)選在以一次一個單元將互補核苷酸受控地?fù)饺氲臈l件下進(jìn)行。這可使得可通過檢測摻入標(biāo)記對每個單元進(jìn)行歸類。如上所述，由于每個單元優(yōu)選包含一個“終止”序列，因此可通過僅提供摻入至第一個單元上所需的那些核苷酸來控制摻入。由于每個單元可通過特定標(biāo)記被識別，因此可在每個循環(huán)內(nèi)區(qū)分兩個不同單元(0和1)。這使得能檢測任何摻入標(biāo)記，并為鑒定有待測試的單元以及對其定位提供了可能。
依照如下步驟進(jìn)行本方法(i)在使得聚合反應(yīng)可以進(jìn)行的條件下，將包含確定單元的探針的第二區(qū)域與至少一種核苷酸dATP、dTTP、dGTP和dCTP相接觸，其中至少一種核苷酸包含特異性針對該核苷酸的檢測標(biāo)記；(ii)除去所有未摻入的核苷酸并檢測任何摻入結(jié)果；(iii)將標(biāo)記從摻入核苷酸除去；和(iv)重復(fù)步驟ii)和iv)，由此鑒定不同單元，并由此鑒定靶多核苷酸的序列。
每個循環(huán)的步驟(i)中所需要的不同核苷酸的數(shù)目取決于單元的設(shè)計。若每個單元僅包含一種堿基類型，那么它們僅需要一種核苷酸(具有可檢測標(biāo)記)。但是，若使用兩種堿基(一種作為具有可檢測標(biāo)記核苷酸的靶標(biāo)，一種在不同靶堿基之間提供間隔)，則需要兩種核苷酸(一種結(jié)合靶堿基，一種將堿基“填充”在靶堿基之間)。
將堿基用作終止信號使得檢測步驟得以進(jìn)行，而無需封閉核苷酸來阻止聚合酶反應(yīng)期間的不受控?fù)饺?。由于聚合酶混合物中不存在“終止”堿基的互補堿基，因此終止信號是有效的。因此，可在對每個單元表征后進(jìn)行“填充”步驟，在該步驟中使用之前缺失的核苷酸，從而使得可與終止堿基互補，這就為下一個單元的表征提供了可能。這一步在檢測步驟之后進(jìn)行。一個單元的“終止”堿基與其隨后的單元的第一個堿基的類型應(yīng)不同。這就確保了“填充”過程不會進(jìn)行至下一個單元。然后，除去“填充”過程中所使用的未摻入核苷酸，隨后可對下一個單元進(jìn)行表征。
聚合酶和檢測標(biāo)記的選擇對于技術(shù)人員而言是顯而易見的。下面的內(nèi)容僅僅用作指導(dǎo)a)Klenow和Klenow(exo-)可有效摻入四甲基羅丹明-4-dUTP和羅丹明-110-dCTP(Amersham Pharmacia Biotech)(Brakmann andNieckchen，2001，Brakmann and Lbermann，2000)。
b)Vent，Taq和Tgo DNA聚合酶可有效摻入地高辛(dioxigenin)和熒光團(tuán)如AMCA、四甲基羅丹明、熒光素和Cy5，而沒有至少最高達(dá)幾個位置的間隔(Augustin et al.，J.Biotechnol.2001 Apr 13；86(3)289-301)。
c)T4 DNA聚合酶可有效填充標(biāo)記了熒光團(tuán)的核苷酸。
優(yōu)選的聚合酶為Klenow大片段(exo-)和T4 DNA聚合酶。
為進(jìn)行聚合酶反應(yīng)，通常應(yīng)必須首先將引物序列與連接得到的多核苷酸退火，引物序列由聚合酶識別，并作為互補鏈隨后的延長起始位點。引物序列可作為相對于連接的多核苷酸的單獨組分加入，該連接多核苷酸包含可使得引物退火的互補序列。
進(jìn)行聚合酶反應(yīng)所必須的其它條件包括溫度、pH、緩沖組合物等，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。聚合反應(yīng)可能進(jìn)行一段時間，這段時間足以使得堿基摻入至第一單元。然后除去未摻入核苷酸例如通過洗滌陣列來除去未摻入核苷酸，然后對摻入標(biāo)記進(jìn)行檢測。
另一種讀出方法是使用較短的具有檢測標(biāo)記的寡核苷酸來雜交多核苷酸上的單元，并檢測任何雜交結(jié)果。
短的寡核苷酸具有與探針第二區(qū)域的特定單元互補的序列。例如，若使用二元系統(tǒng)，并且每一種特征由單元(一個表示“0”，一個表示為“1”)的不同組合所定義，則本發(fā)明需要特異性針對“1”單元的寡核苷酸。在本實施方案中，寡核苷酸的選擇性雜交可通過將每個單元設(shè)計為相對于其它單元的不同多核苷酸序列來實現(xiàn)。這就確保了雜交事件僅在特定單元存在時發(fā)生，并且對雜交結(jié)果的檢測可鑒定出靶分子上的特征。
在一個優(yōu)選的實施方案中，標(biāo)記為熒光部分。可能使用熒光團(tuán)的很多實例是現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域所熟知的，包括Alexa染料(Molecular Probes)
BODIPY染料(Molecular Probes)花青染料(Amersham Biosciences Ltd.)四甲基羅丹明(Perkin Elmer，Molecular Probes，RocheDiagnostics)香豆素(Perkin Elmer)德克薩斯紅(Molecular Probes)熒光素(Perkin Elmer，Molecular Probes，Roche Diagnostics)可通過常規(guī)手段將合適的熒光團(tuán)連接至核苷酸。合適標(biāo)記的核苷酸也可商購。標(biāo)記以在檢測步驟后可除去的方式連接。這可通過任何常規(guī)方法進(jìn)行，包括I.攻擊信號本身a)漂白i)光漂白ii)化學(xué)漂白a)熒光淬滅i)通過針對熒光素而產(chǎn)生的抗體(如抗熒光素、抗Oregongreen)ii)通過FRET(將淬滅劑摻入信號附近可用來淬滅信號，如Taqman法)c)信號的切割i)化學(xué)切割(如堿基和信號之間的二硫鍵的還原)ii)光切割(如硝基芐基或叔丁基酮基的引入)iii)酶法切割(如肽接頭的α-胰凝乳蛋白酶消化)II.攜帶信號的核苷酸c)核酸外切去除i)填充核苷酸的3’-5’核酸外切降解(如核酸外切酶III或通過在某些核苷酸不存在時激活DNA聚合酶的3’-5’核酸外切活性)d)限制酶消化i)攜帶信號的雙鏈DNA的消化(如可在終止信號摻入的ApaI、Dral、SmaI位點)。
可除去的標(biāo)記的使用的另一方案是使用在生物化學(xué)過程中可被再次激活的滅活標(biāo)記。
優(yōu)選的方法是通過光切割或化學(xué)切割。
標(biāo)記為熒光團(tuán)時，摻入形成的熒光信號可通過光學(xué)手段如通過共聚焦顯微鏡來測量?；蛘?，可用靈敏的2-D檢測器如電荷耦合檢測器(CCD)可用來顯現(xiàn)所形成的各個信號。
以下為光學(xué)檢測的常規(guī)裝置顯微鏡落射熒光(Epi-fluorescene)物鏡油浸(100×，1.3NA)光源激光或燈濾光片帶通反射鏡分色鏡和二向色楔形鏡(dichroic wedge)檢測器光電倍增管(PMT)或CCD相機(jī)也可使用不同裝置，包括A.全內(nèi)反射熒光顯微鏡(TIRFM)光源一種或多種激光背景控制無需針孔檢測CCD相機(jī)(視頻和數(shù)碼成像系統(tǒng))B.激光掃描聚焦顯微鏡(CLSM)光源一種或多種激光背景降低一個或多個針孔孔徑檢測a)一個針孔用于不同熒光波長的光電倍增管(PMT)檢測器[最終的圖像由計算機(jī)隨時間逐點形成]。
b)幾千個針孔(旋轉(zhuǎn)的尼普科夫圓盤(Nipkow disk))圖像的CCD相機(jī)檢測[最終的圖像可由相機(jī)直接記錄]C.雙光子(TPLSM)和多光子激光掃描顯微鏡光源一種或多種激光背景控制無需針孔檢測CCD相機(jī)(視頻和數(shù)碼成像系統(tǒng))優(yōu)選的方法為TIRFM和共聚焦顯微鏡。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，靶多核苷酸與至少兩種探針相接觸，所述探針與靶多核苷酸的非重疊相鄰序列互補。本文所使用的術(shù)語“相鄰”指在單個多核苷酸中毗鄰的兩個序列，優(yōu)選沒有堿基分隔它們。由于連接反應(yīng)可出現(xiàn)在被1或2個堿基間隔的不同多核苷酸之間，因此這種情況也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，因此“相鄰”應(yīng)該被認(rèn)為包括1個或2個堿基間隔。探針被加入并被置于雜交條件下后，可進(jìn)行連接步驟。適合連接多核苷酸的條件對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。若至少兩種探針與靶多核苷酸上的相鄰序列雜交，則通過在相鄰末端核苷酸之間形成磷酸二酯鍵，連接步驟可連接這些探針以形成單個多核苷酸。然后，包含靶多核苷酸上的信息的此連接產(chǎn)物可被檢測和表征。
作為這方面的非限定示例性實例，可使用兩種探針。兩種探針與靶標(biāo)雜交時，它們隨后連接在一起形成單個分子。只有兩種探針均被雜交時才會出現(xiàn)該連接步驟。因此，可理解的是，若一種或兩種寡核苷酸探針與靶分子不互補，就不會發(fā)生雜交和連接，也不會形成包含兩種探針的單個分子。
根據(jù)這方面的最簡單的實施方案，本方法可用來檢測樣本中是否存在靶序列。在一個優(yōu)選的實施方案中，樣本含有多種DNA序列，例如基因組DNA。使用與靶分子中兩個相鄰序列互補的至少兩種探針。若若靶標(biāo)存在于樣本中，那么探針將雜交、被連接，并且可形成單個探針分子，之后它可被檢測。若靶分子不存在于樣本中，就不會形成單個連接的探針分子，因此不能被檢出。
還可檢測靶多核苷酸中是否存在突變。可將探針設(shè)計為與靶標(biāo)中的突變序列或野生型序列互補。若探針被設(shè)計為與突變序列互補，則連接步驟后單個的連接得到探針分子的存在表明突變序列存在于原始樣本中，若它不存在則表明靶突變序列并不存在于原始樣本中。得到單個連接探針后，就可通過讀出步驟對序列進(jìn)行表征。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言很顯然的是，相反情況即探針與野生型序列互補時也同樣得到良好的檢測。在這種情況下，連接步驟后單個的連接得到的探針分子的存在表明野生型序列存在于原始樣本中，而它的不存在則表明靶野生型序列不存在于原始樣本中。
野生型和突變互補探針的組合可用來鑒定野生型和突變序列是否均存在于原始樣本中。例如，一個等位基因含有野生型，而另一個等位基因含有突變序列，兩個等位基因均存在于基因組DNA樣本中。
本發(fā)明的第二方面涉及鑒定靶多核苷酸內(nèi)至少兩個靶序列的順序。這可用來例如研究整個重排情況或者用來測定靶序列上標(biāo)志物的順序。還可測定靶序列之間的距離。在一個優(yōu)選的實施方案中，在嚴(yán)格雜交條件下，將靶多核苷酸與至少兩種多核苷酸探針相接觸，這兩種多核苷酸探針均含有編碼與探針雜交的序列的信息的第二區(qū)域。該探針不必與靶多核苷酸上的相鄰序列雜交。在一個優(yōu)選的實施方案中，探針與靶多核苷酸的非相鄰區(qū)域互補。探針與靶多核苷酸雜交后，就可進(jìn)行聚合酶反應(yīng)以在兩種探針之間摻入核苷酸，其中所雜交探針之一將作為聚合反應(yīng)的引物。優(yōu)選地，如上文所述，聚合酶反應(yīng)是定量的。
為了使聚合酶反應(yīng)僅填充探針之間的核苷酸，并且不替換探針本身，必須使用非置換聚合酶(non-displacing polymerase)。非鏈置換聚合酶為本領(lǐng)域所熟知，實例包括但不限于Taq聚合酶、E.coli DNA聚合酶I和T4 DNA聚合酶。
然后進(jìn)行連接反應(yīng)來將探針共價連接至通過聚合酶所形成的多核苷酸上，以形成含有探針的單個多核苷酸。然后，靶序列的順序以及它們之間的距離可通過對含有探針的單個多核苷酸進(jìn)行表征，以及通過檢測每種探針第二區(qū)域的順序及其距離來檢測。
本發(fā)明的方法如下所述基因組DNA樣本中靶DNA聚合物被懷疑在特定位點含有SNP。第一種多核苷酸探針含有與緊鄰SNP位點的上游10個堿基(不包括SNP位點)互補的第一區(qū)域，而第二區(qū)域含有一系列10個3-堿基單元，每個單元表示第一區(qū)域中的單個堿基。每個單元含有作為終止信號的一個堿基、單堿基間隔物和適合在讀出步驟鑒定的一個堿基。第二區(qū)域在第一區(qū)域的上游。
使用四種不同的第二種多核苷酸探針；每一種含有10個堿基的第一區(qū)域，這些堿基僅在與SNP位點互補的那些堿基上有所不同，即每一種這四種不同的第二種探針的第一個堿基為A、T、G或C。每種探針中剩下的9個堿基是相同的，并與緊鄰?fù)蛔兾稽c的下游9個堿基互補。這些第二種多核苷酸探針也含有包含一系列10個3-堿基單元的第二區(qū)域，每個單元代表第一區(qū)域中的單個堿基。在每種第二種多核苷酸中，第二區(qū)域在第一區(qū)域的下游。
將基因組DNA樣本解鏈來提供單鏈靶序列，并且在雜交條件下，將第一種多核苷酸探針以及每一種這四種第二種多核苷酸探針加入樣本中。第一種探針的第一區(qū)域會與緊鄰SNP位點上游的10個堿基雜交。這四種第二種多核苷酸之一的第一區(qū)域可以以100％互補性與SNP位點和下游的9個堿基雜交。剩下的3種第二種多核苷酸與SNP位點并不互補，它們僅與SNP位點下游的9個堿基雜交。然后，在適合連接酶活性的條件下加入連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。只有在第二種探針與靶序列100％互補時(即它與SNP互補)該連接步驟才將第一種多核苷酸探針與第二種多核苷酸探針連接起來。在SNP位點不互補的剩下的3種第二種探針不會與第一種探針連接。連接形成了單鏈、連接的探針分子，所述單鏈、連接的探針分子含有第一種多核苷酸探針和與SNP位點互補的第二種多核苷酸探針。連接得到的探針含有兩個第一區(qū)域，兩側(cè)為兩個第二區(qū)域。
單個連接得到的探針分子在聚合酶反應(yīng)中擴(kuò)增。擴(kuò)增得到的多核苷酸含有跨越包括SNP位點的序列在內(nèi)的SNP的20-堿基區(qū)域上的序列信息，這些信息編碼在第一種和第二種多核苷酸探針的第二區(qū)域中。該序列可通過任何合適的讀出步驟測定。
權(quán)利要求
1.一種鑒定樣本中是否存在單鏈靶多核苷酸的方法，包括如下步驟(i)雜交條件下將所述靶多核苷酸與至少第一種和第二種多核苷酸探針相接觸，其中每一種多核苷酸探針包含與所述靶多核苷酸的相鄰非重疊區(qū)互補的第一區(qū)域；(ii)將雜交至所述靶多核苷酸的那些第一種和第二種多核苷酸連接在一起；(iii)任選擴(kuò)增任何所連接的多核苷酸；并(iv)通過檢測任何所連接的多核苷酸，測定所述靶多核苷酸是否存在于原始樣本中，其中所述第一種和第二種多核苷酸中的至少一種包含具有確定多核苷酸序列的第二區(qū)域，并且所述第一區(qū)域的每個單獨核苷酸由所述第二區(qū)域的至少兩個核苷酸表示，并通過測定所述第一種和第二種多核苷酸探針中的至少一種的第二區(qū)域來鑒定所連接的多核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第一種和第二種多核苷酸探針為DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第一種和第二種多核苷酸探針為RNA。
4.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的方法，其中第一區(qū)域的每一種堿基A、T(U)、G和C由第二區(qū)域中的兩個連續(xù)單元的組合表示，并且每種堿基由兩個單元的不同組合表示。
5.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述第一種和第二種多核苷酸探針被標(biāo)記了熒光部分。
6.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的方法，其中步驟(ii)包括在適合連接酶活性的條件下加入連接酶。
7.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的方法，其中步驟(ii)的所述連接得到的多核苷酸在聚合酶反應(yīng)中擴(kuò)增。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述聚合酶反應(yīng)是定量的，并且擴(kuò)增得到的多核苷酸的量被監(jiān)測。
9.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述靶多核苷酸為RNA。
10.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述靶多核苷酸為mRNA。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項的方法，其中所述靶多核苷酸為DNA。
12.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的方法，用于檢測與野生型序列相比較有一個或多個核苷酸不相同的靶多核苷酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，用于檢測缺失、插入或置換。
14.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的方法，用于檢測單核苷酸多態(tài)性。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-11任一項的方法，用于鑒定野生型靶序列。
16.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的方法，其中步驟(i)包括將多個相同或不同的第一種和第二種多核苷酸探針與所述靶多核苷酸結(jié)合。
17.一種鑒定靶多核苷酸上的至少兩個靶序列的順序的方法，包括(i)雜交條件下將所述靶多核苷酸與至少第一種和第二種多核苷酸探針相接觸，其中每一種多核苷酸探針包含與所述靶多核苷酸的非相鄰區(qū)域互補的第一區(qū)域；(ii)進(jìn)行聚合酶反應(yīng)，以在至少兩種探針之間摻入核苷酸，由此形成第三種多核苷酸，并；(iii)通過檢測任何第三種多核苷酸，測定所述靶多核苷酸上兩個所述靶序列的順序以及兩者之間的距離，其中所述第一種和第二種多核苷酸包含具有確定多核苷酸序列的第二區(qū)域，并且所述第一區(qū)域的每個單獨核苷酸由所述第二區(qū)域的至少兩個核苷酸表示，并且所述第三種多核苷酸中探針的順序以及之間的距離可通過測定所述第一種和第二種多核苷酸探針的第二區(qū)域來鑒定。
全文摘要
一種鑒定樣本中是否存在單鏈靶多核苷酸的方法，包括如下步驟(i)雜交條件下使靶多核苷酸與至少第一種和第二種多核苷酸探針相接觸，其中每種多核苷酸探針包含與所述靶多核苷酸的相鄰非重疊區(qū)互補的第一區(qū)域；(ii)將雜交至所述靶多核苷酸的那些第一種和第二種多核苷酸連接在一起；(iii)任選擴(kuò)增任何連接的多核苷酸；和(iv)通過檢測任何連接的多核苷酸，測定所述靶多核苷酸是否存在于原始樣本中，其中所述第一種和第二種多核苷酸中的至少一種包含具有確定多核苷酸序列的第二區(qū)域，并且所述第一區(qū)域的每個單獨核苷酸由所述第二區(qū)域的至少兩個核苷酸表示，并通過測定所述第一種和第二種多核苷酸探針中的至少一種的第二區(qū)域來鑒定所連接多核苷酸。
文檔編號C12Q1/68GK101076606SQ200580042591
公開日2007年11月21日 申請日期2005年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月13日
發(fā)明者P·萊克索 申請人:靈維泰公司