專利名稱：通過抑制nrf2的天然反義轉(zhuǎn)錄物治療核因子(紅細(xì)胞衍生2)-樣2(nrf2)相關(guān)疾病的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的實(shí)施方案包括調(diào)節(jié)NRF2及相關(guān)分子的表達(dá)和/或功能的寡核苷酸。
背景技術(shù)：
DNA-RNA和RNA-RNA雜交對(duì)包括DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯在內(nèi)的核酸功能的許多方面均很重要。雜交對(duì)于檢測(cè)特定的核酸或改變其表達(dá)的各種技術(shù)也很重要。例如，反義核苷酸通過與靶RNA雜交來擾亂基因表達(dá)，從而干擾RNA剪接、轉(zhuǎn)錄、翻譯和復(fù)制。反義DNA具有額外的特點(diǎn)是，DNA-RNA雜合體作為存在于大多數(shù)細(xì)胞類型中的核糖核酸酶H消化活性的底物?？蓪⒎戳x分子遞送到細(xì)胞中，其如寡脫氧核苷酸(ODN)的情況，或可自內(nèi)源基因?qū)⑵浔磉_(dá)為RNA分子。FDA最近批準(zhǔn)了一種反義藥物VITRAVENE (用于治療巨細(xì)胞病毒性視網(wǎng)膜炎)，這反映了反義物具有治療效用。概述本概述被提供用于表示本發(fā)明概述，以簡(jiǎn)要地指出本發(fā)明的特性和主旨。應(yīng)該理解其提交不應(yīng)被用來解釋或限制權(quán)利要求的范圍或含義。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于抑制天然反義轉(zhuǎn)錄物作用的方法，其通過使用靶向天然反義轉(zhuǎn)錄物的任何區(qū)域的一種或多種反義寡核苷酸導(dǎo)致上調(diào)相應(yīng)有義基因來進(jìn)行。本文亦預(yù)期天然反義轉(zhuǎn)錄物的抑制可通過被認(rèn)為落入本發(fā)明范圍內(nèi)的siRNA、核酶和小分子來實(shí)現(xiàn)。一個(gè)實(shí)施方案提供一種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中NRF2多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞或組織與5-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與包含SEQ ID NO :3(圖3)的1-5808位核苷酸內(nèi)的5_30個(gè)連續(xù)核苷酸的多核苷酸的反向互補(bǔ)序列具有至少50%的序列同一性；藉此體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的NRF2多核苷酸的功能和/或表達(dá)。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸靶向NRF2多核苷酸的天然反義序列，例如在 SEQ ID NO :3中所示的核苷酸及其任何變體、等位基因、同源物、突變體、衍生物、片段和互補(bǔ)序列。反義寡核苷酸的實(shí)例示于SEQ ID NO 4-6(圖4)。另一實(shí)施方案提供一種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中NRF2多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞或組織與5-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與NRF2多核苷酸的反義物的反向互補(bǔ)序列具有至少50%的序列同一性；藉此體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的NRF2多核苷酸的功能和/或表達(dá)。另一實(shí)施方案提供一種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中NRF2多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞或組織與5-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與NRF2反義多核苷酸的反義寡核苷酸具有至少50%的序列同一性；藉此體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的NRF2多核苷酸的功能和/或表達(dá)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，一種組合物包含一種或多種與有義和/或反義NRF2多核苷酸結(jié)合的反義寡核苷酸。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸包含一個(gè)或多個(gè)修飾或取代核苷酸。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸包含一個(gè)或多個(gè)修飾鍵。在又一實(shí)施方案中，修飾核苷酸包括含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯的修飾堿基，肽核酸，2’ -0-甲基、氟-或碳、亞甲基或其它鎖定核酸(LNA)分子。優(yōu)選修飾核苷酸是鎖定核酸分子，包括α-L-LNA。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，將寡核苷酸皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)給予患者。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸以藥物組合物給予。治療方案包括將反義化合物給予患者至少一次；然而，該治療可修改為在一段時(shí)間內(nèi)包括多個(gè)劑量。該治療可與一種或多種其它類型的治療聯(lián)合。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，將寡核苷酸包封在脂質(zhì)體中，或連接到載體分子(例如膽固醇、TAT肽)上。下文闡述其它方面。附圖
簡(jiǎn)述圖 1 圖IA是實(shí)時(shí)PCR結(jié)果圖，其顯示在用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸治療ifepG2細(xì)胞后與對(duì)照相比的NRF2mRNA的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果表明，在用設(shè)計(jì)為NRF2反義物BU6569M. 1的兩種寡核苷酸治療后48小時(shí)，顯著提高H印G2 細(xì)胞中的NRF2mRNA水平。表示為CUR-0330和CUR-0332的條塊分別對(duì)應(yīng)用SEQ ID NO 4 和5治療的樣品。圖IB為實(shí)時(shí)PCR結(jié)果圖，其顯示在用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸治療CHP212細(xì)胞后與對(duì)照相比的NRF2mRNA的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果表明，在用設(shè)計(jì)為NRF2反義物BTO56954. 1的兩種寡核苷酸治療后48小時(shí)，顯著提高CHP212 細(xì)胞中的NRF2mRNA水平。表示為CUR_0330、CUR_0332和CUR-0509的條塊分別對(duì)應(yīng)用SEQ ID N0:4、5和6治療的樣品。圖2顯示SEQ ID NO 1 人核因子(紅細(xì)胞衍生2)-樣2 (NFE2L2)、轉(zhuǎn)錄物變體l、mRNA (NCBI 登錄號(hào)NM_006164)。SEQ ID NO 2 :NRF2的基因組序列(大寫字母顯示外顯子，小寫為內(nèi)含子)。圖 3 顯示 SEQ ID NO 3 天然 NRF2 反義序列(BU656954. 1)。圖4顯示反義寡核苷酸SEQ ID NO :4_6。*表示硫代磷酸酯鍵。圖5顯示有義寡核苷酸SEQ ID NO :7和8。有義寡核苷酸SEQ ID NO :7和8分別為反義寡核苷酸SEQ ID NO :4和5的反向互補(bǔ)序列。
詳述以下參考用于闡明的實(shí)施例應(yīng)用來闡述本發(fā)明的若干方面。應(yīng)該理解，提出許多具體細(xì)節(jié)、關(guān)系和方法是為了提供對(duì)本發(fā)明的充分理解。然而，相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將易于認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明不需要一個(gè)或多個(gè)具體細(xì)節(jié)或用其它方法即可實(shí)施。本發(fā)明不受行為或事件順序的限制，因?yàn)槟承┬袨榭赡芤圆煌拇涡虬l(fā)生，和/或與其它行為或事件同時(shí)發(fā)生。此外，并非所有闡述的行為或事件為實(shí)施本發(fā)明的方法所必需。氧對(duì)人是必不可少的，但身體中作為其副產(chǎn)品產(chǎn)生的活性氧物質(zhì)是高度有毒的。 人們已知，由于活性氧引起的氧化應(yīng)激造成的細(xì)胞損傷，深深參與到各種年齡相關(guān)慢性疾病(例如動(dòng)脈硬化、高血壓、糖尿病、腦神經(jīng)退行性疾病、皮膚病、眼病、哮喘和癌癥)的發(fā)作或進(jìn)展中。在預(yù)防這些疾病或延緩其進(jìn)展中，提高保護(hù)免受氧化應(yīng)激的能力是有用的 (Biomed Pharmacother. 57，251—6(^2003))。稱為II期酶的一系列蛋白質(zhì)在保護(hù)身體免受氧化應(yīng)激或?qū)Ξ惿镔|(zhì)的解毒中協(xié)作。已知的II期酶的實(shí)例包括谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、NAD(P)H:奎寧氧化還原酶 1 (NQOl)、谷氨酰(glutanyl)-半胱氨酰連接酶(GCL)、血紅素加氧酶1 (HOl)和硫氧還蛋白還原酶1 (TXNRDl)。稱為抗氧化劑應(yīng)答元件(ARE)的共有序列存在于這些II期酶的每一個(gè)基因的啟動(dòng)子中，且其表達(dá)由轉(zhuǎn)錄因子NRF2(NF-E2相關(guān)因子2)誘導(dǎo)(Armu Rev Pharmacol Toxicol,43 :233-60(2003))。通常認(rèn)為NRF2作為Keapl_NRF2復(fù)合體存在于細(xì)胞質(zhì)中，并且當(dāng)激活劑在其中起作用時(shí)，其進(jìn)入細(xì)胞核并與小的Maf蛋白形成異二聚體以結(jié)合ARE，藉此增加II期酶的表達(dá)。因?yàn)榇竽X具有相對(duì)高的代謝率和低的細(xì)胞再生能力，所以與其它器官相比，大腦是易受因氧化應(yīng)激所致?lián)p傷的器官。此外，因?yàn)榇竽X中的活性氧物質(zhì)的量隨著年齡增加，這就暗示保護(hù)大腦免受氧化應(yīng)激的能力可能隨年齡而降低。據(jù)相信氧化應(yīng)激的增加與腦神經(jīng)疾病的發(fā)作密切相關(guān)，腦神經(jīng)疾病例如阿爾茨海默病、帕金森病和肌萎縮性側(cè)索硬化癥。 例如，脂質(zhì)過氧化物的標(biāo)記物4-羥基壬烯醛或丙二醛的累積業(yè)已在阿爾茨海默病患者的大腦皮層或海馬、帕金森病患者的塞梅林神經(jīng)節(jié)和肌萎縮性側(cè)索硬化癥患者的脊髓液中觀察到。此外，在阿爾茨海默病中，淀粉樣蛋白(被認(rèn)為是致病物質(zhì))增加細(xì)胞內(nèi)過氧化氫的量，而且在帕金森病中，已知增加多巴胺增加了包括過氧化氫在內(nèi)的多種活性氧物質(zhì)分子物類的量。亦報(bào)道在帕金森病中，塞梅林神經(jīng)節(jié)中的谷胱甘肽的量成為疾病的生化指標(biāo)，而谷胱甘肽的量隨疾病惡化而減少(Nat Med. 10 Suppl. S18-25 (2004)) 0因此，增強(qiáng)保護(hù)免于活性氧(例如，預(yù)防過氧化氫所致細(xì)胞損傷和增加細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的量)的能力，被認(rèn)為有效預(yù)防和或使這些腦神經(jīng)退行性疾病轉(zhuǎn)佳。另據(jù)報(bào)道，誘導(dǎo)II期酶的富馬酸二甲酯和叔丁基氫醌阻抑多巴胺和過氧化氫所致的細(xì)胞死亡(J.Biol Chem. 277,388-94(2002) ;J Neurochem. 71,69-77(1998) ；Neurosci Lett. ；273，109-12 (1999))。本文揭示的所有基因、基因名稱和基因產(chǎn)物，旨在與來源于本文揭示的組合物和方法可適用的任何物種的同源物相對(duì)應(yīng)。因此，術(shù)語包括但不限于來自人和小鼠的基因和基因產(chǎn)物。應(yīng)該理解，除非在其出現(xiàn)的上下文中明確指出，否則當(dāng)揭示來自特定物種的基因或基因產(chǎn)物時(shí)，該揭示僅旨在作為示例，不能解釋為限制。因此，例如對(duì)于本文揭示的基因， 其在某些實(shí)施方案中涉及哺乳動(dòng)物核酸和氨基酸序列，旨在涵蓋來自其它動(dòng)物的同源和/ 或直系同源的基因和基因產(chǎn)物，其它動(dòng)物包括但不僅限于其它哺乳動(dòng)物、魚類、兩棲動(dòng)物、
8爬行動(dòng)物和鳥類。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述基因或核酸序列為人的。定義本文所用術(shù)語僅用于闡述特定實(shí)施方案的目的，并非旨在限制本發(fā)明。除非另外明確指出，否則本文所用單數(shù)形式旨在亦包括其復(fù)數(shù)形式。此外，就在詳述和/或權(quán)利要求中所用術(shù)語“包括”、“有”、“含有”、“具有”、“帶有”或其變體而言，這樣的術(shù)語旨在以與術(shù)語 “包含”相似的方式為包括性的。術(shù)語“約”或“大約”意即由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定的特定值的可接受的誤差范圍，其部分取決于如何測(cè)量或確定值，即測(cè)量系統(tǒng)的限制。例如，“約”根據(jù)本領(lǐng)域?qū)嵺`可意指1以內(nèi)或超過1的標(biāo)準(zhǔn)差?；蛘?，“約”可意味著給定值的高達(dá)20%、優(yōu)選高達(dá)10%、更優(yōu)選高達(dá)5%、仍優(yōu)選高達(dá)的范圍?；蛘?，特別是關(guān)于生物系統(tǒng)或過程，該術(shù)語可意味著在數(shù)值的數(shù)量級(jí)內(nèi)，優(yōu)選5倍內(nèi)，更優(yōu)選2倍內(nèi)。在本申請(qǐng)和權(quán)利要求中闡述特定值時(shí)，除非另外指出，否則應(yīng)該假定術(shù)語“約”含義是在該特定值的可接受的誤差范圍內(nèi)。本文所用術(shù)語“mRNA”意即目前已知的被靶向基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物和可闡明的任何其他轉(zhuǎn)錄物?！胺戳x寡核苷酸”或“反義化合物”指與另外的RNA或DNA (靶RNA、DNA)結(jié)合的RNA 或DNA分子。例如，如果它是RNA寡核苷酸，則它通過RNA-RNA相互作用結(jié)合另外的RNA 靶標(biāo)，并改變靶 RNA 的活性(Eguchi 等，(1991) Ann. Rev. Biochem. 60，631-652)。反義寡核苷酸可上調(diào)或下調(diào)特定多核苷酸的表達(dá)和/或功能。該定義意在包括根據(jù)治療、診斷或其它觀點(diǎn)有用的任何外源RNA或DNA分子。這樣的分子例如包括反義RNA或DNA分子、干擾 RNA(RNAi)、微小 RNA、誘殺性 RNA 分子(decoy RNA molecule)、siRNA、酶 RNA、治療性編輯 RNA (therapeutic editing RNA)以及激動(dòng)RNA和拮抗RNA、反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部指導(dǎo)序列(EGS)寡核苷酸、可變剪接體(alternate splicer)、引物、探針及其它與靶核酸的至少一部分雜交的寡聚化合物。同樣地，這些化合物可以單鏈、雙鏈、部分單鏈或環(huán)狀寡聚化合物的形式引入。在本發(fā)明上下文中，術(shù)語“寡核苷酸”涉及核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA) 或其模擬物的寡聚體或多聚體。術(shù)語“寡核苷酸”還包括天然和/或修飾單體或鍵的線性或環(huán)狀寡聚體，所述天然和/或修飾單體或鍵包括脫氧核糖核苷、核糖核苷、其取代和α -異頭形式、肽核酸(PNA)、鎖定核酸(LNA)、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等。寡核苷酸能夠通過單體與單體相互作用的常規(guī)方式(例如Watson-Crick型堿基配對(duì)、Ho0gsteen型或反向 Hodgsteen型堿基配對(duì)等)特異結(jié)合靶多核苷酸。寡核苷酸可以是“嵌合的”，即由不同區(qū)(region)組成。在本發(fā)明上下文中，“嵌合”化合物為包含兩個(gè)以上化學(xué)區(qū)(例如DNA區(qū)、RNA區(qū)、PNA區(qū)等)的寡核苷酸。每個(gè)化學(xué)區(qū)由至少一個(gè)單體單元(換言之，在寡核苷酸化合物情況下為核苷酸)組成。這些寡核苷酸一般包括至少一個(gè)區(qū)，其中寡核苷酸被修飾以表現(xiàn)一種或多種所需性質(zhì)。寡核苷酸的所需性質(zhì)包括但不限于，例如提高的核酸酶降解抗性、提高的細(xì)胞吸收和/或提高的靶核酸結(jié)合親和力。因此，寡核苷酸的不同區(qū)可具有不同性質(zhì)。本發(fā)明的嵌合寡核苷酸可形成為兩種以上上述寡核苷酸、修飾寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸類似物的混合結(jié)構(gòu)。寡核苷酸可由區(qū)組成，區(qū)可以“登記簿(register) ”方式連接(即如同天然DNA中那樣單體連續(xù)連接時(shí))或通過間隔物連接。間隔物是用來在區(qū)之間構(gòu)成共價(jià)“橋”，在優(yōu)選情況下長(zhǎng)度不超過約100個(gè)碳原子。間隔物可帶有不同功能，例如具有正電荷或負(fù)電荷、帶有特定的核酸結(jié)合性質(zhì)(嵌入劑、溝結(jié)合劑、毒素、熒光團(tuán)等)、是親脂性的、誘導(dǎo)特定二級(jí)結(jié)構(gòu)，例如產(chǎn)生α-螺旋的含丙氨酸的肽。本文所用“NRF2”和“核因子(紅細(xì)胞衍生2)-樣2”包括所有家族成員、突變體、 等位基因、片段、種類(species)、編碼和非編碼序列、有義和反義多核苷酸鏈等。本文所用詞語“核因子(紅細(xì)胞衍生2)-樣2”、核因子紅細(xì)胞2-相關(guān)因子2、NFE2 相關(guān)因子2、NF-E2相關(guān)因子2、HEBP1、NRF2、Nrf 2、NFE2L2，可以在本申請(qǐng)中互換使用。本文所用術(shù)語“對(duì)…特異的寡核苷酸”或“靶向…的寡核苷酸”是指具有下述序列的寡核苷酸該序列(i)能夠與靶基因的一部分形成穩(wěn)定復(fù)合體，或(ii)能夠與靶基因的 mRNA轉(zhuǎn)錄物的一部分形成穩(wěn)定雙鏈體。復(fù)合體和雙鏈體的穩(wěn)定性可通過理論計(jì)算和/或體外測(cè)定來確定。用于測(cè)定雜交復(fù)合體和雙鏈體穩(wěn)定性的示例性測(cè)定參見下文實(shí)施例。本文所用術(shù)語“靶核酸”包括DNA、轉(zhuǎn)錄自這種DNA的RNA (包括前mRNA和mRNA) 以及來源于這種RNA的cDNA、編碼序列、非編碼序列、有義或反義多核苷酸。寡聚化合物與其靶核酸的特異性雜交干擾該核酸的正常功能。這種由與靶核酸特異性雜交的化合物對(duì)靶核酸功能的調(diào)節(jié)通常稱為“反義”。被干擾的DNA功能例如包括復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。被干擾的RNA 功能包括所有生命機(jī)能，例如RNA轉(zhuǎn)運(yùn)到蛋白質(zhì)翻譯位點(diǎn)、由RNA翻譯蛋白質(zhì)、剪接RNA產(chǎn)生一種或多種mRNA和RNA可能參與或促進(jìn)的催化活性。這種對(duì)靶核酸干擾的總體影響是調(diào)節(jié)編碼產(chǎn)物或寡核苷酸的表達(dá)。RNA干擾“RNAi ”由與它們的“靶”核酸序列具有序列特異同源性的雙鏈 RNA(dsRNA)分子的介導(dǎo)(Caplen，N. J.等 Q001) Proc. Natl. Acad. ki. USA 98: 9742-9747)。在本發(fā)明某些實(shí)施方案中，介體是5_25個(gè)核苷酸的“小干擾” RNA雙鏈體 (siRNA)。siRNA來源于稱為切酶的 RNA 酶對(duì) dsRNA 的加工(Bernstein，E.等 Q001)Nature 409 :363-366)。siRNA雙鏈體產(chǎn)物被募集到稱為RISC(RNA誘導(dǎo)性沉默復(fù)合體)的多蛋白siRNA復(fù)合體中。在不希望受任何具體理論約束的情況下，認(rèn)為RISC被引導(dǎo)至靶核酸 (適宜地為mRNA)，在此處siRNA雙鏈體以序列特異性方式相互作用以介導(dǎo)催化方式的切割(Bernstein, Ε.等(2001)Nature 409 :363-366 ；Boutla, Α.等(2001)Curr. Biol. 11 1776-1780)?？梢罁?jù)本發(fā)明使用的小干擾RNA可依據(jù)本領(lǐng)域公知并為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的步驟合成和使用。用于本發(fā)明方法的小干擾RNA適宜地包含約1-約50個(gè)核苷酸 (nt)。在非限制性實(shí)施方案的實(shí)例中，siRNA可包含約5-約40個(gè)nt、約5-約30個(gè)nt、約 10-約30個(gè)nt、約15-約25個(gè)nt或約20-25個(gè)核苷酸。通過使用自動(dòng)比對(duì)核酸序列并指明同一性或同源性區(qū)的計(jì)算機(jī)程序，輔助選擇適當(dāng)?shù)墓押塑账帷＿@樣的程序用于比較例如通過檢索數(shù)據(jù)庫(kù)(例如GenBank)或通過對(duì)PCR 產(chǎn)物測(cè)序所得核酸序列。比較一系列物種的核酸序列使得能夠選擇在物種間表現(xiàn)適當(dāng)?shù)耐恍猿潭鹊暮怂嵝蛄小Ｔ谖礈y(cè)序基因的情況下，進(jìn)行DNA印跡以使得能夠測(cè)定靶物種和其他物種間基因的同一性程度。通過在不同嚴(yán)格程度下進(jìn)行DNA印跡，如本領(lǐng)域公知的，可獲得同一性的近似測(cè)量。這些步驟使得能夠選擇這樣的寡核苷酸其表現(xiàn)出與對(duì)照受試者的靶核酸序列的高度互補(bǔ)性，和與其它物種的對(duì)應(yīng)核酸序列的低度互補(bǔ)性。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，在選擇用于本發(fā)明的適當(dāng)基因區(qū)方面存在相當(dāng)大的自由。“酶 RNA，，是指帶有酶促活性的 RNA 分子(Cech, (1988) J. American. Med.Assoc. 260, 3030-3035)。酶核酸(核酶)通過首先結(jié)合靶RNA而作用。這種結(jié)合通過酶核酸的靶結(jié)合部分發(fā)生，該靶結(jié)合部分被保持與該分子的酶促部分十分靠近，該酶促部分起切割靶RNA的作用。因此，酶核酸首先識(shí)別并接著通過堿基配對(duì)結(jié)合靶RNA，一旦結(jié)合到正確位點(diǎn)，則酶促作用以切割靶RNA。“誘殺性RNA”是指模擬配體的天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域的RNA分子。因此，誘殺性RNA與天然結(jié)合靶標(biāo)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合特定配體。例如，已表明，HIV反式激活應(yīng)答(TAR) RNA過表達(dá)可作為 “誘餌”，并有效結(jié)合HIV tat蛋白，從而防止其結(jié)合HIV RNA中編碼的TAR序列(Sullenger 等(1990)Cell，63，601-608)。這意指特定實(shí)例。本領(lǐng)域人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，這僅是一個(gè)實(shí)例，利用本領(lǐng)域公知的技術(shù)可容易地產(chǎn)生其它實(shí)施方案。本文所用術(shù)語“單體”一般是指通過磷酸二酯鍵或其類似物連接以形成大小從幾個(gè)單體單元(例如約3-4個(gè))到約數(shù)百個(gè)單體單元的寡核苷酸的單體。磷酸二酯鍵類似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、氨基磷酸酯等，如下文更詳細(xì)說明。術(shù)語“核苷酸”包括天然存在核苷酸及非天然存在核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，許多先前被認(rèn)為“非天然存在”的核苷酸后來已在自然界中發(fā)現(xiàn)。因此，“核苷酸”不僅包括已知含有嘌呤和嘧啶雜環(huán)的分子，而且包括其雜環(huán)類似物和互變異構(gòu)體。其它類型核苷酸的說明性實(shí)例為含以下結(jié)構(gòu)的分子腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、 黃嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧-N6-甲基腺嘌呤、7-脫氮黃嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、N4，N4-亞乙基胞嘧啶、N6，N6-亞乙基-2，6- 二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5- (C3-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假異胞嘧啶(pseudoisocytosine)、2_羥基-5-甲基_4_三唑并嘧啶、異胞嘧啶(isocytosine)、異鳥嘌呤(isoguanin)、肌苷以及Benner等，美國(guó)專利號(hào)5，432，272 中所述的“非天然存在”核苷酸。術(shù)語“核苷酸”意在包括這些實(shí)例及其類似物和互變異構(gòu)體的每一個(gè)和全部。尤其令人感興趣的核苷酸是含有腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶的核苷酸，它們被認(rèn)為是與人的治療和診斷應(yīng)用有關(guān)的天然存在核苷酸。核苷酸包含天然2'-脫氧和2'-羥基糖(例如Kornberg和Baker，DNA R印lication，第二版 (Freeman, San Francisco, 1992)所述)以及它們的類似物。核苷酸的“類似物”包括具有修飾堿基部分和/或修飾糖部分的合成核苷酸(參見例如通常以下文獻(xiàn)所述Scheit，Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980 ； Freier 禾口 Altmann，(1997) Nucl. Acid. Res.，25 (22)，4429-4443，Toulme, J. J.，(2001) Nature Biotechnology 19 :17-18 ；Manoharan Μ. , (1999)Biochemica et Biophysica Acta 1489 :117-139 ；Freier S.Μ·，(1997)Nucleic Acid Research,25 :4429-4443, UhIman, Ε. , (2000)Drug DiscoveiTfeDevelopmentjSiZOS-ZlSjHerdewin P. , (2000) Antisense&Nucleic Acid Drug Dev.，10 :297-310) ；2' _0、3:C連接的[3. 2. 0] 二環(huán)阿糖核苷(參見例如 N. K Christiensen.等，(1998) J. Am. Chem. Soc.，120 :5458-5463 ；Prakash TP, Bhat B. (2007) Curr Top Med Chem. 7 (7) :641-9 ；Cho EJ 等 U009) Annual Review of Analytical Chemistry，2，MH64)。這樣的類似物包括設(shè)計(jì)成增強(qiáng)結(jié)合性質(zhì)(例如雙鏈體或三鏈體穩(wěn)定性、特異性等)的合成核苷酸。本文所用術(shù)語“雜交”是指寡聚化合物的大致互補(bǔ)鏈的配對(duì)。配對(duì)機(jī)制之一涉及寡聚化合物鏈的互補(bǔ)核苷或核苷酸堿基(核苷酸)之間的氫鍵作用，例如Watson-Crick、Ho0gsteen或反向Ho0gsteen型氫鍵作用。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是互補(bǔ)核苷酸，其通過形成氫鍵成對(duì)。雜交可在不同環(huán)境中發(fā)生。當(dāng)反義化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能以產(chǎn)生功能和/或活性的調(diào)節(jié)，并存在足夠程度的互補(bǔ)性以避免在需要特異性結(jié)合的條件下(即在體內(nèi)測(cè)定或治療性治療情況中的生理?xiàng)l件和體外測(cè)定情況中進(jìn)行測(cè)定的條件下)該反義化合物非特異性結(jié)合非靶核酸序列時(shí)，反義化合物是“可特異性雜交的”。本文所用短語“嚴(yán)格雜交條件”或“嚴(yán)格條件，，是指在這樣的條件除了最低限度的其它序列外，本發(fā)明化合物在該條件下將與其靶序列雜交。嚴(yán)格條件是序列依賴性的且在不同環(huán)境中不同，在本發(fā)明上下文中，寡聚化合物與靶序列雜交的“嚴(yán)格條件”由寡聚化合物性質(zhì)和組成以及研究它們的測(cè)定確定。通常，嚴(yán)格雜交條件包括低濃度(<0. 15M)的含無機(jī)陽離子如Na++或K++的鹽(低離子強(qiáng)度)、高于20°C-25°C且低于寡聚化合物靶序列復(fù)合體Tm的溫度和存在變性劑，例如甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜或去污劑十二烷基硫酸鈉(SDS)。例如，對(duì)于每的甲酰胺，雜交率降低1. 1%。高度嚴(yán)格雜交條件的實(shí)例是0. IX氯化鈉-檸檬酸鈉緩沖液(SSC) /0. 1 % (w/v) SDS中在60°C下維持30分鐘。本文所用“互補(bǔ)的”是指在一條或兩條寡聚鏈上的兩個(gè)核苷酸之間精確配對(duì)的能力。例如，如果反義化合物某位置上的核堿基(nucleobase)能夠與靶核酸(所述靶核酸是 DNA、RNA或寡核苷酸分子)某位置上的核堿基發(fā)生氫鍵作用，那么認(rèn)為寡核苷酸和靶核酸之間的氫鍵作用位置是互補(bǔ)位置。當(dāng)每個(gè)分子中足夠數(shù)量的互補(bǔ)位置被可相互發(fā)生氫鍵作用的核苷酸占據(jù)時(shí)，寡聚化合物和其它DNA、RNA或寡核苷酸分子相互互補(bǔ)。因此，“可特異性雜交的”和“互補(bǔ)的”兩個(gè)術(shù)語用來表明在足夠數(shù)量的核苷酸內(nèi)足以使寡聚化合物和靶核酸之間發(fā)生穩(wěn)定的特異性結(jié)合的精確配對(duì)程度或互補(bǔ)性。本領(lǐng)域理解，寡聚化合物序列不需要與其可特異性雜交的靶核酸序列100%互補(bǔ)。 此外，寡核苷酸可越過一個(gè)或多個(gè)區(qū)段雜交，使得間插或相鄰區(qū)段不參與雜交事件(例如環(huán)狀結(jié)構(gòu)、錯(cuò)配或發(fā)夾結(jié)構(gòu))。本發(fā)明寡聚化合物與它們靶向的靶核酸序列中的靶區(qū)具有至少約70%、或至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%、 或至少約99%的序列互補(bǔ)性。例如，反義化合物中18/20的核苷酸與靶區(qū)互補(bǔ)并因此特異性雜交，則該反義化合物表現(xiàn)90%的互補(bǔ)性。在該實(shí)例中，剩余的非互補(bǔ)核苷酸可成簇或散布在互補(bǔ)核苷酸之間，不必彼此鄰接或與互補(bǔ)核苷酸鄰接。同樣地，長(zhǎng)度為18個(gè)核苷酸且具有在兩側(cè)為兩個(gè)與靶核酸具有完全互補(bǔ)性的區(qū)的4(四)個(gè)非互補(bǔ)核苷酸的反義化合物與靶核酸具有77. 8%的總體互補(bǔ)性，并因此落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。反義化合物與靶核酸的區(qū)的互補(bǔ)性百分比可利用本領(lǐng)域已知的BLAST程序(基礎(chǔ)局部比對(duì)檢索工具(basic local alignment search tools))和 PowerBLAST 程序按常規(guī)測(cè)定(Altschul 等，(1990) J. Mol. Biol.，215，403-410 ；Zhang 和 Madden，(1997) Genome Res.，7，649-656)。同源性、序列同一性或互補(bǔ)性百分比可通過例如Gap程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Unix版本第 8 版，Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis)使用默認(rèn)設(shè)置測(cè)定，該程序利用 Smith 和 Waterman 的算法(Adv. App 1. Math.，(1981) 2，482-489)。本文所用術(shù)語“熱解鏈溫度(Tm) ”是指這樣的溫度在規(guī)定的離子強(qiáng)度、PH和核酸濃度下，與靶序列互補(bǔ)的寡核苷酸有50%與靶序列雜交達(dá)到平衡的溫度。一般地，嚴(yán)格條件是指這樣的條件其中鹽濃度在PH 7. 0-8. 3下為至少約0. 01-1. OM Na離子濃度(或其它
12鹽)，溫度對(duì)于短寡核苷酸(例如10-50個(gè)核苷酸)為至少約30°C。嚴(yán)格條件也可以加入去穩(wěn)定劑例如甲酰胺的方式實(shí)現(xiàn)。本文所用“調(diào)節(jié)”是指提高(刺激)或降低(抑制)基因的表達(dá)。術(shù)語“變體”，當(dāng)在多核苷酸序列情況中使用時(shí)，可包括與野生型基因有關(guān)的多核苷酸序列。該定義也可包括例如“等位”變體、“剪接”變體、“物種”變體或“多態(tài)”變體。剪接變體可與參比分子具有顯著同一性，但通常由于mRNA加工過程中外顯子的可變剪接而具有更多或更少量的多核苷酸。相應(yīng)多肽可具有另外的功能域或不存在結(jié)構(gòu)域。物種變體是指物種間相互不同的多核苷酸序列。本發(fā)明特別利用了野生型基因產(chǎn)物的變體。變體可產(chǎn)生自核酸序列中的至少一個(gè)突變，并可導(dǎo)致產(chǎn)生改變的mRNA或其結(jié)構(gòu)或功能可能改變或可能不改變的多肽。任何給定的天然或重組基因可具有0、1或多個(gè)等位形式。產(chǎn)生變體的常見突變一般歸因于核苷酸的天然缺失、插入或取代。這些種類變化的每一種可在給定序列中單獨(dú)發(fā)生或與其它變化聯(lián)合發(fā)生一次或多次。所得多肽通常相互之間具有顯著的氨基酸同一性。多態(tài)變體是給定物種的個(gè)體之間特定基因的多核苷酸序列的變異。多態(tài)變體還可包括“單核苷酸多態(tài)性”(SNP)或單個(gè)堿基突變，其中多核苷酸序列因一個(gè)堿基而不同。SNP的存在可表明例如某群體對(duì)疾病狀態(tài)的傾向，即易感性對(duì)耐受性。衍生多核苷酸包括經(jīng)過化學(xué)修飾的核酸，例如將氫置換為烷基、?；虬被?。衍生物例如衍生寡核苷酸可包括非天然存在部分，例如改變的糖部分或糖間鍵。這其中的實(shí)例是硫代磷酸酯和本領(lǐng)域已知的其它含硫種類。衍生核酸還可包含標(biāo)簽，包括放射性核苷酸、 酶、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、顯色劑、底物、輔助因子、抑制劑、磁性顆粒等?！把苌倍嚯幕螂慕?jīng)過修飾，例如通過糖基化、聚乙二醇化、磷酸化、硫酸化、還原/ 烷化、?；?、化學(xué)偶聯(lián)或溫和甲醛處理。衍生物也可被修飾，以含有可直接或間接檢測(cè)的標(biāo)簽，包括但不限于放射性同位素、熒光標(biāo)簽和酶標(biāo)簽。本文所用術(shù)語“動(dòng)物”或“患者”意在包括例如人、綿羊、麋鹿、鹿、長(zhǎng)耳鹿、貂、哺乳動(dòng)物、猴子、馬、牛、豬、山羊、狗、貓、大鼠、小鼠、鳥類、雞、爬行動(dòng)物、魚類、昆蟲和蜘蛛類?！安溉閯?dòng)物”涵蓋一般處在醫(yī)療護(hù)理下的溫血哺乳動(dòng)物(例如人和馴化動(dòng)物)。實(shí)例包括貓、犬、馬、牛和人，以及僅人。“治療”涵蓋治療哺乳動(dòng)物的疾病狀態(tài)，包括(a)預(yù)防該疾病狀態(tài)在哺乳動(dòng)物中發(fā)生，尤其是在該哺乳動(dòng)物易感染該疾病狀態(tài)但尚未被確診為患有它時(shí)；(b)抑制該疾病狀態(tài)，例如抑制其進(jìn)展；和/或(c)減輕該疾病狀態(tài)，例如引起該疾病狀態(tài)消退直到達(dá)到所需終點(diǎn)。治療還包括改善疾病的癥狀(例如減少疼痛或不適)，其中這種改善可或不可直接影響該疾病(例如病因、傳播、表達(dá)等)。本文所用術(shù)語“癌癥”指任何惡性腫瘤，特別是在肺、腎或甲狀腺中產(chǎn)生的惡性腫瘤。癌癥本身表現(xiàn)為“腫瘤”或含有惡性癌癥細(xì)胞的組織。腫瘤實(shí)例包括肉瘤和癌，例如但不限于纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝瘤、膽管癌、絨膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎癌、腎母細(xì)胞瘤、宮頸癌、睪丸瘤、肺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠
13質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、黑素瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤。本文所用術(shù)語“癌癥”、“瘤”和“腫瘤”互換使用，無論是單數(shù)或復(fù)數(shù)形式，都指發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化使其相對(duì)宿主機(jī)體為病理學(xué)的細(xì)胞?？赏ㄟ^非常確實(shí)的技術(shù)特別是組織學(xué)檢查，容易地將原發(fā)癌細(xì)胞(即自惡性轉(zhuǎn)化位點(diǎn)附近獲得的細(xì)胞)與非癌細(xì)胞區(qū)別開。本文所用的癌細(xì)胞定義，不僅包括原發(fā)癌細(xì)胞，而且包括來源于原發(fā)癌細(xì)胞祖先的任何細(xì)胞。這包括轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞、體外培養(yǎng)物和癌癥細(xì)胞衍生的細(xì)胞系。當(dāng)提及通常表現(xiàn)為實(shí)體瘤的癌癥類型時(shí)，“臨床可檢測(cè)的”腫瘤是指可基于腫瘤塊檢測(cè)的腫瘤；例如通過諸如CAT掃描、MR成像、X射線、超聲波或觸診等方法，和/或因一種或多種癌癥特異抗原在獲自患者的樣品中表達(dá)而可檢測(cè)。
“神經(jīng)學(xué)疾病或障礙”指神經(jīng)系統(tǒng)和/或視覺系統(tǒng)的任何疾病或障礙?！吧窠?jīng)系統(tǒng)疾病或障礙”包括涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)(大腦、腦干和小腦)、周圍神經(jīng)系統(tǒng)(包括顱神經(jīng)) 和植物神經(jīng)系統(tǒng)(其部分位于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)二者中)的疾病或障礙。神經(jīng)系統(tǒng)疾病或障礙包括但不限于獲得性癲癇樣失語；急性播散性腦脊髓炎；腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良； 年齡相關(guān)性黃斑變性；胼胝體發(fā)育不全；失認(rèn)癥；艾卡迪綜合征；亞力山大??；阿爾珀斯??； 交替性癱瘓；阿爾次海默病；血管性癡呆；肌萎縮性側(cè)索硬化癥；無腦畸形；Angelman綜合征；血管瘤病；缺氧癥；失語癥；失用癥；蛛網(wǎng)膜囊腫；蛛網(wǎng)膜炎；阿-?；危粍?dòng)靜脈畸形；Asperger綜合癥；毛細(xì)血管擴(kuò)張性失調(diào)(ataxia telegiectasia)；注意力不集中的過度反應(yīng)癥；孤獨(dú)癥；植物神經(jīng)功能紊亂(autonomic dysfunction)；背疼痛；巴騰??；貝切特病；面神經(jīng)麻痹；良性自發(fā)性瞼痙攣；良性焦距協(xié)調(diào)(focal)；肌萎縮；良性顱內(nèi)高血壓； 賓斯旺格病；眼瞼痙攣；Bloch Sulzberger綜合征；臂叢神經(jīng)損傷；腦膿腫；腦損傷；腦腫瘤(包括多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)；脊柱腫瘤；Brown-Sequard綜合征；卡納萬?。煌蠊芫C合癥；灼性神經(jīng)痛；中樞性疼痛綜合征；腦橋中央髓鞘溶解；頭部障礙(cephalic disorder)； 腦動(dòng)脈瘤；腦動(dòng)脈硬化；腦萎縮；大腦性巨人癥；大腦性癱瘓；夏-馬-圖??；化療引起的神經(jīng)病變及神經(jīng)性疼痛；Chiari畸形；舞蹈??；慢性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病；慢性疼痛；慢性區(qū)域疼痛綜合征；科-勒綜合征；昏迷，包括持續(xù)性植物狀態(tài)；先天性雙側(cè)面癱； 皮質(zhì)基底節(jié)變性；顱動(dòng)脈炎；顱縫早閉；克-雅?。焕鄯e性創(chuàng)傷障礙；庫(kù)欣綜合征；巨細(xì)胞包涵體??；巨細(xì)胞病毒感染；舞蹈眼-舞蹈腳綜合征；丹-沃綜合征；Dawson病；德摩西埃綜合征；Dejerine-Klumke麻痹；癡呆；皮肌炎；糖尿病性神經(jīng)病變；彌漫性硬化；自主神經(jīng)功能異常；書寫困難；誦讀困難；張力失常；早期幼兒癲癇性腦?。豢盏熬C合征；腦炎；腦膨出；腦三叉神經(jīng)血管瘤病；癲癇；歐勃麻痹；特發(fā)性震顫；法布里?。环柧C合征； 昏厥；家族性痙攣性癱瘓；熱性癲癇發(fā)作；費(fèi)希爾綜合征；弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)；額顳癡呆和其它“Tau病變”；高歇??；格斯特曼綜合征；巨細(xì)胞動(dòng)脈炎；巨細(xì)胞包涵體??；球形細(xì)胞腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良；格-巴綜合征；HTLV-I相關(guān)脊髓??；哈-斯病；頭部外傷；頭痛；偏側(cè)面肌痙攣；遺傳性痙攣性截癱；多神經(jīng)炎型遺傳性共濟(jì)失調(diào)；耳部帶狀皰疹(herpes zoster oticus)；帶狀皰疹；Hirayama綜合征；HIV相關(guān)癡呆和神經(jīng)病(亦為AIDS的神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn))；前腦無裂畸形；亨廷頓舞蹈病和其它多谷氨酰胺重復(fù)疾??；積水性無腦畸形；腦積水；皮質(zhì)醇增多癥；低氧；免疫介導(dǎo)的腦脊髓炎；包涵體肌炎；色素失調(diào)癥；嬰兒植烷酸貯積病；嬰兒雷夫敘姆病；嬰兒痙攣癥；炎性肌??；顱內(nèi)囊腫；顱內(nèi)高血壓Joubert綜合征； Keams-Sayre綜合征；Kennedy?。籏insboume綜合征；克-費(fèi)綜合征；克拉伯??；庫(kù)_韋??；庫(kù)魯??；拉福拉病；朗-愛肌無力綜合征；Landau-Kleffner綜合征；側(cè)髓(瓦倫伯格)綜合征；學(xué)習(xí)不能；利氏??；Lermox-Gustaut綜合征；累-奈綜合征；腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良；Lewy 體癡呆；無腦回；閉鎖綜合征；Lou Gehrig病(即運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病或肌萎縮性側(cè)索硬化癥)； 腰椎間盤突出病(lumbar disc disease)；萊姆病一神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥；Machado-Jos印h 病；巨腦(macrencephaly)；巨腦(megalencephaly)；梅-羅綜合征；Menieres 病；腦膜炎；門克斯病；異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良；小頭畸形；偏頭痛；Miller Fisher綜合征；小中風(fēng)(mini-stroke)；線粒體肌??；默比厄斯綜合征；單肢肌萎縮；運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病；腦底異常血管網(wǎng)??；粘多糖貯積癥；多發(fā)梗塞性癡呆；多灶性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病；多發(fā)性硬化癥和其它脫髓鞘性障礙；多系統(tǒng)萎縮伴隨體位性低血壓；肌營(yíng)養(yǎng)不良；重癥肌無力；髓鞘破壞性 (myelinoclastic)彌漫性硬化癥；嬰兒肌陣攣性腦??；肌陣攣；肌??；先天性肌強(qiáng)直；發(fā)作性睡?。簧窠?jīng)纖維瘤??；抗精神病藥惡性綜合征；AIDS的神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)；神經(jīng)后遺癥狼瘡(oflupus)；神經(jīng)性肌強(qiáng)直；神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥；神經(jīng)細(xì)胞遷移障礙；尼-皮?。?O' Sullivan-McLeod綜合征；枕神經(jīng)痛；隱性脊柱神經(jīng)管閉合不全序列征；Ohtahara綜合征；橄欖體腦橋小腦萎縮；視性眼肌陣痙攣；視神經(jīng)炎；直立性低血壓；過度使用綜合征； 感覺異常；神經(jīng)退行性疾病或障礙(帕金森病、亨廷頓舞蹈病、阿爾茨海默病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)、癡呆、多發(fā)性硬化癥和其它與神經(jīng)元細(xì)胞死亡有關(guān)的疾病與障礙)；先天性副肌強(qiáng)直；類腫瘤性疾??；陣發(fā)性發(fā)作(paroxysmal attack)；帕-羅綜合征；佩-梅病； 周期性麻痹；周圍神經(jīng)病變；痛性神經(jīng)病變和神經(jīng)性疼痛；持續(xù)性植物狀態(tài)；全身性發(fā)育遲緩；感光性噴嚏反射；植烷酸貯積病；皮克病；神經(jīng)挾捏(pinched nerve)；垂體瘤；多發(fā)性肌炎；腦穿通畸形；脊髓灰質(zhì)炎后綜合征；皰疹后神經(jīng)痛；感染后腦脊髓炎；體位性低血壓； 普-韋綜合征；原發(fā)性側(cè)索硬化癥；朊病毒?。贿M(jìn)行性偏側(cè)面肌萎縮；進(jìn)行性多灶性白質(zhì)腦??；進(jìn)行性硬化灰質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良；進(jìn)行性核上性麻痹；腦假瘤；拉姆齊-亨特綜合癥(I型和 11型)；Rasmussen腦炎；反射性交感神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)不良綜合征；雷夫敘姆?。恢貜?fù)性動(dòng)作障礙； 重復(fù)性應(yīng)激損傷；下肢不寧綜合征；逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)的脊髓?。焕滋鼐C合征；雷耶綜合征； 舞蹈??；山德霍夫病；謝爾德病；腦裂畸形；隔光發(fā)育不良(s印to-optic dysplasia)；驚嚇?gòu)雰壕C合癥；帶狀皰疹；希-德綜合征；斯耶格倫綜合征；睡眠呼吸暫停；索托斯綜合征； 痙攣；脊柱裂；脊髓損傷；脊髓腫瘤；脊髓性肌萎縮；Stiff-Person綜合征；中風(fēng)；斯-韋綜合征；亞急性硬化性全腦炎；皮層下動(dòng)脈硬化性腦??；西德納姆舞蹈??；暈厥；脊髓空洞癥； 遲發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙；泰-薩病；顳動(dòng)脈炎；脊髓栓系綜合征；湯姆森(Thomsen)??；胸出口綜合征；三叉神經(jīng)痛；Todd麻痹；圖雷特綜合征；短暫性腦缺血發(fā)作；傳染性海綿狀腦?。粰M斷性脊髓炎；外傷性腦損傷；震顫；三叉神經(jīng)痛；熱帶痙攣性截癱；結(jié)節(jié)性硬化癥；血管性癡呆(多發(fā)梗塞性癡呆)；血管炎，包括顳動(dòng)脈炎；希-林??；瓦倫伯格綜合征；韋-霍?。豁f斯特綜合征；頸部扭傷(whiplash)；威廉斯綜合征；Wildon病和澤爾韋格綜合征。多核苷酸和寡核苷酸的組合物和分子靶標(biāo)在一個(gè)實(shí)施方案中，靶標(biāo)包含核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2 (NRM)的核酸序列，包括但不限于與NRF2相關(guān)的有義和/或反義非編碼和/或編碼序列。轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2 (NRF2)屬于堿性區(qū)-亮氨酸拉鏈家族，其響應(yīng)親電體和活性氧物質(zhì)而被激活。NRF2協(xié)同調(diào)節(jié)參與藥物代謝、解毒和抗氧化劑防御的一系列基因的組成型和誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄。在氧化應(yīng)激期間，將NRF2從隔絕中釋放到細(xì)胞質(zhì)中，并轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中。NRF2在靶基因的調(diào)節(jié)區(qū)中與抗氧化劑應(yīng)答元件(ARE)結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄。慢性阻塞性肺病(COPD)是沒有有效療法的主要公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)，包括因長(zhǎng)時(shí)間暴露于香煙煙霧(⑶)而導(dǎo)致的肺氣腫和慢性支氣管炎。肺氣腫亦與肺高血壓有關(guān)，肺高血壓可進(jìn)展為右心室衰竭，這是在COPD患者中發(fā)病率和死亡率的重要原因。最近，業(yè)已顯示晚期COPD患者肺中Nrf2途徑表達(dá)下降，表明該抗氧化保護(hù)性應(yīng)答的喪失是肺氣腫病理生理學(xué)進(jìn)展中的關(guān)鍵因素。此外，小鼠中Nrf2的遺傳性破壞導(dǎo)致早期發(fā)作和嚴(yán)重肺氣腫。肝臟經(jīng)常暴露于各種損傷，包括有毒化學(xué)品和酒精、病毒感染或代謝超負(fù)荷。雖然其可在急性損傷后完全再生，但長(zhǎng)期肝損傷導(dǎo)致肝纖維化和肝硬化，這可導(dǎo)致肝功能完全衰竭。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用反義寡核苷酸來預(yù)防或治療與異常的核因子(紅細(xì)胞衍生 2)-樣2 (NRM)表達(dá)和/或功能相關(guān)的疾病或障礙。這包括所有形式的核因子(紅細(xì)胞衍生2)-樣2 (NRM)分子，包括突變體和正?；虍惓：艘蜃?紅細(xì)胞衍生幻-樣2(NRF2)分子的異常表達(dá)或功能。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)保護(hù)肝臟免受急性和慢性毒素介導(dǎo)的損傷。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，上調(diào)或激活Nrf2預(yù)防或改善毒素誘導(dǎo)的肝損傷和肝纖維化。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，NF-E2-相關(guān)因子2(Nrf2)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)預(yù)防或治療患者的胃腸道疾病或障礙。腦腫瘤與癌基因和抑癌基因的遺傳改變相關(guān)。細(xì)胞中活性氧物質(zhì)(ROS)的積累引起氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的損傷，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。核因子紅細(xì)胞2-相關(guān)因子2 (NrH)是氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子，其上調(diào)構(gòu)成針對(duì)氧化應(yīng)激的防御系統(tǒng)的一組抗氧化基因和細(xì)胞保護(hù)酶。該多核苷酸的調(diào)節(jié)在治療與氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病或障礙中是重要的?？捎脧挠梅戳x化合物獲得的干細(xì)胞再生的細(xì)胞/組織治療的例示性核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2 (NRM)介導(dǎo)的疾病和障礙(其)包括慢性阻塞性肺病(COPD)、多發(fā)性硬化癥、肝病或障礙、胃腸道疾病或障礙、糖尿病、自身免疫性疾病、免疫相關(guān)性疾病或障礙、免疫缺陷(例如AIDQ、神經(jīng)學(xué)疾病或障礙、神經(jīng)退行性疾病或障礙、 與氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病或障礙或病癥、眼病(例如年齡相關(guān)性黃斑變性、白內(nèi)障、輕度視網(wǎng)膜病(light retinopathy)、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病(retinopathy of prematurity)等)、皮膚病、 哮喘、動(dòng)脈硬化、慢性炎性疾病或病癥(例如血管炎、肺支氣管炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、肝炎、胰腺炎、皮炎、食管炎、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、結(jié)膜炎等)、神經(jīng)修復(fù)和麻痹、神經(jīng)內(nèi)分泌分化、炎癥、肌肉疾病或障礙、與感染性生物相關(guān)的疾病或障礙、老年斑、腦淀粉樣血管病(cerebral amyloid angiopathy)、動(dòng)脈粥樣硬化、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、淀粉樣蛋白沉積、 神經(jīng)纖維纏結(jié)、癡呆、絨膜癌、星形細(xì)胞瘤、淀粉樣變性病、高脂血癥、瘤性轉(zhuǎn)化、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、動(dòng)脈粥樣硬化阻塞、轉(zhuǎn)移、心肌梗死、肺纖維化、壞死、休克、黑素瘤、結(jié)直腸癌、遺傳易感性、牛皮癬、與異常細(xì)胞增殖相關(guān)的疾病或障礙(例如癌癥、牛皮癬等)、癌癥(例如前列腺癌、肺癌、乳腺癌、非小細(xì)胞性肺癌(NSCLC)、白血病等)、炎癥、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、癌、神經(jīng)病理學(xué)、腫瘤、血管疾病、細(xì)胞損傷、腦腫瘤、高膽固醇血癥、脂肪肉瘤、冠狀動(dòng)脈性心臟病、冠狀動(dòng)脈疾病、腎小球性腎炎、靜脈血栓形成及病理過程。
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在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸調(diào)節(jié)罹患或處于發(fā)展NRF2相關(guān)疾病或障礙的患者中的NRF2的表達(dá)和/或功能。這樣的NRF2相關(guān)疾病或障礙的實(shí)例包括阿爾茨海默病、多發(fā)性硬化癥、老年斑、腦淀粉樣血管病、動(dòng)脈粥樣硬化、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、淀粉樣蛋白沉積、神經(jīng)退行性疾病、神經(jīng)纖維纏結(jié)、癡呆、絨膜癌、星形細(xì)胞瘤、淀粉樣變性病、高脂血癥、神經(jīng)退行性疾病、瘤性轉(zhuǎn)化、前列腺癌、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、阻塞、AIDS、轉(zhuǎn)移、心肌梗死、肺纖維化、壞死、休克、黑素瘤、結(jié)直腸癌、遺傳易感性、牛皮癬、癌癥、炎癥、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、癌、乳腺癌、神經(jīng)病理學(xué)、腫瘤、前列腺癌、血管疾病、細(xì)胞損傷、腦腫瘤、非小細(xì)胞性肺癌 (NSCLC)、高膽固醇血癥、脂肪肉瘤、冠狀動(dòng)脈性心臟病、免疫缺陷、冠狀動(dòng)脈疾病、腎小球性腎炎、靜脈血栓形成、病理過程或白血病。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸對(duì)NRF2 (包括但不限于非編碼區(qū))多核苷酸特異。NRF2靶標(biāo)包括NRF2變體；NRF2突變體，包括SNP ；NRF2的非編碼序列；等位基因、片段等。優(yōu)選寡核苷酸為反義RNA分子。按照本發(fā)明實(shí)施方案，靶核酸分子不僅限于NRF2多核苷酸，而且延伸到NRF2的任何同種型、受體、同源物、非編碼區(qū)等。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸靶向NRF2靶標(biāo)的天然反義序列(對(duì)編碼區(qū)和非編碼區(qū)天然反義)，NRF2靶標(biāo)包括但不限于其變體、等位基因、同源物、突變體、衍生物、 片段和互補(bǔ)序列。優(yōu)選地，寡核苷酸是反義RNA或DNA分子。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物還包括這樣的變體其中在化合物的一個(gè)或多個(gè)核苷酸位置上存在不同堿基。例如，如果第一個(gè)核苷酸是腺嘌呤，則可產(chǎn)生在該位置含有胸苷、鳥苷、胞苷或其它天然或非天然核苷酸的變體。這可在反義化合物的任何位置上完成。然后，利用本文所述方法檢驗(yàn)這些化合物，以測(cè)定它們抑制靶核酸表達(dá)的能力。在一些實(shí)施方案中，反義化合物和靶標(biāo)之間的同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約 50%-約60%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約60% -約70%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約70% -約80%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約80% -約90%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約90%、約92%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%。當(dāng)反義化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能而引起活性喪失，并存在足夠程度的互補(bǔ)性以避免在需要特異性結(jié)合的條件下反義化合物與非靶核酸序列非特異性結(jié)合時(shí)，反義化合物是可特異性雜交的。這樣的條件包括，即體內(nèi)測(cè)定或治療性治療情況的生理?xiàng)l件和體外測(cè)定情況中進(jìn)行測(cè)定的條件。當(dāng)反義化合物與靶DNA或RNA分子的結(jié)合干擾靶DNA或RNA的正常功能而引起效用喪失，并存在足夠程度的互補(bǔ)性以避免在需要特異性結(jié)合的條件下(即在體內(nèi)測(cè)定或治療性治療情況的生理?xiàng)l件下和在體外測(cè)定情況中進(jìn)行測(cè)定的條件下)該反義化合物與非靶序列非特異性結(jié)合時(shí)，則不論該反義化合物是DNA、RNA、嵌合體、取代物等，其是可特異性雜交的。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，包括但不限于例如利用例如PCR、雜交等鑒定和擴(kuò)增的反義序列、一個(gè)或多個(gè)SEQ ID NO 3所示序列等的NRF2的靶向，調(diào)節(jié)NRF2的表達(dá)或功能。 在一個(gè)實(shí)施方案中，相比對(duì)照上調(diào)表達(dá)或功能。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，相比對(duì)照下調(diào)表達(dá)或功能。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸包含SEQ ID NO :4_6所示核酸序列，其包括例如利用PCR、雜交等鑒定和擴(kuò)增的反義序列。這些寡核苷酸可包含一個(gè)或多個(gè)修飾核苷酸、 較短片段或較長(zhǎng)片段、修飾鍵等。修飾鍵或核苷酸間鍵的實(shí)例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，核苷酸包括磷衍生物。可連接到本發(fā)明修飾寡核苷酸中的糖或糖類似物部分的磷衍生物(或修飾磷酸基)可以是單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、 烷基磷酸酯、鏈烷磷酸酯(alkanephosphate)、硫代磷酸酯等。上述磷酸酯類似物的制備和將它們整合入核苷酸、修飾核苷酸和寡核苷酸本身亦是已知的，不必在此贅述。本領(lǐng)域技術(shù)人員還為治療用途控制反義的特異性和靈敏度。在動(dòng)物和人的疾病狀態(tài)的治療中已利用反義寡核苷酸作為治療部分。已將反義寡核苷酸安全有效地給予人，多種臨床試驗(yàn)?zāi)壳罢谶M(jìn)行中。因此確立的是，寡核苷酸可以是有用的治療藥物，其可被設(shè)計(jì)用于治療細(xì)胞、組織和動(dòng)物(尤其人)的治療方案。在本發(fā)明實(shí)施方案中，寡聚反義化合物(尤其寡核苷酸)結(jié)合靶核酸分子并調(diào)節(jié)靶基因編碼分子的表達(dá)和/或功能。被干擾的DNA功能例如包括復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。被干擾的 RNA功能包括所有生命機(jī)能，例如RNA轉(zhuǎn)運(yùn)到蛋白質(zhì)翻譯位點(diǎn)、由RNA翻譯蛋白質(zhì)、剪接RNA 產(chǎn)生一種或多種mRNA和RNA可能參與或促進(jìn)的催化活性。功能可被上調(diào)或抑制，視所需功能而定。反義化合物包括反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部指導(dǎo)序列(EGQ寡核苷酸、 可變剪接體、引物、探針及其它與靶核酸的至少一部分雜交的寡聚化合物。同樣地，這些化合物可以單鏈、雙鏈、部分單鏈或環(huán)狀寡聚化合物的形式引入。在本發(fā)明上下文中，反義化合物靶向特定核酸分子可以是多步驟過程。該過程通常開始于識(shí)別待調(diào)節(jié)功能的靶核酸。該靶核酸可以是例如其表達(dá)與特定病癥或疾病狀態(tài)相關(guān)的細(xì)胞基因(或轉(zhuǎn)錄自該基因的mRNA)或來自病原體的核酸分子。在本發(fā)明中，靶核酸編碼核因子(紅細(xì)胞衍生2)-樣2 (NRF2)。靶向過程通常還包括測(cè)定靶核酸中的至少一個(gè)靶區(qū)、區(qū)段或位點(diǎn)，以發(fā)生反義相互作用使所需影響例如調(diào)節(jié)表達(dá)發(fā)生。在本發(fā)明上下文中，術(shù)語“區(qū)”定義為具有至少一種可鑒定結(jié)構(gòu)、功能或特性的靶核酸的一部分。區(qū)段在靶核酸的區(qū)中。“區(qū)段”定義為靶核酸的區(qū)的更小部分或次級(jí)部分。本發(fā)明所用“位點(diǎn)”定義為靶核酸中的位置。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合核因子(紅細(xì)胞衍生2)-樣2(NRF2) 的天然反義序列，并調(diào)節(jié)核因子(紅細(xì)胞衍生2)-樣2(NRF2) (SEQ ID NO 1)的表達(dá)和/或功能。反義序列的實(shí)例包括SEQ ID NO 3-6ο在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合核因子(紅細(xì)胞衍生2)-樣2(NRF2) 多核苷酸的一個(gè)或多個(gè)區(qū)段，并調(diào)節(jié)核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2 (NRM)的表達(dá)和/或功能。所述區(qū)段包含核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2 (NRM)的有義或反義多核苷酸的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸對(duì)核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2(NRF2) 的天然反義序列特異，其中寡核苷酸與核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2 (NRM)的天然反義序列的結(jié)合調(diào)節(jié)核因子(紅細(xì)胞衍生2)-樣2(NRF2)的表達(dá)和/或功能。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸化合物包括SEQ ID NO :4-6所示序列、利用例如PCR、雜交等鑒定和擴(kuò)增的反義序列。這些寡核苷酸可包含一個(gè)或多個(gè)修飾核苷酸、較短片段或較長(zhǎng)片段、修飾鍵等。修飾鍵或核苷酸間鍵的實(shí)例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，核苷酸包括磷衍生物?？蛇B接到本發(fā)明的修飾寡核苷酸中的糖或糖類似物部分的磷衍生物(或修飾磷酸基)可以是單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、 烷基磷酸酯、鏈烷磷酸酯(alkanephosphate)、硫代磷酸酯等。上述磷酸酯類似物的制備和將它們整合入核苷酸、修飾核苷酸和寡核苷酸本身亦是已知的，不必在此贅述。如本領(lǐng)域已知的，由于翻譯起始密碼子一般是5' -AUG(在轉(zhuǎn)錄的mRNA分子中； 在對(duì)應(yīng)的DNA分子中是5' -ATG)，故翻譯起始密碼子也稱為“AUG密碼子”、“起始密碼子” 或“AUG起始密碼子”。少數(shù)基因具有RNA序列為5' -GUG、5' -UUG或5' -CUG的翻譯起始密碼子；已表明5' -AUA、5' -ACG和5' -CUG在體內(nèi)起作用。因此，術(shù)語“翻譯起始密碼子”和“起始密碼子”可包括多種密碼子序列，但是各種情況下起始氨基酸通常為甲硫氨酸(在真核生物中)或甲酰甲硫氨酸(在原核生物中)。真核和原核基因可具有兩個(gè)以上的備選起始密碼子，在特定細(xì)胞類型或組織中或在特定系列條件下可優(yōu)先將任一個(gè)用于翻譯起始。在本發(fā)明上下文中，“起始密碼子”和“翻譯起始密碼子”是指體內(nèi)用于啟始轉(zhuǎn)錄自編碼核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2 (NRM)的基因的mRNA翻譯的密碼子，而不考慮這種密碼子的序列。基因的翻譯終止密碼子(或“終止密碼子”)可具有三種序列即5' -UAA、 5 ‘ -UAG 和 5 ‘ -UGA (對(duì)應(yīng)的 DNA 序列分別是 5 ‘ -TAA、5 ‘ -TAG 和 5 ‘ -TGA)之一。術(shù)語“起始密碼子區(qū)”和“翻譯起始密碼子區(qū)”是指mRNA或基因的一部分，其包含在任何方向(即5'或3')上從翻譯起始密碼子開始的約25-約50個(gè)連續(xù)核苷酸。同樣地，術(shù)語“終止密碼子區(qū)”和“翻譯終止密碼子區(qū)”是指mRNA或基因的一部分，其包含在任何方向(即5'或3')上從翻譯終止密碼子開始的約25-約50個(gè)連續(xù)核苷酸。因此，“起始密碼子區(qū)”(或“翻譯起始密碼子區(qū)”)和“終止密碼子區(qū)”(或翻譯終止密碼子區(qū))均為可用本發(fā)明的反義化合物有效靶向的區(qū)。本領(lǐng)域已知開放閱讀框(ORF)或“編碼區(qū)”是指翻譯起始密碼子和翻譯終止密碼子之間的區(qū)，亦即可有效靶向的區(qū)。在本發(fā)明上下文中，靶區(qū)是包含基因的開放閱讀框 (ORF)的翻譯起始或終止密碼子的基因內(nèi)區(qū)。另一個(gè)靶區(qū)包含5'非翻譯區(qū)(5' UTR)，本領(lǐng)域中已知其是指在5'方向上從翻譯起始密碼子開始的mRNA部分，并因此包含mRNA在5'帽子位點(diǎn)和翻譯起始密碼子之間的核苷酸(或基因上的對(duì)應(yīng)核苷酸)。又一個(gè)靶區(qū)包含3'非翻譯區(qū)(3‘ UTR)，本領(lǐng)域中已知其是指在3‘方向上從翻譯終止密碼子開始的mRNA部分，并因此包含mRNA在翻譯終止密碼子和3'末端之間的核苷酸(或基因上的對(duì)應(yīng)核苷酸)。mRNA的5'帽子位點(diǎn)含有與 mRNA的5'-最末端殘基通過5' -5'三磷酸酯鍵連接的N7-甲基化鳥苷殘基。mRNA的 5'帽區(qū)被認(rèn)為包括5'帽子結(jié)構(gòu)本身以及鄰近帽子位點(diǎn)的前50個(gè)核苷酸。本發(fā)明的另一個(gè)靶區(qū)是5'帽區(qū)。雖然一些真核mRNA轉(zhuǎn)錄物被直接翻譯，但是多數(shù)包含一個(gè)或多個(gè)稱為“內(nèi)含子” 的區(qū)，這些區(qū)在翻譯轉(zhuǎn)錄物之前被從轉(zhuǎn)錄物上切下。剩余(因此被翻譯)的區(qū)被稱為“外顯子”，并被剪接到一起形成連續(xù)的mRNA序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，在疾病涉及異常剪接或疾病涉及特定剪接產(chǎn)物生產(chǎn)過剩的情況中，靶向剪接位點(diǎn)(即內(nèi)含子-外顯子連接點(diǎn)或外顯子-內(nèi)含子連接點(diǎn))特別有用。因重排或缺失引起的異常融合連接點(diǎn)是靶位點(diǎn)的另一個(gè)實(shí)施方案。通過對(duì)不同基因來源的兩個(gè)(以上)mRNA的剪接加工產(chǎn)生的mRNA轉(zhuǎn)錄物稱為“融合轉(zhuǎn)錄物”。利用靶向例如DNA或前mRNA的反義化合物可有效靶向內(nèi)含子。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合靶多核苷酸的編碼和/或非編碼區(qū)，并調(diào)節(jié)靶分子的表達(dá)和/或功能。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合天然反義多核苷酸，并調(diào)節(jié)靶分子的表達(dá)和/或功能。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合有義多核苷酸，并調(diào)節(jié)靶分子的表達(dá)和/或功能?？勺僐NA轉(zhuǎn)錄物可產(chǎn)生自DNA的相同基因組區(qū)。這些可變轉(zhuǎn)錄物通常稱為“變體”。 更具體而言，“前mRNA變體”是產(chǎn)生自相同基因組DNA的轉(zhuǎn)錄物，與其它產(chǎn)生自相同基因組 DNA的轉(zhuǎn)錄物在它們的起始或終止位置方面不同，并同時(shí)含有內(nèi)含子和外顯子序列。通過在剪接過程中切除一個(gè)或多個(gè)外顯子或內(nèi)含子區(qū)或其部分，前mRNA變體產(chǎn)生更小的“mRNA變體”。因此，mRNA變體是經(jīng)加工的前mRNA變體，每個(gè)獨(dú)特的前mRNA變體由于剪接必定總是產(chǎn)生獨(dú)特的mRNA變體。這些mRNA變體也稱為“可變剪接變體”。如果未發(fā)生前mRNA變體的剪接，那么前mRNA變體與mRNA變體相同。變體可通過利用可變信號(hào)起始或終止轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生。前mRNA和mRNA可具有多于一個(gè)起始密碼子或終止密碼子。產(chǎn)生自利用可變起始密碼子的前mRNA或mRNA的變體稱為該前mRNA或mRNA的“可變起始變體”。那些利用可變終止密碼子的轉(zhuǎn)錄物稱為該前mRNA或 mRNA的“可變終止變體”。一種具體類型的可變終止變體是“polyA變體”，其中產(chǎn)生的多個(gè)轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生自轉(zhuǎn)錄機(jī)制對(duì)“polyA終止信號(hào)”之一的可變選擇，從而產(chǎn)生在獨(dú)特的polyA位點(diǎn)終止的轉(zhuǎn)錄物。在本發(fā)明上下文中，本文所述變體類型也是靶核酸的實(shí)施方案。靶核酸上反義化合物與之雜交的部位定義為活性反義化合物靶向的靶區(qū)的長(zhǎng)度至少為5個(gè)核苷酸的部分。雖然本文闡述了某些示例性靶區(qū)段的具體序列，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到， 它們用于闡述和說明本發(fā)明范圍內(nèi)的具體實(shí)施方案。根據(jù)此公開內(nèi)容，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可容易地確定其它靶區(qū)段。長(zhǎng)度5-100個(gè)核苷酸、包含選自闡述的優(yōu)選靶區(qū)段中的一段至少五( 個(gè)連續(xù)核苷酸的靶區(qū)段被認(rèn)為也適合靶向。靶區(qū)段可包含含有來自闡述的優(yōu)選靶區(qū)段之一的5'末端的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸的DNA或RNA序列(剩余核苷酸為同一 DNA或RNA的一段連續(xù)序列，以緊接靶區(qū)段的5' 末端上游開始，并持續(xù)直到該DNA或RNA含有約5-約100個(gè)核苷酸)。同樣優(yōu)選的靶區(qū)段是含有從闡述的優(yōu)選靶區(qū)段之一的3'末端開始的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸的DNA或RNA序列 (剩余核苷酸是同一 DNA或RNA的一段連續(xù)序列，以緊接靶區(qū)段的3'末端下游開始，并持續(xù)直到該DNA或RNA含有約5-約100個(gè)核苷酸)。本領(lǐng)域技術(shù)人員結(jié)合本文所述靶區(qū)段能夠在不進(jìn)行過度實(shí)驗(yàn)的情況下鑒定其它優(yōu)選靶區(qū)段。只要已鑒定了一個(gè)或多個(gè)靶區(qū)、區(qū)段或位點(diǎn)，就選擇與靶標(biāo)充分互補(bǔ)(即足夠充分并以足夠特異性雜交)的反義化合物，以得到所需效果。在本發(fā)明實(shí)施方案中，寡核苷酸結(jié)合特定靶標(biāo)的反義鏈。寡核苷酸長(zhǎng)度為至少5 個(gè)核苷酸，并可被合成使每個(gè)寡核苷酸靶向重疊序列，從而合成的寡核苷酸覆蓋靶多核苷
20酸的完整長(zhǎng)度。靶標(biāo)還包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選通過反義寡核苷酸靶向特定核酸。反義化合物靶向特定核酸是多步驟過程。該過程通常開始于鑒定待調(diào)節(jié)功能的核酸序列。這可以是例如其表達(dá)與特定病癥或疾病狀態(tài)相關(guān)的細(xì)胞基因(或轉(zhuǎn)錄自該基因的mRNA)，或者非編碼多核苷酸， 例如非編碼RNA(ncRNA)。RNA可歸為(1)被翻譯成蛋白質(zhì)的信使RNA (mRNA)和(2)不編碼蛋白的 RNA(ncRNA)。ncRNA包括微小RNA、反義轉(zhuǎn)錄物及其它含有高密度的終止密碼子并缺乏任何大范圍“開放閱讀框”的轉(zhuǎn)錄單位(TU)。許多ncRNA似乎起始于編碼蛋白的基因座的3' 非翻譯區(qū)(3‘ UTR)的起始位點(diǎn)。ncRNA通常很少，且已由FANTOM公司測(cè)序的ncRNA中至少一半似乎未被聚腺苷酸化。由于顯而易見的原因，大多數(shù)研究人員已聚焦于被加工并輸出到胞漿中的聚腺苷酸化mRNA。最近表明，非聚腺苷酸化的核RNA組可能非常大，且許多這樣的轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生自所謂的基因區(qū)間(Cheng, J.等(2005) Science 308(5725),1149-1154 ； Kapranoν, P.等 Q005). Genome Res 15 (7)，987-997)。ncRNA 可調(diào)節(jié)基因表達(dá)的機(jī)制是通過與靶轉(zhuǎn)錄物的堿基配對(duì)。通過堿基配對(duì)起作用的RNA可被分為(1)順式編碼RNA，其在相同基因位置但在與它們作用的RNA的相對(duì)鏈上被編碼，因此顯示與它們靶標(biāo)的完全互補(bǔ)性，和( 反式編碼RNA，其在與它們作用的RNA不同的染色體位置上被編碼，且通常不表現(xiàn)與它們的靶標(biāo)進(jìn)行完全堿基配對(duì)的可能性。不希望為理論所約束，通過本文所述反義寡核苷酸對(duì)反義多核苷酸的干擾可改變相應(yīng)有義信使RNA的表達(dá)。但是，該調(diào)節(jié)可以是不一致的(discordant)(反義敲減引起信使RNA增加)或一致的(concordant)(反義敲減引起伴隨的信使RNA減少)。在這些情況下，可將反義寡核苷酸靶向反義轉(zhuǎn)錄物的重疊或非重疊部分，以引起其敲減或隔離 (sequestration)。編碼或非編碼反義物可以相同方式靶向，且任一種能夠調(diào)節(jié)相應(yīng)的有義轉(zhuǎn)錄物-以一致或不一致的方式。用以鑒定新的針對(duì)靶標(biāo)使用的寡核苷酸的策略可基于通過反義寡核苷酸或任何其它調(diào)節(jié)所需靶標(biāo)的方法對(duì)反義RNA轉(zhuǎn)錄物的敲減。策略1 在不一致的調(diào)節(jié)情況中，反義轉(zhuǎn)錄物的敲減提高常規(guī)(有義)基因的表達(dá)。如果后者的基因編碼已知或推定的藥物靶標(biāo)，那么可想象得到，其反義配對(duì)物的敲減可模仿受體激動(dòng)劑或酶刺激劑的作用。策略2 在一致調(diào)節(jié)的情況中，可相伴敲減反義和有義轉(zhuǎn)錄物，從而實(shí)現(xiàn)常規(guī)(有義)基因表達(dá)的協(xié)同性減少。例如，如果利用反義寡核苷酸完成敲減，那么可利用該策略應(yīng)用一個(gè)靶向有義轉(zhuǎn)錄物的反義寡核苷酸和另一個(gè)靶向相應(yīng)反義轉(zhuǎn)錄物的反義寡核苷酸，或者應(yīng)用同時(shí)靶向重疊的有義和反義轉(zhuǎn)錄物的單個(gè)有效的對(duì)稱反義寡核苷酸。按照本發(fā)明，反義化合物包括反義寡核苷酸、核酶、外部指導(dǎo)序列(EGQ寡核苷酸、siRNA化合物、單鏈或雙鏈RNA干擾(RNAi)化合物(例如siRNA化合物)及其它與靶核酸的至少一部分雜交并調(diào)節(jié)其功能的寡聚化合物。同樣地，它們可以是DNA、RNA、類DNA、類 RNA及其混合物，或者可以是它們中一種或多種的模擬物。這些化合物可以是單鏈、雙鏈、 環(huán)狀或發(fā)夾狀的寡聚化合物，并可包含結(jié)構(gòu)元件，例如內(nèi)部或端部凸起、錯(cuò)配或環(huán)。反義化合物常規(guī)線性制備，但可連接或另外制備成環(huán)狀和/或分支。反義化合物可包括構(gòu)建體，例如雜交形成完全或部分雙鏈化合物的兩條鏈或者具有足夠的自我互補(bǔ)性以允許雜交和形成完全或部分雙鏈化合物的單鏈。兩條鏈可內(nèi)部連接留下游離的3'或5'末端，或者可連接形成連續(xù)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)或環(huán)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)可包含5'或者3'末端的突出端，產(chǎn)生單鏈特征的延伸。雙鏈化合物任選地可包括末端的突出端。其它修飾可包括連接至末端之一、選定核苷酸位置、糖位置或核苷間鍵之一的綴合基?；蛘?，兩條鏈可通過非核酸部分或連接基團(tuán)連接。當(dāng)僅由一條鏈形成時(shí)，dsRNA可呈現(xiàn)自身互補(bǔ)的發(fā)夾型分子的形式，該發(fā)夾型分子自身對(duì)折形成雙鏈體。因此，dsRNA可以是完全或部分雙鏈的?；虮磉_(dá)的特異性調(diào)節(jié)可通過在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)dsRNA發(fā)夾來實(shí)現(xiàn)，但是在某些實(shí)施方案中，基因表達(dá)或功能被上調(diào)。當(dāng)由兩條鏈形成或由呈現(xiàn)自身對(duì)折形成雙鏈體的自身互補(bǔ)性發(fā)夾型分子的形式的單鏈形成時(shí)，兩條鏈(單鏈的雙鏈體形成區(qū))是以Watson-Crick方式進(jìn)行堿基配對(duì)的互補(bǔ) RNA 鏈。一旦被引入系統(tǒng)，本發(fā)明化合物可引起一種或多種酶或結(jié)構(gòu)蛋白的作用以影響靶核酸的切割或其它修飾，或通過基于占用的機(jī)制起作用。通常，核酸(包括寡核苷酸)可被描述為“類DNA”(即通常具有一個(gè)或多個(gè)2'-脫氧糖和通常具有T而非U堿基)或“類 RNA”(即通常具有一個(gè)或多個(gè)2'-羥基或2'-修飾糖和通常具有U而非T堿基)。核酸螺旋可采取多于一種類型的結(jié)構(gòu)，最常見的是A型和B型。據(jù)認(rèn)為，一般而言，具有類似 B型結(jié)構(gòu)的寡核苷酸為“類DNA”，而那些具有類似A型結(jié)構(gòu)的寡核苷酸為“類RNA”。在一些 (嵌合)實(shí)施方案中，反義化合物可同時(shí)包含A型區(qū)和B型區(qū)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所需寡核苷酸或反義化合物包括下述的至少一種反義RNA、反義DNA、嵌合反義寡核苷酸、含修飾鍵的反義寡核苷酸、干擾RNA(RNAi)、短干擾 RNA(siRNA)；微小干擾RNA(miRNA)；小時(shí)序RNA(stRNA)；或者短發(fā)夾RNA(shRNA)；小RNA誘導(dǎo)的基因激活(RNAa)；小激活RNA(saRNA)或其組合。dsRNA還可激活基因表達(dá)，這是已稱為“小RNA誘導(dǎo)的基因激活”或RNAa的機(jī)制。 靶向基因啟動(dòng)子的dsRNA誘導(dǎo)相關(guān)基因的有效轉(zhuǎn)錄激活。利用稱為“小激活RNA(saRNA)，， 的合成dsRNA在人細(xì)胞中表明RNAa。目前不清楚其它生物體內(nèi)是否保留RNAa。小雙鏈RNA (dsRNA)例如小干擾RNA (siRNA)和微小RNA (miRNA)，已被發(fā)現(xiàn)是稱為 RNA干擾(RNAi)的進(jìn)化保守機(jī)制的觸發(fā)物。RNAi總是通過重建染色質(zhì)導(dǎo)致基因沉默，從而抑制轉(zhuǎn)錄、降解互補(bǔ)mRNA或阻斷蛋白翻譯。但是，在下文實(shí)施例部分詳述的情形中，表明寡核苷酸提高核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2 (NRM)多核苷酸及其編碼產(chǎn)物的表達(dá)和/或功能。dsRNA也可作為小激活RNA(saRNA)。不希望為理論所約束，通過靶向基因啟動(dòng)子的序列，saRNA在稱為dsRNA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活(RNAa)的表型中誘導(dǎo)靶基因表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，本文鑒定的“優(yōu)選靶區(qū)段”可用來篩選另外的調(diào)節(jié)核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2 (NRM)多核苷酸表達(dá)的化合物?！罢{(diào)節(jié)劑”是那些降低或提高編碼核因子 (紅細(xì)胞衍生2)-樣2 (NRF2)的核酸分子的表達(dá)的那些化合物，其包含與優(yōu)選靶區(qū)段互補(bǔ)的至少5個(gè)核苷酸的部分。篩選法包括以下步驟將編碼核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2(NRF2) 的有義或天然反義多核苷酸的核酸分子的優(yōu)選靶區(qū)段與一種或多種候選調(diào)節(jié)劑接觸，并選擇降低或提高編碼核因子(紅細(xì)胞衍生2)-樣2 (NRF2)多核苷酸(例如SEQ ID NO 4-6) 的核酸分子的表達(dá)的一種或多種候選調(diào)節(jié)劑。一旦表明候選調(diào)節(jié)劑能夠調(diào)節(jié)(例如降低或提高)編碼核因子(紅細(xì)胞衍生2)-樣2(NRF2)多核苷酸的核酸分子的表達(dá)，則調(diào)節(jié)劑可用于核因子(紅細(xì)胞衍生2)-樣2(NRF2)多核苷酸功能的其它調(diào)查性研究，或依據(jù)本發(fā)明用作研究、診斷或治療的試劑。
靶向天然反義序列優(yōu)選調(diào)節(jié)靶基因的功能。例如NRF2基因(例如登記號(hào) NM_006164，圖2)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，靶標(biāo)是NRF2基因的反義多核苷酸。在優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸靶向核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2 (NRM)多核苷酸(例如登記號(hào)匪_006164，圖幻的有義和/或天然反義序列，其變體、等位基因、同種型、同源物、突變體、 衍生物、片段和互補(bǔ)序列。優(yōu)選地，寡核苷酸是反義分子，靶標(biāo)包括反義和/或有義NRF2多核苷酸的編碼和非編碼區(qū)。本發(fā)明的優(yōu)選靶區(qū)段還可與本發(fā)明的它們各自互補(bǔ)的反義化合物結(jié)合，以形成穩(wěn)定的雙鏈(雙鏈體)寡核苷酸。本領(lǐng)域中已表明，這樣的雙鏈寡核苷酸部分通過反義機(jī)制調(diào)節(jié)靶標(biāo)表達(dá)和調(diào)節(jié)翻譯及RNA加工。此外，雙鏈部分可經(jīng)過化學(xué)修飾(Fire等，(1998) Nature, 391,806-811 ； Timmons 禾口 Fire， (1998)Nature,395,854 ；Timmons 等，(2001)Gene,263,103-112 ；Tabara 等,(1998) Science, 282, 430-431 ；Montgomery 等,(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95,15502-15507 ；Tuschl 等，(1999)Genes Dev. ,13,3191-3197 ；Elbashir 等，(2001) Nature，411，494-498 ;Elbashir 等，(2001)Genes Dev. 15，188-200)。例如，已表明這樣的雙鏈部分通過雙鏈體的反義鏈與靶標(biāo)的經(jīng)典雜交而抑制靶標(biāo)，從而觸發(fā)靶標(biāo)的酶促降解 (Tijsterman 等，Q002) Science, 295,694-697)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸靶向核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2(NRF2) 多核苷酸(例如登錄號(hào)NM_006164)、其變體、等位基因、同種型、同源物、突變體、衍生物、片段和互補(bǔ)序列。優(yōu)選地，寡核苷酸是反義分子。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案，靶核酸分子不僅限于核因子(紅細(xì)胞衍生2)-樣2(NRF2)， 而且延伸至核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2 (NRM)分子的任何同種型、受體、同源物等。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸靶向NRF2多核苷酸的天然反義序列(例如 SEQ ID NO :3所示的多核苷酸)及其任何變體、等位基因、同源物、突變體、衍生物、片段和互補(bǔ)序列。反義寡核苷酸的實(shí)例如SEQ ID NO :4-6所示。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸與核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2 (NRM)反義物的核酸序列互補(bǔ)或與之結(jié)合，并調(diào)節(jié)核因子(紅細(xì)胞衍生2)-樣2(NRF2)分子的表達(dá)和/或功能，所述核酸序列包括但不限于與核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2 (NRM)多核苷酸相關(guān)的非編碼有義和/或反義序列。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸與SEQ ID NO :3所示NRF2天然反義核酸序列互補(bǔ)或與之結(jié)合，并調(diào)節(jié)NRF2分子的表達(dá)和/或功能。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸包含SEQ ID NO :4_6的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸的序列，并調(diào)節(jié)核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2 (NRM)分子的表達(dá)和/或功能。多核苷酸靶標(biāo)包括NRF2，包括其家族成員、NRF2變體；NRF2突變體，包括SNP ； NRF2的非編碼序列；NRF2的等位基因；物種變體、片段等。優(yōu)選地，寡核苷酸是反義分子。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，靶向核因子(紅細(xì)胞衍生2)-樣2(NRF2)多核苷酸的寡核苷酸包括反義RNA、干擾RNA(RNAi)、短干擾RNA(siRNA)；微小干擾RNA(miRNA)；小時(shí)序RNA (stRNA)；短發(fā)夾RNA (shRNA)；小RNA誘導(dǎo)的基因激活(RNAa)；或小激活RNA (saRNA)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，靶向核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2 (NRM)多核苷酸(例如SEQ ID NO :3)調(diào)節(jié)這些靶標(biāo)的表達(dá)或功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，相比對(duì)照上調(diào)表達(dá)或功能。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，相比對(duì)照下調(diào)表達(dá)或功能。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，反義化合物包含SEQ ID N0:4_6所示序列。這些寡核苷酸可包含一個(gè)或多個(gè)修飾核苷酸、較短片段或較長(zhǎng)片段、修飾鍵等。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，SEQ ID NO :4_6包含一個(gè)或多個(gè)LNA核苷酸。表1顯示用于本發(fā)明方法中的例示性寡核苷酸
權(quán)利要求
1.一種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2 (NRM)多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞或組織與至少一種5-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的反義寡核苷酸接觸，其中所述至少一種寡核苷酸與包含SEQ ID而3(圖；3)的1-5808位核苷酸中的5-30個(gè)連續(xù)核苷酸的多核苷酸的反向互補(bǔ)序列具有至少50%的序列同一性；藉此體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2 (NRM)多核苷酸的功能和/或表達(dá)。
2.—種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2 (NRM)多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞或組織與至少一種5-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的反義寡核苷酸接觸，其中所述至少一種寡核苷酸與核因子(紅細(xì)胞衍生2)-樣2 (NRF2)多核苷酸的天然反義物的反向互補(bǔ)序列具有至少50%的序列同一性；藉此體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的核因子(紅細(xì)胞衍生2)-樣2 (NRF2)多核苷酸的功能和/或表達(dá)。
3.一種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2 (NRM)多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞或組織與至少一種5-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的反義寡核苷酸接觸，其中所述至少一種寡核苷酸與核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2 (NRM)多核苷酸的反義寡核酸具有至少 50%的序列同一性；藉此體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣 2(NRF2)多核苷酸的功能和/或表達(dá)。
4.一種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2 (NRM)多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞或組織與至少一種靶向核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2 (NRM)多核苷酸的天然反義寡核苷酸的區(qū)的反義寡核苷酸接觸；藉此體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的核因子(紅細(xì)胞衍生2)-樣2 (NRF2)多核苷酸的功能和/或表達(dá)。
5.權(quán)利要求4的方法，其中相比對(duì)照體內(nèi)或體外提高核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣 2 (NRF2)的功能和/或表達(dá)。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶向核因子(紅細(xì)胞衍生 2)-樣2(NRF2)多核苷酸的天然反義序列。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶向包含核因子(紅細(xì)胞衍生 2)-樣2 (NRM)多核苷酸的編碼和/或非編碼核酸序列的核酸序列。
8.權(quán)利要求4的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶向核因子(紅細(xì)胞衍生 2)-樣2 (NRM)多核苷酸的重疊和/或非重疊序列。
9.權(quán)利要求4的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸包含選自以下的一種或多種修飾至少一種修飾糖部分、至少一種修飾核苷間鍵、至少一種修飾核苷酸及其組合。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述一種或多種修飾包括選自以下的至少一種修飾糖部分2' -0-甲氧乙基修飾糖部分、2'-甲氧基修飾糖部分、2' -0-烷基修飾糖部分、二環(huán)糖部分及其組合。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述一種或多種修飾包括選自以下的至少一種修飾核苷間鍵硫代磷酸酯、2' -0-甲氧乙基(M0E)、2'-氟、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯及其組合。
12.權(quán)利要求9的方法，其中所述一種或多種修飾包括選自以下的至少一種修飾核苷酸肽核酸(PNA)、鎖定核酸(LNA)、阿糖核酸(FANA)、類似物、衍生物及其組合。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種寡核苷酸包含SEQID NO :4-6所示的至少一種寡核苷酸序列。
14.一種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2(NRF2) 基因的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞或組織與至少一種5-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的短干擾RNA(SiRNA)寡核苷酸接觸，所述至少一種siRNA寡核苷酸對(duì)核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2 (NRM)多核苷酸的反義多核苷酸特異，其中所述至少一種siRNA寡核苷酸與核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2(NRF2)多核苷酸的反義和/或有義核酸分子的至少約5個(gè)連續(xù)核酸的互補(bǔ)序列具有至少50%的序列同一性；和體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中的核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2(NRF2) 的功能和/或表達(dá)。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述寡核苷酸與至少約5個(gè)連續(xù)核酸的序列具有至少 80%的序列同一性，所述至少約5個(gè)連續(xù)核酸的序列與核因子(紅細(xì)胞衍生2)-樣2 (NRF2) 多核苷酸的反義和/或有義核酸分子互補(bǔ)。
16.一種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2(NRF2) 的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞或組織與對(duì)核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2 (NRM)多核苷酸的有義/或天然反義鏈的非編碼和/或編碼序列特異的至少一種約5-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的反義寡核苷酸接觸，其中所述至少一種反義寡核苷酸與SEQ ID NO :1、3所示的至少一種核酸序列具有至少 50%的序列同一性；和體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣 2 (NRF2)的功能和/或表達(dá)。
17.一種合成修飾寡核苷酸，其包含至少一種修飾，其中所述至少一種修飾選自至少一種修飾糖部分、至少一種修飾核苷酸間鍵、至少一種修飾核苷酸及其組合；其中所述寡核苷酸是與核因子(紅細(xì)胞衍生2)-樣2(NRF2)基因雜交并相比正常對(duì)照體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)其功能和/或表達(dá)的反義化合物。
18.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述至少一種修飾包括選自以下的核苷酸間鍵硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、 磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯及其組合。
19.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一種硫代磷酸酯核苷酸間鍵。
20.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷酸間鍵骨架。
21.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一種修飾核苷酸，所述修飾核苷酸選自肽核酸、鎖定核酸(LNA)、類似物、衍生物及其組合。
22.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含多種修飾，其中所述修飾包括選自以下的修飾核苷酸硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯及其組合。
23.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含多種修飾，其中所述修飾包括選自以下的修飾核苷酸肽核酸、鎖定核酸(LNA)、類似物、衍生物及其組合。
24.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含選自以下的至少一種修飾糖部分2' -0-甲氧乙基修飾糖部分、2'-甲氧基修飾糖部分、2' -0-烷基修飾糖部分、二環(huán)糖部分及其組合。
25.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含多種修飾，其中所述修飾包含選自以下的修飾糖部分2' -0-甲氧乙基修飾糖部分、2'-甲氧基修飾糖部分、2' -0-烷基修飾糖部分、二環(huán)糖部分及其組合。
26.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸長(zhǎng)度為至少約5-30個(gè)核苷酸，并與核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2 (NRM)多核苷酸的反義和/或有義鏈雜交，其中所述寡核苷酸與核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2 (NRM)多核苷酸的反義和/或有義編碼和/或非編碼核酸序列的至少約5個(gè)連續(xù)核酸的互補(bǔ)序列具有至少約20%的序列同一性。
27.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2(NRF2) 多核苷酸的反義和/或有義編碼和/或非編碼核酸序列的至少約5個(gè)連續(xù)核酸的互補(bǔ)序列具有至少約80%的序列同一性。
28.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與至少一種核因子(紅細(xì)胞衍生 2)-樣2(NRF2)多核苷酸雜交并相比正常對(duì)照體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)其表達(dá)和/或功能。
29.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含SEQID N0:4_6所示的序列。
30.一種組合物，其包含對(duì)一種或多種核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2 (NRM)多核苷酸特異的一種或多種寡核苷酸，所述多核苷酸包括反義序列、互補(bǔ)序列、等位基因、同源物、同種型、變體、衍生物、突變體、片段或其組合。
31.權(quán)利要求30的組合物，其中所述寡核苷酸與SEQID NO :4_6所示的任何一種核苷酸序列相比具有至少約40%的序列同一性。
32.權(quán)利要求30的組合物，其中所述寡核苷酸包含SEQID NO :4_6所示的核苷酸序列。
33.權(quán)利要求32的組合物，其中SEQID NO :4_6所示的寡核苷酸包含一種或多種修飾或取代。
34.權(quán)利要求33的組合物，其中所述一種或多種修飾選自硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、 肽核酸、鎖定核酸(LNA)分子及其組合。
35.一種預(yù)防或治療與至少一種核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2 (NRM)多核苷酸和/或其至少一種編碼產(chǎn)物相關(guān)的疾病的方法，所述方法包括將治療有效劑量的至少一種反義寡核苷酸給予患者，所述反義寡核苷酸與所述至少一種核因子(紅細(xì)胞衍生2)-樣2(NRF2)多核苷酸的天然反義序列結(jié)合，并調(diào)節(jié)所述至少一種核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2 (NRM)多核苷酸的表達(dá)；藉此預(yù)防或治療與至少一種核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2 (NRM)多核苷酸和/或其至少一種編碼產(chǎn)物相關(guān)的疾病。
36.權(quán)利要求35的方法，其中與至少一種核因子(紅細(xì)胞衍生幻-樣2(NRM)多核苷酸相關(guān)的疾病選自慢性阻塞性肺病(COPD)、多發(fā)性硬化癥、肝臟疾病或障礙、胃腸道疾病或障礙、糖尿病、自身免疫性疾病、免疫相關(guān)疾病或障礙、免疫缺陷(例如AIDS)、神經(jīng)學(xué)疾病或障礙、神經(jīng)退行性疾病或障礙、與氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病或障礙或病癥、眼病(例如年齡相關(guān)性黃斑變性、白內(nèi)障、輕度視網(wǎng)膜病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病等)、皮膚病、哮喘、動(dòng)脈硬化、慢性炎性疾病或病癥(例如血管炎、肺支氣管炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、肝炎、胰腺炎、皮炎、食管炎、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、結(jié)膜炎等)、神經(jīng)修復(fù)和麻痹、神經(jīng)內(nèi)分泌分化、炎性疾病、肌肉疾病或障礙、與感染性生物相關(guān)的疾病或障礙、老年斑、腦淀粉樣血管病、動(dòng)脈粥樣硬化、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、淀粉樣蛋白沉積、神經(jīng)纖維纏結(jié)、癡呆、絨膜癌、星形細(xì)胞瘤、淀粉樣變性病、高脂血癥、瘤性轉(zhuǎn)化、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、動(dòng)脈粥樣硬化阻塞、轉(zhuǎn)移、心肌梗死、肺纖維化、壞死、休克、黑素瘤、結(jié)直腸癌、遺傳易感性、牛皮癬、與異常細(xì)胞增殖相關(guān)的疾病或障礙(例如癌癥、牛皮癬等)、癌癥(例如前列腺癌、肺癌、乳腺癌、非小細(xì)胞性肺癌(NSCLC)、 白血病等)、炎癥、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、癌、神經(jīng)病理學(xué)、腫瘤、血管疾病、細(xì)胞損傷、腦腫瘤、高膽固醇血癥、脂肪肉瘤、冠狀動(dòng)脈性心臟病、冠狀動(dòng)脈疾病、腎小球性腎炎、靜脈血栓形成及病理過程。
37. 一種鑒定和選擇用于體內(nèi)給予的至少一種寡核苷酸的方法，所述方法包括選擇與疾病狀態(tài)相關(guān)的靶多核苷酸；鑒定包含至少5個(gè)連續(xù)核苷酸的至少一種寡核苷酸，所述至少5個(gè)連續(xù)核苷酸與所選擇的靶多核苷酸互補(bǔ)或與所選擇的靶多核苷酸的反義多核苷酸互補(bǔ)；在嚴(yán)格雜交條件下，測(cè)量反義寡核苷酸和所述靶多核苷酸或所選擇的靶多核苷酸的反義多核苷酸的雜合體的熱解鏈溫度；和基于所得信息選擇用于體內(nèi)給予的至少一種寡核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸尤其是通過靶向核因子(紅細(xì)胞衍生2)-樣2(NRF2)的天然反義多核苷酸來調(diào)節(jié)核因子(紅細(xì)胞衍生2)-樣2(NRF2)的表達(dá)和/或功能。本發(fā)明還涉及這些反義寡核苷酸的鑒定及其在治療與NRF2表達(dá)相關(guān)的疾病與障礙中的用途。
文檔編號(hào)C07H21/00GK102482677SQ201080022272
公開日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月16日
發(fā)明者C·科伊托, J·科拉德, 謝爾曼 O·霍爾科瓦 申請(qǐng)人:歐科庫(kù)爾納有限責(zé)任公司