具有較大張力的小環(huán)形核苷酸探針及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子檢測(cè)領(lǐng)域，具體設(shè)及具有較大張力的小環(huán)形核巧酸探針，還設(shè)及 該探針的制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] MicroRNA(miRNA)是一類內(nèi)生的、長度約為20-24個(gè)核巧酸的小RNA，其在細(xì)胞內(nèi)具 有多種重要的調(diào)節(jié)作用。每個(gè)miRNA可W有多個(gè)祀基因，而幾個(gè)miRNA也可W調(diào)節(jié)同一個(gè)基 因，其在動(dòng)植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。miRNA可W通過與祀基因的完全互補(bǔ)或不完全 互補(bǔ)來達(dá)到祀向切割mRNA或者抑制祀基因的翻譯，從而起調(diào)芐基因表達(dá)的作用；然而運(yùn)些 祀向mRNA廣泛參與一些重要的細(xì)胞過程，包括細(xì)胞的生長、增殖、分化和調(diào)亡，并且在不同 的發(fā)育階段其表達(dá)水平也有所不同。因此miRNA被當(dāng)作許多細(xì)胞活力的重調(diào)控者。miRNA表 達(dá)的改變與許多疾病和失調(diào)都有或多或少的關(guān)系，但是由于miRNAs高度的序列相似性、種 類的多樣性W及序列的短小性，miRNA臨床診斷面臨了一些挑戰(zhàn)。采用傳統(tǒng)的方法將miRNA 從組織活細(xì)胞中分離出來，然后進(jìn)行檢測(cè)，運(yùn)個(gè)過程中由于miRNA在細(xì)胞內(nèi)的濃度是非常低 的，所W必須經(jīng)過富集和擴(kuò)增，運(yùn)會(huì)大大耗費(fèi)時(shí)間、精力W及資金;Nor them B101法被認(rèn)為 是miRNA檢測(cè)和確認(rèn)的金標(biāo)準(zhǔn)，但是其特異性和靈敏度均不高，雖然后來一些科學(xué)家也對(duì)該 方法進(jìn)行了拓展(比如采用鎖核酸LNA修飾的雜交探針、核糖核酸酶保護(hù)法），但總的來說運(yùn) 些方法相對(duì)來說需要的樣品量較大、步驟繁瑣、不適用于高通量分析等限制了其臨床應(yīng)用。 采用RT-qPCR檢測(cè)miRNA的靈敏度很高，樣本量也相對(duì)少，但是由于miRNA序列短，要求引物 的序列就更加短小，從而就要求更低的溶解溫度，然而低的溶解溫度會(huì)影響PCR擴(kuò)增。導(dǎo)致 所檢測(cè)到的是前體的miRNA,而并非是成熟的miRNA,在細(xì)胞中前提的miRNA和成熟的miRNA 的水平也不一致，所W該方法也常產(chǎn)生一些假陽性信號(hào)，且反應(yīng)所需要酶和試劑W及檢測(cè) 的儀器都非常的昂貴，因此也使得成本相應(yīng)較高。微陣列忍片技術(shù)(Microarray)發(fā)已被廣 泛用于miRNA的檢測(cè)，相對(duì)于其他的檢測(cè)方法其最大的優(yōu)點(diǎn)是具有高通量性，然而該技術(shù)花 費(fèi)較大，需要機(jī)器加工，一些小型實(shí)驗(yàn)室也不具備運(yùn)些條件;另外，其靈敏度也比較低。W納 米材料為基礎(chǔ)的一些檢測(cè)方法也越來越多的學(xué)者進(jìn)行了研究，比如納米金標(biāo)記技術(shù)的檢 巧。、基于納米孔的microRNA傳感器、基于量子點(diǎn)的檢測(cè)W及基于石墨締的檢測(cè)都為 microRNA的檢測(cè)提供的方法。分子信標(biāo)(MB)，是發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核巧酸探針，已被 廣泛用于檢巧化NA和RNA，具有很高的靈敏度和特異性，但是MB在活細(xì)胞中識(shí)別miRNA同源序 列的應(yīng)用仍然鮮有報(bào)道。近年來，幾種新的miRNA檢測(cè)方法已被報(bào)道，如安培磁力生物傳感 器、基于水凝膠的微流體方法W及等速電泳方法。雖然，電化學(xué)磁敏傳感器等在檢測(cè)miRNA 有很高的特異性，但病毒蛋白的選擇性識(shí)別是必要的?；谌唐闲揎椝z的方法和等 速電泳法在檢測(cè)miRNA中被證明是有效的，然而運(yùn)些技術(shù)在檢測(cè)活細(xì)胞中的miRNA的時(shí)候是 非常復(fù)雜和耗時(shí)的。巧光原位雜交(FISH)被認(rèn)為是活細(xì)胞中檢測(cè)基因表達(dá)的最常用的方 法，但是它的識(shí)別單堿基錯(cuò)配的miRNAs的能力是有限的。最近，四嗦介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)和滾環(huán) 信號(hào)放大的方法已成功地應(yīng)用于miRNA的檢測(cè)和成像，然而，運(yùn)些方法非常繁瑣且不容易被 廣泛使用。因此，亟待需要一個(gè)更簡單有效的、高度特異性的、敏感的miRNA的檢測(cè)和成像的 方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供具有較大張力的小環(huán)形核巧酸探針;本發(fā) 明的目的之二在于提供具有較大張力的小環(huán)形核巧酸探針的制備方法;本發(fā)明的目的之Ξ 在于提供具有較大張力的小環(huán)形核巧酸探針在細(xì)胞內(nèi)生物分子的識(shí)別與活性調(diào)控方面的 應(yīng);本發(fā)明的目的之四在于提供具有較大張力的小環(huán)形核巧酸探針在制備定性或定量檢測(cè) 核酸序列的試劑中的應(yīng)用;本發(fā)明的目的之五在于提供含有所述具有較大張力的小環(huán)形核 巧酸探針的試劑盒。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0005] 本發(fā)明通過設(shè)計(jì)具有較大張力的小環(huán)形核巧酸探針(簡稱為RP)，由閉合小環(huán)形核 巧酸單鏈（簡稱為R)與核巧酸長度短于閉合小環(huán)形核巧酸單鏈的核巧酸短單鏈（簡稱為 DNAQ)雜交形成;所述小環(huán)形核巧酸探針利用閉合小環(huán)形核巧酸單鏈特異識(shí)別目標(biāo)檢測(cè)物 并與目標(biāo)檢測(cè)物雜交同時(shí)置換出核巧酸短單鏈;所述閉合小環(huán)形核巧酸單鏈探針與核巧酸 短單鏈標(biāo)記有相互作用性標(biāo)記系統(tǒng)，該相互作用性標(biāo)記系統(tǒng)在目標(biāo)檢測(cè)物與核巧酸短單鏈 置換時(shí)產(chǎn)生一個(gè)或者多個(gè)可檢測(cè)信號(hào)，結(jié)構(gòu)如圖1所示。由于閉合小環(huán)就有較大的環(huán)張力， 增加的分子識(shí)別的難度，提高了識(shí)別的專一性；同時(shí)"半競爭性鏈置換"的使用，進(jìn)一步提高 了檢測(cè)的選擇性。此外，目標(biāo)分子誘導(dǎo)的信號(hào)由"OFF"變?yōu)?ON"，降低了背景信號(hào)，提高了信 噪比，并且拓展了其在細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)用。本發(fā)明中，檢測(cè)信號(hào)可W為如下方式標(biāo)記的信號(hào):化 學(xué)標(biāo)記、酶標(biāo)記、放射性標(biāo)記、巧光標(biāo)記、發(fā)光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記或者金屬標(biāo)記，優(yōu)選為巧 光標(biāo)記;分別于閉合小環(huán)形核巧酸單鏈標(biāo)記報(bào)道分子或巧滅分子，核巧酸短單鏈標(biāo)記相互 作用的巧滅分子或報(bào)道分子。
[0006] 本發(fā)明的探針檢測(cè)原理：由于R與DNAQ雜交，相互作用性標(biāo)記系統(tǒng)W巧光標(biāo)記為 例，巧光報(bào)告基團(tuán)與澤滅基團(tuán)在巧光能量共轉(zhuǎn)移作用(FRET)下巧光處于"關(guān)閉"狀態(tài)，當(dāng)目 標(biāo)檢測(cè)物添加至反應(yīng)體系中，目標(biāo)檢測(cè)物能夠與DNAQ發(fā)生置換，然后與R雜交，此時(shí)巧光報(bào) 告基團(tuán)與澤滅基團(tuán)之間的巧光能量共轉(zhuǎn)移作用(FRET)被消除，巧光報(bào)告基團(tuán)釋放巧光從而 巧光切換到"開啟"狀態(tài)。但是，如果目標(biāo)檢測(cè)物中有一個(gè)堿基發(fā)生錯(cuò)配時(shí)由于來自環(huán)形結(jié) 的張力將不能完全置換出DNAQ鏈，從而能夠區(qū)分完全互補(bǔ)序列與單堿基錯(cuò)配序列，并具有 高的選擇性。所W，本發(fā)明的RP可用核酸定性或定量檢測(cè)，并用于區(qū)分完全互補(bǔ)核酸序列和 單堿基錯(cuò)配核酸序列，其中核酸可W為DNA、RNA或miRNA。
[0007] 本發(fā)明中，閉合小環(huán)形核巧酸單鏈只要能形成環(huán)狀即可，優(yōu)選的，所述閉合小環(huán)形 核巧酸單鏈的長度為22~60個(gè)堿基。
[0008] 本發(fā)明中，具有較大張力的小環(huán)形核巧酸探針的制備方法如下:將A信號(hào)標(biāo)記的核 巧酸、膚核酸、鎖核酸單鏈的兩端連接形成閉合環(huán)狀或類似環(huán)狀結(jié)構(gòu);然后將所形成閉合環(huán) 狀或類似環(huán)狀結(jié)構(gòu)與B信號(hào)標(biāo)記的核巧酸長度短于閉合小環(huán)形核巧酸單鏈的核巧酸短單鏈 雜交，得小環(huán)形核巧酸探針；
[0009] 所述A信號(hào)與B信號(hào)為相互作用性標(biāo)記系統(tǒng)。
[0010] 其連接可W采用任意方式連接，優(yōu)先的通過共價(jià)鍵、疏水相互作用、靜電吸引、分 子間引力或生物識(shí)別連接。
[0011] 本發(fā)明中，利用小環(huán)形核巧酸探針具有識(shí)別生物分子的能力，因此可W將具有較 大張力的小環(huán)形核巧酸探針用于制備識(shí)別細(xì)胞內(nèi)生物分子識(shí)別與生物活性調(diào)控的試劑，用 于細(xì)胞內(nèi)生物分子的識(shí)別與活性調(diào)控方面的應(yīng)用，所述生物分子為DNA、RNA、miRNA、蛋白質(zhì) 或酶中的一種或幾種。其中，所述生物分子為DNA、RNA、miRNA或蛋白質(zhì)。具有較大張力的小 環(huán)形核巧酸探針還可W用于定性或定量檢測(cè)核酸序列，所述核酸序列為DNA、RNA或miRNA序 列。
[0012] 為了使用方便將具有較大張力的小環(huán)形核巧酸探針作為試劑制備成試劑盒，檢測(cè) 時(shí)將環(huán)形DNA的探針(RP)直接與目標(biāo)檢測(cè)物雜交，然后通過電泳分析或巧光檢測(cè)，通過信號(hào) 強(qiáng)度判斷目標(biāo)基因表達(dá)量或單堿基錯(cuò)配W及錯(cuò)配位點(diǎn)。
[0013] 本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明公開了具有較大張力的小環(huán)形核巧酸探針，將探 針設(shè)計(jì)為環(huán)形結(jié)構(gòu)，利用環(huán)形結(jié)構(gòu)的較強(qiáng)張力，提高檢測(cè)特異性和靈敏度，不但能夠區(qū)分完 全互補(bǔ)和錯(cuò)配一個(gè)堿基，還能區(qū)分單堿基錯(cuò)配位點(diǎn)，并且使用本發(fā)明的環(huán)形DNA探針不需要 提取所檢測(cè)的DNA或RNA，可直接將探針轉(zhuǎn)染進(jìn)入活細(xì)胞中進(jìn)行成像分析，達(dá)到檢測(cè)效果，其 操作簡便，反應(yīng)條件溫和，室溫即可，還可W用于識(shí)別細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外生物分子W及調(diào)控細(xì) 胞內(nèi)生物分子表達(dá)與活性，應(yīng)用范圍廣，具有很好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0014] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
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