專利名稱:多核苷酸結(jié)核病疫苗的制作方法
背景技術(shù):
抗病毒和細(xì)菌疫苗開發(fā)的主要障礙是不同分離體和株中外部蛋白的多樣性,尤其抗多種血清型或高突變率的種類,需要誘發(fā)中和作用抗體和/或保護(hù)性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。由于小鼠和人細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞(CTLs),能識別來自內(nèi)部保守的病毒蛋白的表位[J.W.Yewdell等,美國國家科學(xué)院院報(bào)82,1785(1985);A.R.M.Townsend等,細(xì)胞44,959(1986);A.J.McMichael等,J.Gen.Virol.67,719(1986);J.Bastin等,實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志165,1508(1987);A.R.M.Townsend和H.Bodmer,免疫學(xué)年評7,601(1989)1,被認(rèn)為在抗病毒的免疫應(yīng)答中是重要的[Y.-L.Lin和B.A.Askonas,實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志154,225(1981);I.Gardner等,歐洲免疫學(xué)雜志4,68(1974);K.L.Yap和G.L.Ada,自然273,238(1978);A.J.McMichael等,新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志309,13(1983);P.M.Taylor和B.A.Askonas,免疫學(xué)58,417(1986)],許多努力方向是能提供抗不同病毒株的異源性保護(hù)的CTL疫苗的開發(fā)。
眾所周知,當(dāng)T細(xì)胞受體識別和MHC I類和/或II類分子相連的外來肽時,CTLs殺死病毒或細(xì)菌感染的細(xì)胞。這些肽可能衍生自內(nèi)源合成的外來蛋白,而不論蛋白在病原體中的定位和功能。通過識別保守性蛋白的表位,CTLs可能提供異源性保護(hù)。在細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌存在的情況下,從細(xì)菌分泌或釋放的蛋白被MHC I類和II類分子加工和呈遞,因而產(chǎn)生了在降低或消除感染中起作用的T細(xì)胞應(yīng)答。
大多數(shù)產(chǎn)生CTL應(yīng)答的努力在于使用復(fù)制載體,以在細(xì)胞中產(chǎn)生蛋白抗原[J.R.Bennink等,同上,311,578(1984);J.R.Bennink和J.W.Yewdell,當(dāng)今微生物免疫學(xué)論題163,153(1990);C.K.Stover等,自然351,456(1991);A.Aldovini和R.A.Young,自然351,479(1991);R.Schafer等.,J.Immunol.149,53(1992);C.S.Hahn等美國國家科學(xué)院院報(bào)89,2679(1992)],或者它們集中于把肽導(dǎo)入細(xì)胞溶質(zhì)中[F.R.Carbone和M.J.Bevan,實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志169,603(1989);K.Deres等自然342,561(1989);H.Takahashi等,同上344,873(1990);D.S.Collins等,免疫學(xué)雜志148,3336(1992);M.J.Newman等,同上148,2357(1992)]。這二種途徑的局限性可能降低了它們作為疫苗的可應(yīng)用性。反轉(zhuǎn)錄病毒在維持重組病毒復(fù)制能力的情況下對作為融合蛋白表達(dá)的多肽的大小和結(jié)構(gòu)具有限制[A.D.Miller,當(dāng)今微生物免疫學(xué)論題158,1(1992)],載體如牛痘作下一步的免疫作用的有效性能被抗牛痘的免疫應(yīng)答所緩和[E.L.Cooney等,柳葉刀337,567(1991)]。另外,病毒載體和修飾的病原體有內(nèi)在的風(fēng)險(xiǎn),能妨礙其在人類中應(yīng)用[R.R.Redfield等,新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志316,673(1987);L.Mascola等,Arch Intern.Med.149,1569(1989)]。因此,被呈遞的肽段表位的選擇依賴于個體MHC抗原的結(jié)構(gòu),所以肽疫苗由于遠(yuǎn)親群體中MHC單倍型的多樣性具有限的效用性。
Benvenisty,N.和Reshef.L[美國國家科學(xué)院院報(bào)83,9551-9555,(1986)]表明腹膜內(nèi)(i.p.),靜脈內(nèi)(i.v.)或肌肉內(nèi)(i.m.)導(dǎo)入小鼠的氯化鈣沉淀的DNA能表達(dá)。DNA表達(dá)載體在鼠中肌肉內(nèi)(i.m.)注射的結(jié)果說明DNA被肌肉細(xì)胞吸收,表達(dá)由DNA編碼的蛋白[J.A.Wolff等,科學(xué),247,1465(1990);G.Ascadi等,自然352,815(1991)]。表明質(zhì)粒以附加體的方式被維持,沒有復(fù)制。后來在大鼠、魚和靈長目骨骼肌和大鼠心肌的i.m.注射后觀察到持續(xù)的表達(dá)[H.Lin等;循環(huán)82,2217(1990);R.N.Kitsis等,美國國家科學(xué)院院報(bào)88,4138(1991);E.Hansen等,F(xiàn)EBS Lett.290,73(1991);S.Jiao等,人類基因治療3,21(1992));J.A.Wolff等,人類分子遺傳1,363(1992)]。用核苷酸作治療劑的技術(shù)在WO90/11092(1990年10月4日)報(bào)道,其中用裸多核苷酸接種脊椎動物。
最近,在活化CTLs消除腫瘤中抗原呈遞細(xì)胞表面表位的B7和主要組織相容性復(fù)合物(MHC)呈遞的協(xié)同作用做了綜述[Edgington生物技術(shù)1 1,1117-1119,1993]。一旦抗原呈遞細(xì)胞(APC)表面的MHC分子呈遞表位給T細(xì)胞受體(TCR),在相同APC表面表達(dá)的B7起第二信號的作用與CTLA-4或CD28結(jié)合。其結(jié)果是CD4+輔助細(xì)胞的快速分裂,其傳遞信號給CD8+T細(xì)胞,使其增殖和殺死APC。
對方法的成功來說,肌肉內(nèi)免疫并非必要。因此,Tang等[自然,356,152-154(1992)]發(fā)現(xiàn)包被編碼牛生長激素(BGH)的DNA的金微粒導(dǎo)入小鼠皮膚,結(jié)果小鼠產(chǎn)生了抗BGH的抗體。弗斯等[分析生物化學(xué),205,365-368,(1992)]表明噴射(jet)注射器可用于轉(zhuǎn)染活動物的皮膚、肌肉、脂肪和乳腺組織。最近綜述了導(dǎo)入核苷酸的不同方法[Friedman,T.科學(xué)244,1275-1281(1989)]。也可見Robinson等[提交到關(guān)于新疫苗現(xiàn)代方法,包括AIDS預(yù)防的1992會議的論文摘要,冷泉港,p92;疫苗11,957(1993)],其中主張鳥類流感DNA im,ip和iv對雞給藥,以提供保護(hù)抗致死攻擊。小鼠中DNA陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物的靜脈注射由Zhu等證明[科學(xué)261,209-211(1993年7月9日);亦見于WO93/24640,1993年12月9日],結(jié)果是克隆的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)地表達(dá)。最近,Ulmer等[科學(xué)259,1745-1749,(1993)]報(bào)道注射編碼流感病毒蛋白的DNA可異源性地保護(hù)抗流感病毒感染。
Wang報(bào)道[美國國家科學(xué)院院報(bào)90,4156-4160(5月,1993)]用克隆的基因組(未剪切)的HIV基因肌肉內(nèi)接種,能誘發(fā)小鼠抗HIV的免疫應(yīng)答。不過,所獲的免疫應(yīng)答水平非常低,該系統(tǒng)使用小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)長末端重復(fù)(LTR)啟動子部分和猴病毒40(SV40)啟動子和終止子部分。已知SV40能轉(zhuǎn)化細(xì)胞,可通過整合進(jìn)宿主細(xì)胞DNA而起作用。因而,Wang等所描述的系統(tǒng),施用于人是完全不合適的,這是本發(fā)明的目的之一。
WO93/17706描述了一種接種動物抗病毒的方法,其中載體顆粒用基因構(gòu)建體包被,包被的顆粒加速進(jìn)入動物細(xì)胞。
由Wolff等(同上)的研究最先證明編碼報(bào)告基因的質(zhì)粒DNA肌肉注射,結(jié)果是在注射位點(diǎn)和其附近的肌細(xì)胞內(nèi)該基因的表達(dá)。最近報(bào)道表明編碼流感A血凝素(Montgomery D.L等,1993,細(xì)胞生物學(xué),12,pp777-783),或核蛋白(Montgomery D.L等,同上;Ulmer,J.B.等,1993,科學(xué),259,pp.1745-1749)的質(zhì)粒注射,成功地免疫小鼠抗流感。對皰疹病毒DNA免疫作用的首次應(yīng)用已有報(bào)道(Cox等,1993,病毒學(xué)雜志,67,pp.5664-5667)。編碼牛皰疹病毒(BHV-1)糖蛋白g IV的質(zhì)粒注射在小鼠和小牛中產(chǎn)生了抗g IV的抗體。用BHV-1鼻內(nèi)攻擊表明免疫小牛減輕癥狀,排出基本上比對照少的病毒。
結(jié)核病(TB)是由病原體結(jié)核分支桿菌引起的肺慢性感染病。TB是世界范圍臨床上最顯著的感染病之一,伴隨而來的是每年300萬人死亡和1千萬新病例。估計(jì)多達(dá)世界人口的三分之一會被感染,在發(fā)展中國家,已報(bào)道5千5百萬發(fā)病的TB病例。直到本世紀(jì)初,TB是美國主要死因??墒?,隨著衛(wèi)生條件的改善和抗微生物藥物的出現(xiàn),死亡率穩(wěn)定下降至預(yù)計(jì)到2000年該病將被根除的程度。不過,在大多數(shù)發(fā)達(dá)國家,自1980年代中期以來發(fā)病的TB病例數(shù)每年上升。該復(fù)發(fā)部分歸因于遷移和免疫后損害的,HIV感染個體數(shù)目增加。假如趨勢沒有減弱,預(yù)計(jì)TB將在下一個十年要了三千萬以上人的性命。象這些數(shù)學(xué)顯得使人驚恐一樣,甚至更為關(guān)注的是結(jié)核分支桿菌的多藥抗性(MDR)株的出現(xiàn)。這些MDR株不被傳統(tǒng)藥物療法所馴服,特別在城市中心引起最近幾次TB的爆發(fā)。所以,長期TB控制的關(guān)鍵組分之一將是有效的疫苗[綜述見Bloom和Murray,1993,科學(xué)257,1055]。
結(jié)核分支桿菌是感染巨噬細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)病原菌,能在該類型細(xì)胞吞噬溶酶體的惡劣環(huán)境中存活。大多數(shù)吸入的桿菌被活化的小泡巨噬細(xì)胞破壞。可是,存活的桿菌能在巨噬細(xì)胞中增殖,靠細(xì)胞死亡而釋放,發(fā)出了淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞向該點(diǎn)浸潤的信號。負(fù)載有桿菌的巨噬細(xì)胞的裂解由遲發(fā)型超敏反應(yīng)所介導(dǎo),導(dǎo)致環(huán)繞感染細(xì)胞區(qū)域的緊密干酪樣結(jié)核結(jié)節(jié)的出現(xiàn)。繼續(xù)的DTH引起結(jié)節(jié)液化,因而釋放所捕獲的桿菌。大劑量的胞外桿菌進(jìn)一步激發(fā)DTH,引起對支氣管的損害和由淋巴的、血原性的以及支氣管通路散播,最終使感染性的桿菌由呼吸擴(kuò)散。
對TB的免疫性涉及效應(yīng)細(xì)胞的幾種類型。由細(xì)胞因子比如γ-干擾素對巨噬細(xì)胞的活化是把細(xì)胞內(nèi)分支桿菌增殖降到最低的一種有效方法。不過,靠這種方法常未取得完全根除分支桿菌??筎B的保護(hù)的獲得需要T淋巴細(xì)胞。在這些之中,CD8+和CD4+T細(xì)胞似乎是重要的[Orme等,1993,傳染病雜志,167,1481]。這些細(xì)胞類型在對分支桿菌應(yīng)答中分泌γ-干擾素,顯示有Th1免疫應(yīng)答,和具有對分支桿菌脈沖的靶細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。最近用β-2微球蛋白和CD8缺陷的小鼠研究中,表明CTL應(yīng)答在提供抗結(jié)核分支桿菌的保護(hù)中是關(guān)鍵的[Flynn等,1992,美國國家科學(xué)院院報(bào)89,12013;Flynn等,1993,實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志178,2249;Cooper等,1993,實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志178,2243]。相反,B淋巴細(xì)胞似乎沒有涉及,抗分支桿菌的抗體的被動輸入不提供保護(hù)。所以,抗TB的有效疫苗必須產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
T細(xì)胞抗原刺激需要MHC分子的呈遞作用。為了使分支桿菌抗原可進(jìn)入抗原呈遞通路,它們必須從細(xì)菌中釋放。在感染的巨噬細(xì)胞中,這可能與分泌或細(xì)菌裂解完成。分支桿菌具有許多潛在的T細(xì)胞抗原,有幾種現(xiàn)已確認(rèn)[Andersen 1994,Dan Med.Bull 41,205]。這些抗原的一些由細(xì)菌分泌。一般認(rèn)為抗TB的免疫性由直接針對這些所分泌抗原的CD8+和CD4+T細(xì)胞所介導(dǎo)。在TB的小鼠和豚鼠模型中,由降低體重減輕所測定的對細(xì)菌攻擊的保護(hù)作用,已應(yīng)用分泌的分支桿菌抗原的混合物獲得。[Pal和Horowitz,1992,感染免疫60,4781;Andersen 1994,感染免疫62,2536;Collins,1994,Veterin.微生物學(xué)40,95]。
幾種潛在的保護(hù)性T細(xì)胞抗原已在結(jié)核分支桿菌中確認(rèn),一些作疫苗的靶物正在研究。最近工作顯示主要的T細(xì)胞抗原是它們停留在巨噬細(xì)胞中的過程中,由分支桿菌分泌的那些蛋白,例如i)蛋白抗原85復(fù)合體(85A,85B,85C)[wiker和Harboe,1992,微生物學(xué)綜述,58,648],ii)一種稱作ESAT-6的6 kDa蛋白[Ardersen 1994,感染免疫62,2536],iii)一種與Phos有同源性的38 kDa脂蛋白[Young和Garbe,1991微生物學(xué)研究,142,55;Ardersen 1992,感染病雜志166,874],iv)65kDa的GroEl熱休克蛋白[Siva和Lowrie,1994,免疫學(xué)82,244],v)一種富含脯氨酸和蘇氨酸的55 kDa蛋白[Romain等,1993,美國國家科學(xué)院院報(bào)90,5322];和Vi)一種19 kDa脂蛋白[Faith等,1991,免疫學(xué)74,1]。
三種抗原85蛋白(A、B和C)的每一種的基因已被克隆和測序[Borremans等,1989感染免疫57,3123;Content等,感染免疫59,3205;DeWit等1994,DNA序列4,267]。此外,這些結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白是感染和接種后強(qiáng)烈的T細(xì)胞應(yīng)答的目標(biāo)[Huygen等,Scand.J.Immunol.27,187;Launois等1991,臨床實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)86,286;Huygen等,1992,感染免疫60,2880;Munk等,1994,感染免疫62,726;Launois等1994,感染免疫62,3679]。因此,抗原85蛋白被認(rèn)為是良好的疫苗靶物。
發(fā)明概述為檢驗(yàn)DNA免疫在預(yù)防M.tb疾病中的有效性,將編碼M.tb蛋白的DNA序列克隆進(jìn)真核表達(dá)載體中。這些DNA構(gòu)建體當(dāng)注射到動物中時,激發(fā)了免疫應(yīng)答。免疫的動物用分支桿菌感染,以評價是否用基因(或其他M.tb基因)的直接DNA免疫能保護(hù)它們免除疾病。因而公開的是包括DNA構(gòu)建體和RNA轉(zhuǎn)錄體的核苷酸,通過注射或其他途徑直接導(dǎo)入動物組織,能誘導(dǎo)M.tb蛋白的體內(nèi)表達(dá)。這些核苷酸注射能激發(fā)免疫應(yīng)答,應(yīng)答導(dǎo)致對M.tb抗原特異的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTLs)的產(chǎn)生和對后續(xù)的攻擊有保護(hù)作用的特異于M.tb的輔助T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的產(chǎn)生。將這些核苷酸用作誘導(dǎo)對M.tb免疫性的疫苗是有用的,它能預(yù)防感染和/或改善M.tb相關(guān)的疾病。
附圖簡述Fig1.顯示克隆M.tb基因進(jìn)入表達(dá)載體的一般原理。
Fig2.顯示V1Jns.tPA85A.C1的載體圖譜。
Fig3.顯示V1Jns.85A.C2的載體圖譜。
Fig4.顯示V1Jns.85A.C3的載體圖譜。
Fig5.顯示V1Jns.tPA85B.C1的載體圖譜。
Fig6.顯示V1Jns.tPA85C.C1的載體圖譜Fig7.顯示構(gòu)建體N末端序列的核實(shí)。
Fig8.顯示在組織培養(yǎng)中M.tb蛋白的表達(dá)。
Fig9.顯示在接種DNA的小鼠中對抗原85A特異的抗體的產(chǎn)生。
Fig10.顯示在BALB/c小鼠中由Tb DNA疫苗而產(chǎn)生IL-2。
Fig11.顯示在C57BL/6小鼠中由Tb DNA疫苗而產(chǎn)生IL-2。
Fig12.顯示在BALB/c小鼠中由Tb DNA疫苗而產(chǎn)生IFN-γ。
Fig13.顯示在C57BL/6小鼠中由Tb DNA疫苗而產(chǎn)生IFN-γ。
Fig14.顯示在BALB/c小鼠中,Tb DNA疫苗不產(chǎn)生IL-4。
Fig15.顯示在小鼠中,Tb DNA疫苗不產(chǎn)生IL-6。
Fig16.顯示在小鼠中,Tb DNA疫苗不產(chǎn)生IL-10。
Fig17.顯示用Tb DNA疫苗接種的C57BL/6小鼠的肺中BCG的增殖降低。
Fig18.顯示用Tb DNA疫苗接種的BALB/c小鼠的肺中BCG的增殖降低。
Fig19.顯示用Tb DNA疫苗接種的BALB/c小鼠的脾中BCG的增殖降低。
Fig20.顯示用Tb DNA疫苗接種的C57BL/6小鼠的脾中BCG的增殖降低。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供的多核苷酸,當(dāng)直接導(dǎo)入包括諸如人類的哺乳動物的脊椎動物體內(nèi)時,誘導(dǎo)編碼蛋白在動物中表達(dá)。在此所用的多核苷酸是一種核酸,它含有依賴其導(dǎo)入活脊椎動物細(xì)胞中的基本調(diào)控元件,和能指導(dǎo)細(xì)胞機(jī)構(gòu)產(chǎn)生包含多核苷酸基因編碼的翻譯產(chǎn)物。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中,多核苷酸是一種多脫氧核糖核酸,其包括有操縱性地連結(jié)于轉(zhuǎn)錄啟動子的結(jié)核分支桿菌(M.tb)基因。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中,多核苷酸疫苗包括編碼服從于由真核細(xì)胞機(jī)構(gòu)(核糖體、tRNAs、和其他翻譯因子)翻譯的M.tb基因的多核糖核酸。那里由多核苷酸編碼的蛋白是除在病理?xiàng)l件下在動物中不正常產(chǎn)生的一種,(即一種異源性蛋白)如與M.tb有關(guān)的蛋白,動物的免疫系統(tǒng)被活化發(fā)動保護(hù)性免疫應(yīng)答。因?yàn)檫@些外源蛋白由動物自身組織產(chǎn)生,表達(dá)的蛋白由主要組織相容性系統(tǒng)(MHC)以類似于當(dāng)真正的M.tb感染發(fā)生時的方式所處理。如在本公開內(nèi)容所示的結(jié)果是誘導(dǎo)抗M.tb的免疫應(yīng)答。為對一種編碼蛋白產(chǎn)生免疫應(yīng)答的目的的多核苷酸在此稱作多核苷酸疫苗或PNV。
本發(fā)明有許多實(shí)施方案使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能從特例中正確評價。這樣,可成功地使用不同的轉(zhuǎn)錄啟動子、終止子、穿梭載體(carriervector)或特異的基因序列。
本發(fā)明提供一種應(yīng)用多核苷酸的方法,導(dǎo)入哺乳動物組織中時,多核苷酸誘導(dǎo)因而產(chǎn)生編碼蛋白的體內(nèi)多核苷酸表達(dá)。對本領(lǐng)域技術(shù)人員極明顯的是能產(chǎn)生編碼蛋白的核苷序列的變異或衍生序列,而改變編碼蛋白的氨基酸序列。改變的表達(dá)蛋白可能具有改變的氨基酸序列,而仍能引起和分支桿菌蛋白起反應(yīng)的免疫應(yīng)答,改變的表達(dá)蛋白被認(rèn)為是功能性等價體。另外,編碼全長蛋白部分的全長基因的片段也可構(gòu)建。這些片段能編碼一種蛋白或肽,其可誘導(dǎo)出和分支桿菌蛋白起反應(yīng)的抗體,這些片段被認(rèn)為是功能性等價體。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中,編碼M.tb基因產(chǎn)物的一個基因被摻入到表達(dá)載體中。載體含由真核RNA聚合酶識別的轉(zhuǎn)錄啟動子和在M.tb基因編碼序列末端的轉(zhuǎn)錄終止子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中,啟動子是具有內(nèi)含子A序列的巨細(xì)胞病毒啟動子(CMV-intA),盡管本領(lǐng)域的技術(shù)人員會認(rèn)為可用許多其他的已知啟動子如強(qiáng)免疫球蛋白或其他真核基因啟動子的任一個。優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄終止子是牛生長激素終止子。CMVintA-BGH終止子的結(jié)合是優(yōu)選的。此外,為有助于在原核細(xì)胞中多核苷酸的制備,抗生素抗性標(biāo)志也選擇性地包括在合適的原核啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下的表達(dá)載體中。可用氨芐青霉素抗性基因,新霉素抗性基因或任何其它合適的抗生素抗性標(biāo)志。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中,抗生素抗性基因編碼對新霉素/卡那霉素抗性的基因產(chǎn)物。更進(jìn)一步,為助于生長在原核生物中多核苷酸的高水平產(chǎn)生,載體含原核的復(fù)制起點(diǎn)和具有高拷貝數(shù)是有利的。許多商品化的原核克隆載體的任一個均能提供這些元件。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中,這些功能體由商品化稱為pUC系列的載體提供。不過移去非必需DNA序列可能是需要的。這樣,可移去pUC的lacZ和lacI編碼序列。也需要載體不能在真核細(xì)胞中復(fù)制。這使多核苷酸疫苗序列整合到接受體基因組的風(fēng)險(xiǎn)降低到最低限度。
在另一實(shí)施方案中,使用表達(dá)載體pnRSV,其中勞斯肉瘤病毒(RSV)的長末端重復(fù)序列(LTR)被用作啟動子。仍在另一實(shí)施方案中,應(yīng)用V1,一種克隆有CMV啟動子和BGH轉(zhuǎn)錄終止子的突變pBR322載體。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中,結(jié)合V1和pUC19元件而產(chǎn)生的表達(dá)載體稱作V1J。
克隆進(jìn)V1J,V1JtPA或另一需要的表達(dá)載體中的是M.tb基因,例如抗原85復(fù)合體基因之一,或任何其他能誘導(dǎo)抗M.tb免疫應(yīng)答(CTLs,輔助T淋巴細(xì)胞和抗體)的M.tb基因。在另一實(shí)施方案中,氨芐霉素抗性基因從V1J中移去,代之以新霉素抗性基因以產(chǎn)生V1J-neo,按照本發(fā)明,使用時可把許多不同的M.tb基因克隆到V1J-neo中。仍在另一實(shí)施方案中,載體是V1Jns,這是與V1J-neo相同,除了在V1J-neo的2114位點(diǎn),唯一的Sfil限制性位點(diǎn)構(gòu)建到單獨(dú)的Kpn1位點(diǎn)上。在人基因組DNA中Sfil位點(diǎn)的出現(xiàn)率非常低(大約每100,000堿基1個位點(diǎn))。這樣,簡單地把提取的基因組DNA的Sfi1消化,該載體允許對表達(dá)載體整合到宿主DNA中作仔細(xì)監(jiān)測。在一進(jìn)一步的實(shí)施方案中,載體是V1R。在這載體中,盡可能地“剪去”非必需DNA以產(chǎn)生高度緊密的載體。該載體允許用作較大的插入片段,當(dāng)編碼特異的病毒基因構(gòu)建體被導(dǎo)入周圍組織時,較少涉及非必需的序列被編碼和細(xì)胞吸收的優(yōu)化。根據(jù)本領(lǐng)域人員熟知的方法,可完成用于產(chǎn)生前面的載體修飾和發(fā)展步驟的方法。
根據(jù)本工作,本領(lǐng)域的技術(shù)人員會認(rèn)為本發(fā)明的應(yīng)用之一是提供體內(nèi)和體外的檢測和分析系統(tǒng),結(jié)果能找出和CTL和T-細(xì)胞增殖應(yīng)答以及其他參數(shù)的M.tb序列多樣性的相關(guān)性。這些不同的基因的分離和克隆可按本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法完成。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種方法對疫苗產(chǎn)生的M.tb株和序列作系統(tǒng)鑒別。來自M.tb株的初級分離體基因的結(jié)合提供一種免疫原,它能誘導(dǎo)抗臨床的微生物分離體的免疫應(yīng)答,因而滿足迄今為止該領(lǐng)域未遇的需求。因而,假如毒性分離體變化,免疫原可修改以反映必需的新序列。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中,編碼M.tb蛋白的基因直接與轉(zhuǎn)錄啟動子相連。組織特異的啟動子或增強(qiáng)子例如肌肉肌酸激酶(MCK)增強(qiáng)子元件的應(yīng)用可望限制多核苷酸在一特定的組織類型中表達(dá)。例如,肌細(xì)胞是最終分化時不再分裂的細(xì)胞。外源DNA整合進(jìn)染合體似乎需要細(xì)胞分裂和蛋白合成。因此,對非分裂細(xì)胞如肌細(xì)胞限制性的蛋白表達(dá)是優(yōu)選的。不過,CMV啟動子的應(yīng)用對獲得PNV導(dǎo)入許多組織中表達(dá)是合適的。
M.tb和其他基因優(yōu)先地連接到特異地優(yōu)化作多核苷酸接種的表達(dá)載體中,在此描述的元件包括轉(zhuǎn)錄啟動子、免疫原性表位、編碼免疫增強(qiáng)或免疫調(diào)節(jié)基因的附加順反子和它們自身的啟動子,轉(zhuǎn)錄終止子、細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)和抗生素抗性基因。選擇性地,載體可含為多順反子mRNA表達(dá)的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會正確評價由DNA對等物編碼的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生多順反子mRNA的RNA在本發(fā)明范圍之內(nèi)。為該目的,必須用如強(qiáng)RNA聚合酶啟動子作T7或SP6啟動子為轉(zhuǎn)錄啟動子,用線性化的DNA模板進(jìn)行體外連續(xù)轉(zhuǎn)錄。這些方法在本領(lǐng)域中已眾所周知。
抗后續(xù)攻擊的多核苷酸M.tb免疫原的保護(hù)效用通過本發(fā)明的DNA免疫作用得到闡明。由于不涉及感染原,不需要細(xì)菌的組裝和復(fù)制和允許決定簇選擇,這是有利的。因此,因?yàn)榉种U菌基因產(chǎn)物的序列在M.tb的不同株中可能保守,能獲得由M.tb另一菌株引起的抗后續(xù)攻擊的保護(hù)作用。
編碼抗原85A,B或C的DNA表達(dá)載體的注射可導(dǎo)致抗后續(xù)攻擊的顯著的保護(hù)免疫性的形成。尤其是會產(chǎn)生特異的CTLs和輔助T淋巴細(xì)胞應(yīng)答。
因?yàn)镸.tb的每一個基因產(chǎn)物在不同的M.tb株中高度保守和因?yàn)槊庖邞?yīng)答能在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和MHC處理的反應(yīng)中產(chǎn)生,預(yù)計(jì)許多不同的M.tbPNV構(gòu)建體會產(chǎn)生交叉反應(yīng)的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明提供一種方法不需要自身復(fù)制因素或佐劑誘導(dǎo)異源性保護(hù)免疫。病毒蛋白和人生長激素DNA注射后[Tang等,自然356,152,1992]抗表達(dá)蛋白的高效價抗體的產(chǎn)生顯示,這是一種制取基于抗體的疫苗的方便和高效的方法,該疫苗靶向于保守抗原分別或和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和輔助T細(xì)胞結(jié)合。
產(chǎn)生和純化DNA構(gòu)建體的容易性和傳統(tǒng)的蛋白純化相比是有利的,便于結(jié)合疫苗的產(chǎn)生。因而可制備例如編碼抗原85復(fù)合體基因和任何其他的M.tb基因,也包括非M.tb基因的多種構(gòu)建體,混合和共施用。另外,以下的DNA注射維持了蛋白表達(dá)[H.Lin等,循環(huán)82,2217(1990);R.N.Kitsis等,美國國家科學(xué)院院報(bào)88,4138(1991);Hansen等,F(xiàn)EBS Lett,290,73(1991);S.Jiao等,人類基因治療3,21(1992);J.A.Wolff等,人類分子遺傳學(xué)1,363(1992)],B-和T-細(xì)胞記憶的持久性被增強(qiáng)[D.Gray和P.Mat Zinger,實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,174,969(1991);S.Oehen等,同上176,1273(1992)],因而產(chǎn)生長期存活的體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性。
導(dǎo)入到疫苗受體的能表達(dá)的DNA或轉(zhuǎn)錄的RNA數(shù)量具有非常寬的劑量范圍,依賴于所用的轉(zhuǎn)錄和翻譯的啟動子的強(qiáng)度。此外,免疫應(yīng)答的強(qiáng)度可能依賴于蛋白表達(dá)的水平和表達(dá)的基因產(chǎn)物的免疫原性。一般來說,大約1ng~5mg,100ng~2.5mg,1μg~750μg為有效劑量范圍,優(yōu)選直接用于肌肉組織的DNA約為10μg~300μg。皮下注射、真皮導(dǎo)入、透皮印模(impression)和其它給藥方式如腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或吸入輸送也是合適的。也可考慮提供加強(qiáng)接種。在用M.tb多核苷酸免疫原接種后,也可考慮用M.tb蛋白免疫原比如抗原85復(fù)合體基因產(chǎn)物予以加強(qiáng)。腸道外施用如白介素-12蛋白(或其他細(xì)胞因子,例如GM-CSF)靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下或其他方式的給藥,同時或接著本發(fā)明的PNV的腸道外導(dǎo)入是有利的。
多核苷酸可以是裸露的,那就是說,與影響受體免疫系統(tǒng)的任何蛋白、佐劑或其他因素?zé)o關(guān)。在這種情況下,多核苷酸必須在生理學(xué)可接受的溶液中,例如但不局限于無菌的鹽水或無菌的緩沖鹽水中。替代方法是DNA可和脂質(zhì)體作相連,如本領(lǐng)域熟知的卵磷脂脂質(zhì)體或其他脂質(zhì)體DNA-脂質(zhì)體混合物,或者DNA可和本領(lǐng)域熟知的佐劑相連,如蛋白或其他載體以促進(jìn)免疫應(yīng)答。也可用幫助DNA細(xì)胞吸收的試劑,例如但并不局限于鈣離子。這些試劑在此一般稱作轉(zhuǎn)染促進(jìn)試劑和藥學(xué)上可接受的載體。包被多核苷酸微粒的包被技術(shù)在本領(lǐng)域中已經(jīng)熟知,和本發(fā)明相銜接也是有用的。對計(jì)劃用于人的DNA,最終的DNA產(chǎn)物在藥學(xué)可接受的載體或緩沖溶液中可能是有用的。藥學(xué)可接受的載體或緩沖溶液在本領(lǐng)域中眾所周知,包括各種手冊如雷明頓氏藥學(xué)科學(xué)所描述的那些種類。
在另一實(shí)施方案中,本發(fā)明是一種多核苷酸,它包含能表達(dá)的連續(xù)核苷酸序列,在所述的多核苷酸體內(nèi)導(dǎo)入真核組織時產(chǎn)生基因產(chǎn)物。編碼的基因產(chǎn)物優(yōu)選地起免疫刺激物或抗原的作用,能引起免疫應(yīng)答。因此,在本實(shí)施方案中核苷酸序列編碼一種M.tb免疫原的表位和選擇性地編碼一種細(xì)胞因子或一種T-細(xì)胞共刺激元件如B7蛋白家族的一個成員。
用基因而不是其基因產(chǎn)物的免疫有幾個優(yōu)點(diǎn)。首先是相對的簡單性,通過它天然的或接近天然的抗原呈遞給免疫系統(tǒng)。哺乳動物蛋白在細(xì)菌、酵母或甚至哺乳動物細(xì)胞中重組表達(dá)常需要廣泛的處理,以保證合適的抗原性。DNA免疫的第二個優(yōu)點(diǎn)是有可能免疫原進(jìn)入MHC I類通路而引起細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答。用編碼流感A核蛋白(NP)的DNA免疫小鼠產(chǎn)生CD8+對NP的應(yīng)答,保護(hù)小鼠對抗異源性流感株的攻擊(Montgomery D.L.等,同前;Ulmer.J.等,同前)。
有充足的證據(jù)表明細(xì)胞介導(dǎo)的免疫在控制M.tb感染中是重要的[Orme等,1993,傳染病雜志167,1481;Cooper等1993,實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志178,2243;Flynn等,1993,實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志178,2249;Orme等,1993,免疫學(xué)雜志151,518]。由于DNA免疫能引起體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答,其最大的優(yōu)點(diǎn)是提供一種相對簡單的方法,為潛在的疫苗檢查大量的M.tb基因。
正如以上討論,DNA注射免疫亦允許多組分亞單位疫苗的快速組合。和多種流感基因同時免疫已于最近報(bào)道(Donnelly J.等,1994,疫苗,pp55-59)。包含其產(chǎn)物活化免疫系統(tǒng)不同武器的基因的一個M.tb疫苗也可提供對后續(xù)攻擊的完全保護(hù)。
本發(fā)明的疫苗對人類及家養(yǎng)或農(nóng)業(yè)動物給藥用是有用的。本發(fā)明的疫苗可用于預(yù)防和/或?qū)谷魏无r(nóng)業(yè)動物的感染,包括但不限于奶牛,奶牛對分支桿菌感染敏感。給動物和人服用這些疫苗的技術(shù)分別對于獸醫(yī)和人類健康領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知。
提供如下的實(shí)施例說明本發(fā)明,但不限于在此相同的例子。
實(shí)施例1生產(chǎn)疫苗的載體
A)V1表達(dá)載體表達(dá)載體V1構(gòu)建自pCMVIE-AKI-DHFR[Y.Whang等,病毒學(xué)雜志61,1796(1987)]。用EcoRI切割載體和自連接移去AKI和DHFR基因。該載體在CMV啟動子中不含內(nèi)含子A,所以加一段缺乏內(nèi)部SacI位點(diǎn)的PCR片段[在B.S.Chapman等,核苷酸研究19,3979(1991)定位在1855]。用于PCR反應(yīng)的模板是pCMVintA-Lux,來自pCMV6a120[見B.S.Chapman等,同上,]包括hCMV-IE1增強(qiáng)子/啟動子和內(nèi)含子A的HindIII和Nhe I片段連接到pBL3的Hind III和Xba I位點(diǎn)中產(chǎn)生pCMVIntBL制成。來自RSV-Lux[J.R.de Wet等,分子細(xì)胞生物學(xué),7,725,1987]的1881堿基對的蟲熒光素酶基因片段(Hind III-Sma I Klenow補(bǔ)平)克隆到pCMVIntbL的SalI位點(diǎn),它是Klenow補(bǔ)平和磷酸酶處理過的。
跨越內(nèi)含子A的引物是5′引物, SEQ.ID15′-CTATATAAGCAGAG CTCGTTTAG-3′;3′引物,SEQ.ID25′-GTAGCAAAGATCTAAGGACGGTGA CTGCAG-3′用于移去SacI位點(diǎn)的引物是有義引物,SEQ.ID35′-GTATGTGTCTGAAAATGAGCGTGGAGATTGGGCTCGCAC-3′和反義引物,SEQ.ID45′-GTGCGAGCCCAATCTCCACGCTCATTTTCAGACACA TAC-3′用SacI和BglII切下PCR片段,插入到用相同的酶切過的載體中。
B)V1J表達(dá)載體創(chuàng)制V1J的目的是從載體V1移去啟動子和轉(zhuǎn)錄終止元件以便在更精確的前后關(guān)系中確定它們,創(chuàng)造一種更緊密的載體和改善質(zhì)粒純化產(chǎn)率。
V1J衍生自V1和商業(yè)化的質(zhì)粒pUC18。V1用Ssp I和EcoRI限制酶消化產(chǎn)生二個DNA片段。這些片段的較小一個,含能控制異源基因表達(dá)的CMVintA啟動子和牛生長激素(BGH)轉(zhuǎn)錄終止元件,從瓊脂糖電泳凝膠純化。然后該DNA片段的末端用T4 DNA聚合酶“鈍化”,以便于另一個“鈍端”DNA片段的連接。
被選的pUC18提供表達(dá)載體的“骨架”。眾所周知它能產(chǎn)生高的質(zhì)粒產(chǎn)率,序列和功能被特征描述以及體積小。用Hae II限制酶部分消化從該載體中移去整個lac操縱子。質(zhì)粒的剩余部分從瓊脂糖電泳凝膠純化,鈍端處理用T4 DNA聚合酶和小中腸堿性磷酸酶,連接到上述的CMVintA/BGH元件上。獲得的質(zhì)粒顯示在pUC骨架中二個可能的啟動子元件方向的一種。這些質(zhì)粒的一個在大腸桿菌中產(chǎn)生更高產(chǎn)量的DNA,命名為V1J。載體的結(jié)構(gòu)通過連接區(qū)的序列分析證實(shí),與V1比較,進(jìn)一步表明產(chǎn)生相仿的或更高的異源基因表達(dá)。
C)V1Jneo表達(dá)載體必須移去錨定在V1J上用于細(xì)菌抗生素篩選的ampr基因,因?yàn)榘逼S霉素在大規(guī)模發(fā)酵中是不需要的。V1J的pUC骨架上的ampr基因用SspI和Eam1105I限制酶消化移去。質(zhì)粒的其余部分用瓊脂糖凝膠電泳純化,用T4 DNA聚合酶純化,然后用小牛腸堿性磷酸酶處理。商品化的Kanr基因,衍生自轉(zhuǎn)座子903,含在pUC4K質(zhì)粒中,用Pst I限制酶切下,瓊脂糖凝膠電泳純化、用T4 DNA聚合酶使末端鈍化。該片段和V1J骨架連接,產(chǎn)生的兩個方向具有Kanr基因的質(zhì)粒,命名為V1Jneo#′s1和3。這些質(zhì)粒的每一個用限制酶消化分析,連接區(qū)域的DNA序列測定證實(shí),表明產(chǎn)生與V1J相似的質(zhì)粒數(shù)量。對這些V1Jneo載體異源基因產(chǎn)物的表達(dá)也與V1J相當(dāng)。選出的V1Jneo#3,自此后稱為V1Jneo,含作為表達(dá)構(gòu)建體與V1J中的ampr基因相同方向的Kanr基因。
D)VIJns表達(dá)載體一個Sfi位點(diǎn)加到V1Jneo上以便于整合研究。商業(yè)來源的13個堿基對Sfi接頭(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)加到載體的BGH序列中的KpnI位點(diǎn)上。V1Jneo用KpnI線性化,凝膠純化,T4 DNA聚合酶鈍化,連接到鈍化的SfiI接頭上。通過限制性作圖挑選克隆分離體,通過接頭的序列分析證實(shí)。新載體命名為V1Jns。在V1Jns(有SfiI)中異源基因的表達(dá)相當(dāng)于在V1Jneo(有KpnI)中相同基因的表達(dá)。
E)V1Jns-tPA為提供異源的前導(dǎo)肽序列分泌和/或膜蛋白,修飾V1Jns以包含人組織特異的纖維蛋白酶原活化子(tPA)前導(dǎo)肽。二個合成的互補(bǔ)寡聚體退火,然后連接進(jìn)已被Bgl II消化的V1Jn中。有義和反義寡聚體是5′-GATC ACC ATG GAT GCA ATG AAG AGA GGG CTC TGC TGT GTGCTG CTG CTG TGT GGA GCA GTC TTC GTT TCG CCC AGC GA-3′SEQID5,和5′-GAT CTC GCT GGG CGA AAC GAA GAC TGC TCC ACACAG CAG CAG CAC ACA GCA GAG CCC TCT CTT CAT TGC ATC CATGGT-3′SEQ.ID6。Ko zak序列在有義寡聚體劃有下線。這些寡聚體有突出的堿基,與BglII酶切序列連接時兼容。連接后上游BglII位點(diǎn)被毀而下游BglII被保持作下一步的連接。二個連接位點(diǎn)及整個tPA前導(dǎo)序列通過DNA序列測定證實(shí)。另外,為了和統(tǒng)一優(yōu)化的載體V1Jns(=V1Jneo和SfiI位點(diǎn))一致,用T4 DNA聚合酶鈍化KpnI位點(diǎn)接著和SfiI連接子連結(jié)(目錄號1138,新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室),SfiI限制點(diǎn)代替了V1Jn-tPA的BGH終止子區(qū)中的KpnI位點(diǎn)。該修飾通過限制性消化和瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)。
F)pGEM-3-X-IRES-B7(其中X=任何抗原基因)作為提供編碼免疫原基因和編碼免疫刺激蛋白基因協(xié)調(diào)表達(dá)的雙順反子疫苗構(gòu)建體的一個實(shí)例,鼠B7基因PCR擴(kuò)增自B淋巴瘤細(xì)胞系CH1(從ATCC獲得)。B7是提供在主要組織相容性復(fù)合物I和II的前后關(guān)系中的抗原必需的共激活化T細(xì)胞的蛋白家屬的一個成員。CH1細(xì)胞是提供B7 mRNA良好來源,因?yàn)樗鼈冇薪M成性活化的表型,B7主要由活化的抗原呈遞細(xì)胞如B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)。這些細(xì)胞進(jìn)一步在體外用cAMP或IL-4刺激,制備mRNA用標(biāo)準(zhǔn)的硫氰酸胍操作。cDNA合成的操作用該mRNA和GeneAmp RNA PCR試劑盒(Perkin-Elmer Cetus)及特異地針對B7定位在B7翻譯開放閱讀框的下游的引物寡聚體(5′-GTA CCT CAT GAG CCA CAT AAT ACC ATG-3′,SGQ.ID7)。B7被PCR擴(kuò)增,分別用下列有義和反義PCR寡聚體5′-GGT ACA AGA TCT ACC ATG GCT TGC AAT TGT CAG TTG ATG C-3′SEQ.ID8,和5′-CCA CAT AGA TCT CCA TGG GAA CTA AAG GAAGAC GGT CTG TTC-3′,SEQ.ID9。這些寡聚體供有在插入片段末端的BglII限制酶位點(diǎn),和含一個NcoI限制位點(diǎn)及緊密地位于3′端BglII位點(diǎn)前的一個額外NcoI位點(diǎn)的Ko zak翻譯起始序列。NcoI消化產(chǎn)生的片段適于克隆進(jìn)已用NcoI消化的pGEM-3-IRES中。得到的載體,pGEM-3-IRES-B7,含一個易于轉(zhuǎn)移給V1Jns-X的IRES-B7盒,其中X代表一個編碼抗原的基因。
G)pGEM-3-X-IRES-GM-CSF(其中X=任何抗原基因)該載體含的盒與上述C項(xiàng)載體的相似,除了用免疫刺激細(xì)胞因子GM-CSF基因而不是B7之外。GM-CSF是巨噬細(xì)胞分化和刺激的細(xì)胞因子,已表明它在體內(nèi)引起強(qiáng)烈的抗腫瘤T細(xì)胞活性[G.Dranoff等,美國國家科學(xué)院院報(bào),90,3539(1993)。
H)pGEM-3-X-IRE S-IL-12(其中X=任何抗原基因)該載體含的盒與上述C項(xiàng)的載體相似,除了用免疫刺激細(xì)胞因子IL-12基因,而不是B7之外。已闡明IL-12在使免疫應(yīng)答移向與體液應(yīng)答相對的細(xì)胞的,T細(xì)胞主導(dǎo)的通路中有影響性作用[L.Alfonso等,科學(xué),263,235,1994]。
實(shí)施例2載體V1R的制備通過努力繼續(xù)優(yōu)化基本的接種載體,制備了V1Jns的衍生體,稱作V1R。構(gòu)建該載體的目的是獲得沒有非必需DNA序列的最小體積的疫苗載體,它仍保留整個優(yōu)化的異源基因表達(dá)特性和V1J及V1Jns賦予的高的質(zhì)粒產(chǎn)率。據(jù)文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)確定(1)包括大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)的pUC骨架之中的區(qū)域能被移去,而不影響細(xì)菌的質(zhì)粒產(chǎn)率;(2)接著卡那霉素開放閱讀框的kanr基因的3′區(qū)能移去,假如細(xì)菌的終止子插入其位的話;和(3)自BGH終止子的3′一半的~300bp能移去而不影響其調(diào)節(jié)功能(在BGH元件中接著的是原來的Kpn I限制酶位點(diǎn))。
構(gòu)建V1R用PCR從V1Jns分成三個DNA片段,分別代表CMVintA啟動子/BGH終止子,復(fù)制起點(diǎn)和卡那霉素抗性元件。對每一片段唯一的限制酶(位點(diǎn))用PCR寡聚體加到每一片段末端CMVintA/BGH加入SspI和XhoI;Kanr基因加入EcoRV和BamHI;及orir加入BclI和SalI。選擇這些酶位點(diǎn)是因?yàn)橛妹恳晃稽c(diǎn)的后來丟失,它們使來自PCR的DNA片段的每一個直接連接EcoRV和SspI留下連接相容的鈍端DNAs,而BamHI和BclI留下互補(bǔ)突出端與SalI和XhoI一樣。通過PCR獲得這些片段后,每一片段用如上所示的合適的限制酶消化,然后在含全部三種DNA片段的單一反應(yīng)混合液中連接在一起。設(shè)計(jì)orir的5′端包括在該區(qū)通常所見的T2rho獨(dú)立終止子序列,以能提供給卡那霉素抗性基因的終止信息。連接產(chǎn)物用限制酶消化(>8個酶)和連接接口的DNA序列測定證實(shí)。在V1R中DNA質(zhì)粒產(chǎn)量和用病毒基因的異源性表達(dá)似乎與V1Jns相似。所得的載體大小的凈減小數(shù)為1346bp(V1Jns=4.86kb;V1R=3.52kb)。
用于合成V1R的PCR寡聚物序列(限制酶位點(diǎn)已劃下線,在下列序列的括號中識別)(1)5′-GGT ACA AAT ATT GG CTA TTG GCC ATT GCA TAC G-3′[SspI],SEQ.ID10,(2)5′-CCA CAT CTC GAG GAA CCG GGT CAA TTC TTC AGCACC-3′[XhoI,SEQ.ID11(為CMVintA/BGH片段)(3)5′-GGT ACA GAT ATC GGA AAG CCA CGT TGT GTC TCA AAATC-3′[EcoRV],SEQ.ID12(4)5′-CCA CAT GGA TCCG TAA TGC TCT GCC AGT GTT ACAACC-3′[BamHI],SEQ.ID13(為卡那霉素抗性基因片段)(5)5′-GGT ACA TGA TCA CGT AGA AAA GAT CAA AGG ATC TTCTTG-3′[BclI],SEQ.ID14,(6)5′-CCA CAT GTC GAC CC GTA AAA AGG CCG CGT TGC TGG-3′[SalI],SEQ.ID15(為大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn))實(shí)施例3細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染為制備穩(wěn)定表達(dá)M.tb抗原的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系,RD細(xì)胞(人橫紋肌肉瘤ATCC CCL136)生長在37℃、5%CO2下,添加有10%熱失活的胎牛血清,20mM HEPES,4mM L-谷氨酰胺,和青霉素及鏈霉素每一種為100μg/mL的Dulbecco’s修飾的Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)中。細(xì)胞以1.5×106細(xì)胞/100mm2板接種,培養(yǎng)18小時。用CellPhect試劑盒(Pharmacia),細(xì)胞用每板TB構(gòu)建體10μg和共轉(zhuǎn)染的Ca+構(gòu)建體10μg轉(zhuǎn)染,DNA加入細(xì)胞后甘油休克5小時(15%甘油在PBS中,pH7.22.5分)。轉(zhuǎn)染后72小時,用2x-10mL冷PBS,pH7.2,加5mL冷TEN緩沖液(40mM TRIS-Cl,pH7.5,1mM EDTA,150mM NaCl)洗板,刮下,收獲培養(yǎng)物。作蛋白表達(dá)分析,細(xì)胞沉淀在50μL的單一去垢劑裂解緩沖液(50mM Tris-Cl,pH8.0,150mM NaCl,0.029。NaN3,1%NonidetP-40,100mM PMSF,2μg/ml抑蛋白酶肽,2μg/mL亮抑蛋白酶肽和1μg/mL Pepstatin A)中裂解,在冰上超聲(破裂2~15秒)。裂解物在13,000×g,4℃下離心10分鐘。蛋白濃度用布萊德福德Bradford法測定,每道20μg細(xì)胞提取蛋白上樣到10%TRIS-甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠(Novex)上,然后轉(zhuǎn)移到Immobilon P(Millipore)膜上。免疫印跡用120稀釋的小鼠單克隆抗體TD 17-4[Huygen等,1994,感染免疫62,363]反應(yīng)過夜,接著和1∶1000稀釋的羊抗小鼠IgG Fc過氧化酶(Jackson)反應(yīng)1.5小時。印跡用ECL試劑盒(Amersham)顯色。
實(shí)施例4克隆和DNA制備1.V1Jns-tPA-85A(含成熟的Ag85A具tPA信號序列)的構(gòu)建用下列引物進(jìn)行有義85A.C1引物[SEQ.ID.NO16]GG AAG ATC TTT TCC CGG CCG GGC TTG CCGBglII反義85A引物[SEQ.ID.NO17]GGAAGATCTTGTCTGTTCGGAGCTAGGC結(jié)核分支桿菌Ag85A擴(kuò)增自質(zhì)粒p85A.tub,它是一800bp HindIII片段與來自Borremans等,1989[感染免疫57,3123],圖2的1600bp HindIII-SphI片段連接而制備的。得到的2400bp插入片段亞克隆在BlueScribeM13+的HindIII和SpnI位點(diǎn)中。在BlueScribe M13+(VCS/Stratagene)中的整個編碼序列和側(cè)翼區(qū),在下列條件下用所示的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。每100μl反應(yīng)液含2.5單位克隆的Pfu DNA聚合酶(Stratagene),200mM dNTP,每一引物0.5μg和在補(bǔ)充有酶(Stratagene)的反應(yīng)緩沖液中的250ng模板DNA。Hybaid熱反應(yīng)器按下列編程94℃變性5分鐘,接著25個循環(huán)(94℃1分鐘,55℃2分鐘和72℃3分鐘),72℃延伸10分鐘結(jié)束。
擴(kuò)增的DNA用50μg/ml蛋白酶K(Boehringer Mannheim)37℃消化30分鐘,95℃加熱10分鐘接著苯酚(氯仿-異戊醇)抽提二次,一倍體積的異丙醇沉淀,70%乙醇洗二次,干燥并溶解在20μl H2O中。3μg擴(kuò)增的DNA用40單位的BglII(Boehringer Mannheim)消化,907bp的片段(在85A-C1的情況下)在1%瓊脂糖凝膠上分離,按廠家的指導(dǎo)書在“Prep a Gene”(BioRad)上提取。
該片段50ng與20ng BglII消化和脫磷酸化的V1Jns.tPA載體,在含位于連接緩沖液中的2.5單位T4 DNA連接酶(Amersham)的10μl反應(yīng)液中,14℃連接16小時,轉(zhuǎn)化到感受態(tài)DH5大腸桿菌(BRL)中,在含卡那霉素(50μg/ml)的LB瓊脂培養(yǎng)基上鋪板。挑取轉(zhuǎn)化體,其質(zhì)粒DNA用BglII(證實(shí)插入片段的存在)限制性酶切和PvuII確定其方向。
2.V1Jns-85A[C2](含成熟Ag85A,不具信號序列)的構(gòu)建用下列引物進(jìn)行有義85AC2[SEQ.ID.NO.18]GGA AGA TCT ACC ATG GGC TTT TCC CGG CCG GGC TTG C反義85A[SEQ.ID.NO.17]GGA AGA TCT TGC TGT TCG GAG CTA GGC除克隆是在V1Jns上之外,接著進(jìn)行與上面1中相同的操作。
3.V1Jns-85A[C3](含Ag85A具其自身的信號序列)的構(gòu)建用引物進(jìn)行有義85A C3[SEQ.ID.NO.19]GGA AGA TCT ACC ATG GCA CAG CTT GTT GAC AGG GTT反義85A[SEQ.ID.NO.17]GGA AGA TCT TGC TGT TCG GAG CTA GGC除克隆是在V1Jns上之外,接著進(jìn)行與上面1中相同的操作。
4.V1Jns-tPA-85B[C1](含Ag85B,具tPA信號序列)的構(gòu)建用下列引物進(jìn)行有義85B[C1][SEQ.ID.NO.20]GG AAG ATC TCC TTC TCC CGG CCG GGG CTG CCG GTC GAG反義85B[SEQ.ID.NO.21]GGA AGA TCT AAC CTT CGG TTG ATC CCG TCA GCC除PCR的模板是p85B.tub外,接著進(jìn)行與上面1中相同的操作。
5.V1Jns-tPA-85C[C1](含Ag85C,具tPA信號序列)的構(gòu)建用下列引物進(jìn)行有義85C[C1][SEQ.ID.NO.22]GG AAG ATC TCC TTC TCT AGG CCC GGT CTT CCA反義85C[SEQ.ID.NO.23]
GGA AGA TCT TGC CGA TGC TGG CTT GCT GGC TCA GGC除PCR的模板是p85C.tub外,接著進(jìn)行與上面1中相同的操作。
6.V1Jns-85B[C2](含Ag85B,不具信號序列)的構(gòu)建用下列引物進(jìn)行有義85B[C2][SEQ.ID.NO.24]GGA AGA TCT ACC ATG GGC TTC TCC CGG CCG GGG CTG C反義85B[SEQ.ID.NO.21]GGA AGA TCT AAC CTC GGT TGA TCC CGT CAG CC除PCR的模板是p85B.tub外,和克隆是V1Jns上之外,接著與上面1中相同的操作。
7.V1Jns-85C[C2](含Ag85C,不含信號序列)的構(gòu)建用下列引物進(jìn)行有義85C[C2][SEQ.ID.NO.25]GGA AGA TCT ACC ATG GGC TTC TCT AGG CCC GGT CTT C反義85C[SEQ.ID.NO.23]GGA AGA TCT TGC CGA TGC TGG CTT GCT GGC TCA GGC除PCR的模板是p85C.tub和克隆是在V1Jns中外,接著進(jìn)行與上面1中相同的操作。
限制性分析后,所有構(gòu)建體的跨載體連接部分做序列分析。大規(guī)模DNA制備基本按所述的方法(Montgomery,D.L.等,上文)。
質(zhì)粒構(gòu)建體的特點(diǎn)通過載體-插入連接部分的限制性作圖和序列分析得到(見
圖1-6)。結(jié)果與發(fā)表的M.tb序列數(shù)據(jù)一致,表明對每個構(gòu)建體來說啟動子是完整的(圖7)。也表明的是與M.tb Ag85無關(guān)的作為克隆的結(jié)果插入不同的附加氨基酸殘基。
實(shí)施例5來自V1Jns.tPA質(zhì)粒的M.tb蛋白表達(dá)在使用前一天,橫紋肌肉瘤細(xì)胞(ATCC CCL136)在添加10%熱滅活胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、25mM HEPEs,50U/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素的高葡萄糖DMEM中,以每9.5cm2孔1.2×106細(xì)胞的密度種在六孔組織培養(yǎng)板中。(全部來自BRL-Gibco)苯酚氯仿抽提氯化銫純化的質(zhì)粒DNA,用pharmacia Cellphect試劑用磷酸鈣沉淀,除RD細(xì)胞每個9.5cm2孔用5-15μg之外,按試劑盒的指示使用。培養(yǎng)物在加磷酸鈣-DNA沉淀后甘油休克6小時,重新?lián)Q液后,收獲前將培養(yǎng)物培養(yǎng)二天。
轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物的裂解液制備在添加1μm亮抑蛋白酶肽,1μm胃蛋白酶抑制劑,300nM抑蛋白酶肽和10μM TLCK的1X RIPA(0.5%SDS,1.0%TRITON X-100,1%脫氧膽酸鈉,1mM EDTA,150mM NaCl,25mM TRIS-HCl pH7.4)中,短暫超聲以降低粘性。裂解物通過電泳在10%Tricine膠(Novex)上分離,然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。免疫印跡用M.tb單克隆抗體17/4和32/15處理[Huygen等,1994,感染免疫62,363],用ECL檢測試劑盒(Amersham)顯色。
M.tb抗原85復(fù)合體基因的表達(dá)通過RD細(xì)胞的瞬時轉(zhuǎn)染闡明。轉(zhuǎn)染或模擬轉(zhuǎn)染細(xì)胞的裂解液SDS PAGE分離,免疫印跡法分析。圖8顯示V1Jns.tPA-85A(C1)、V1Jns.tPA-85A(C2)、V1Jns.tPA-85A(C3)和V1Jns.tPA-85B(C1)轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)一種表觀分子量約為30-32 kDa的免疫反應(yīng)蛋白。
實(shí)施例6用PNV免疫和抗原85蛋白在體內(nèi)表達(dá)5~6周齡的雌性BALB/c和C57BL/6小鼠腹膜(ip)內(nèi)注射在鹽水中的5mg鹽酸氯胺酮(Aveco,F(xiàn)ort Dodge,IA)和0.5mg甲苯噻嗪(Mobley Corp.,Shawnee,KS.)的混合液麻醉。后腿用70%乙醇擦洗。動物用懸浮在鹽水中的DNA(2mg/m1)100μl注射三次;每腿50μl。免疫后17-18天,收集血清樣品,作抗-Ag85抗體存在分析。圖9顯示來自注射Ag85 DNA小鼠(C1)的血清有特異的免疫印跡反應(yīng),而來自接受不含有基因插入(V1J)的對照DNA的小鼠沒有特異免疫印跡反應(yīng)。反應(yīng)性檢出是血清至少1∶160稀釋,抗300ng純化的抗原85A(圖96)。這說明Ag85DNA注射導(dǎo)致體內(nèi)Ag85表達(dá),這樣在二種BALB/c和C57BL/6(B6)小鼠中抗體應(yīng)答的產(chǎn)生是有效的。
實(shí)施例7抗原85特異的T細(xì)胞應(yīng)答在對特異抗原重刺激如Huygen等,1992[感染免疫60,2880]所述的應(yīng)答中,對來自接種小鼠的脾細(xì)胞作細(xì)胞因子分泌分析。脾細(xì)胞用來自牛分支桿菌BCG純化抗原85A或相當(dāng)于C57BL/6小鼠的一個熟知的T細(xì)胞表位(氨基酸241~260)的20-聚肽(p25)的培養(yǎng)濾過(CF)蛋白溫育。小鼠用V1Jns.tPA85A(C1)(100μg)間隔三周免疫三次,最后一次注射1 7天后分析。細(xì)胞因子分析IL-2、干擾素-γ(IFN-γ)和IL-6用生物分析法,IL-4和IL-10用ELISA法?;镜腎L-2和EFN-γ產(chǎn)生在兩種用V1Jns.tPA85A(C1)接種的BALB/c和C57BL/6小鼠中觀察到(圖10-13)。此外,C57BL/6小鼠也與H-2b限制的T細(xì)胞表位有反應(yīng)(圖13)。在V1Jns.tPA85A接種小鼠中,IL-4、IL-6和IL-10沒有增加(圖14-16)。這些結(jié)果提示輔助T細(xì)胞應(yīng)答的Th1型由DNA疫苗產(chǎn)生。
實(shí)施例8對分支桿菌攻擊的保護(hù)作用為測試M.tb DNA疫苗的效用,小鼠用活牛分支桿菌BCG(0.5mg)的靜脈內(nèi)注射攻擊,在脾和肺中分析BCG增殖。作為對照,BCG增殖在攻擊的首次實(shí)驗(yàn)小鼠(第一次感染)和在DNA注射期間用BCG接種的攻擊小鼠(第二次感染)中測定。與第一次感染小鼠或用對照DNA V1J接種的小鼠比較,在接種V1Jns.tPA85A(C1)小鼠的肺中,克隆形成單位(CFU)的數(shù)目基本上降低。在C57BL/6小鼠中,攻擊后第8天CFU降低了83%(圖17),在BALB/c小鼠中第20天CFU降低了65%(圖18)。在脾中,在BALB/c小鼠中攻擊后第20天(圖19)和在C57BL/6小鼠中第8天(圖20)CFU降低了約40%。因此,M.tb DNA疫苗注射后觀察到的免疫應(yīng)答在活M.bovis攻擊模型中提供了保護(hù)。
序列表(1)一般信息(i)申請人CONTENT,JEANHUYGEN,KRISLIU,MARGARET A.
MONTGOMERY,DONNAULMER,JEFFREY(ii)發(fā)明題目多核苷酸結(jié)核病疫苗(iii)序列數(shù)25(iv)通訊地址(A)收信人JACK L.TRIBBLE(B)街道126 E.LINCOLN AVE.,P.O.BOX 2000(C)城市RAHWAY(D)州NEW JERSEY(E)國家美國(F)郵政編碼07065-0907(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型Floppy disk(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0,Version#1.25(vi)當(dāng)前申請資料(A)申請?zhí)朥S08/338,992(B)提交日期1994年11月14日(C)分類(viii)委托人/代理人信息(A)姓名TRIBBLE JACK L.
(B)登記號32,633(C)參考/備審件號19342(ix)電訊信息(A)電話(908)594-5321(B)傳真(908)594-4720(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度23個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO1CTATATAAGC AGAGCTCGTT TAG 23(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO2GTAGCAAAGA TCTAAGGACG GTGACTGCAG 30(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度39個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO3GTATGTGTCT GAAAATGAGC GTGGAGATTG GGCTCGCAC39(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征
(A)長度39個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO4GTGCGAGCCC AATCTCCACG CTCATTTTCA GACACATAC39(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度78個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO5GATCACCATG GATGCAATGA AGAGAGGGCT CTGCTGTGTG CTGCTGCTGT GTGGAGCAGT 60CTTCGTTTCG CCCAGCGA 78(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度78個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO6GATCTCGCTG GGCGAAACGA AGACTGCTCC ACACAGCAGC AGCACACAGC AGAGCCCTCT 60CTTCATTGCA TCCATGGT 78(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征
(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO7GTACCTCATG AGCCACATAA TACCATG 27(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度40個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO8GGTACAAGAT CTACCATGGC TTGCAATTGT CAGTTGATGC 40(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度42個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO9CCACATAGAT CTCCATGGGA ACTAAAGGAA GACGGTCTGT TC42(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述 SEQ ID NO10GGTACAAATA TTGGCTATTG GCCATTGCAT ACG 33(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度36個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO11CCACATCTCG AGGAACCGGG TCAATTCTTC AGCACC 36(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度38個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO12GGTACAGATA TCGGAAAGCC ACGTTGTGTC TCAAATC 38(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度37個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性
(ii)分子類型 DNA(基因組的)(xi)序列描述 SEQ ID NO13CCACATGGAT CCGTAATGCT CTGCCAGTGT TACAACC 37(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長度39個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO14GGTACATGAT CACGTAGAAA AGATCAAAGG ATCTTCTTG39(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長度34個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO15CCACATGTCG ACCCGTAAAAA GGCCGCGTTG CTGG35(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長度29個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO16GGAAGATCTT TTCCCGGCCG GGCTTGCCG 29(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長度28個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO17GGAAGATCTT GTCTGTTCGG AGCTAGGC28(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長度37個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO18GGAAGATCTA CCATGGGCTT TTCCCGGCCG GGCTTGC 37(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長度36個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO19GGAAGATCTA CCATGGCACA GCTTGTTGAC AGGGTT 36(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)長度38個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO20GGAAGATCTC CTTCTCCCGG CCGGGGCTGC CGGTCGAG38(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO21GGAAGATCTA ACCTTCGGTT GATCCCGTCA GCC 33(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)長度32個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO22GGAAGATCTC CTTCTCTAGG CCCGGTCTTC CA 32(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征
(A)長度36個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO23GGAAGATCTT GCCGATGCTG GCTTGCTGGC TCAGGC 36(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)長度37個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO24GGAAGATCTA CCATGGGCTT CTCCCGGCCG GGGCTGC 37(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)長度37個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO25GGAAGATCTA CCATGGGCTT CTCTAGGCCC GGTCTTC 3權(quán)利要求
1.一種在導(dǎo)入脊椎動物組織中誘導(dǎo)一種或多種抗分支桿菌免疫應(yīng)答的多核苷酸,其免疫應(yīng)答選自抗體、CTL、輔助T淋巴細(xì)胞應(yīng)答和保護(hù)性免疫應(yīng)答,其中所述的多核苷酸包括編碼一種或多種分支桿菌蛋白或其功能性等價體的一個或多個基因,所述的基因可操作地連在轉(zhuǎn)錄啟動子上。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸,其中所述的基因編碼一種結(jié)核分支桿菌蛋白和其功能性等價體。
3.權(quán)利要求2的多核苷酸,其中所述的基因編碼一種選自抗原85A、B、和/或C的和其功能性等價體的蛋白。
4.一種在脊椎動物中誘導(dǎo)抗分支桿菌表位的免疫應(yīng)答的方法,包括將根據(jù)權(quán)利要求1的1ng~5mg多核苷酸導(dǎo)入到脊椎動物組織中。
5.權(quán)利要求4的方法,其中所述的基因編碼一種結(jié)核分支桿菌蛋白和其功能性等價體。
6.權(quán)利要求5的方法,其中所述的基因編碼一種選自抗原85A、B和C和其功能性等價體的蛋白。
7.一種誘導(dǎo)抗分支桿菌抗原免疫應(yīng)答的疫苗,包括權(quán)利要求1的多核苷酸和一種藥學(xué)可接受的載體。
8.權(quán)利要求7的疫苗,其中所述的抗原是一種結(jié)核分支桿菌抗原和其功能性等價體。
9.權(quán)利要求8的疫苗,其中所述的抗原是一種選自抗原85A、B和C以及其功能性等價體的蛋白。
10.一種誘導(dǎo)抗分支桿菌抗原的免疫應(yīng)答的方法,包括將一或多種分離和純化的分支桿菌基因?qū)氲郊棺祫游锏慕M織中,引起預(yù)防分支桿菌感染和/或減輕分支桿菌疾病的免疫應(yīng)答。
11.權(quán)利要求10的方法,其中所述的基因編碼一種結(jié)核分支桿菌蛋白和其功能性等價體。
12.權(quán)利要求11的方法,其中所述的基因編碼一種選自抗原85A、B、和C及其功能性等價體的蛋白。
13.一種多核苷酸,其包括a)一種真核轉(zhuǎn)錄啟動子;b)一種操作性地與所述啟動子連接的編碼一或多種分桿菌表位的開放閱讀框,和一種翻譯終止信號;以及c)選擇性地含有一種或多種操作性連接的IRES,一種或多種編碼一種或多種附加基因的開放閱讀框,和一種或多種轉(zhuǎn)錄終止信號。
14.權(quán)利要求13的多核苷酸,其中所述c)的附加基因是選自GM-CSF、IL-12、干擾素、和T-細(xì)胞共刺激蛋白B7家族的一個成員的免疫調(diào)節(jié)或免疫刺激基因。
15.權(quán)利要求13的多核苷酸,其中所述的a)的分支桿菌基因編碼一種結(jié)核分支桿菌蛋白和其功能性等價體。
16.權(quán)利要求15的多核苷酸,其中所述a)的分支桿菌基因編碼一種選自抗原85A、B和C的和其功能性等價體的結(jié)核分支桿菌蛋白。
17.權(quán)利要求13的多核苷酸,其中所述c)的附加基因是選自抗原85A、B和C和其功能性等價體的結(jié)核分支桿菌基因。
18.一種在需要治療時用一種多核苷酸治療病人的方法,該多核苷酸在導(dǎo)入脊椎動物組織中后誘導(dǎo)一或多種選自抗體、CTL、輔助T淋巴細(xì)胞應(yīng)答和保護(hù)性免疫應(yīng)答的抗分支桿菌免疫應(yīng)答,其中所述的多核苷酸包括編碼一種或多種分支桿菌蛋白或其功能性等價體的基因,所述的基因可操作性地連接在一轉(zhuǎn)錄啟動子上。
19.權(quán)利要求18的方法,其中所述的基因編碼一種結(jié)核分支桿菌蛋白和其功能性等價體。
20.權(quán)利要求19的方法,其中所述的基因編碼一種或多種選自抗原85A、B和C及其功能性等價體的蛋白。
21.權(quán)利要求10的方法,其中所述的患者是家養(yǎng)動物或家畜。
22.一種在家養(yǎng)或農(nóng)業(yè)動物中誘導(dǎo)抗分支桿菌感染的免疫應(yīng)答的方法,包括權(quán)利要求1的多核苷酸和一種藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
編碼結(jié)核分支桿菌(M.tb蛋白)的基因被克隆進(jìn)真核表面載體中,以使其在哺乳肌肉細(xì)胞體內(nèi)表達(dá)所編碼的蛋白。動物免疫是通過注射這些稱為多核苷酸疫苗或PNV的這些DNA構(gòu)建體到動物的肌肉中而進(jìn)行的。產(chǎn)生抗M.tb抗原的免疫抗血清。在接種小鼠的脾細(xì)胞中檢測到特異的T-細(xì)胞應(yīng)答,抗原應(yīng)答中細(xì)胞因子分泌的類型提示有T
文檔編號C07K14/35GK1171814SQ95197250
公開日1998年1月28日 申請日期1995年11月13日 優(yōu)先權(quán)日1994年11月14日
發(fā)明者M·A·劉, D·蒙特戈馬利, J·厄爾默, J·康坦特, K·休根 申請人:麥克公司, 英諾吉尼蒂克斯有限公司