專利名稱：在網(wǎng)粘菌門微生物中產(chǎn)生蛋白質(zhì)的制作方法
在網(wǎng)粘菌門微生物中產(chǎn)生蛋白質(zhì)發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及網(wǎng)粘菌門(Labyrinthulomycota)的重組細胞和微生物以及它們在異源蛋白質(zhì)生產(chǎn)中的應(yīng)用，與從重組宿主細胞和微生物有效產(chǎn)生和任選地分泌多肽有關(guān)的新穎啟動子、終止子和信號序列也包含在本發(fā)明中。
背景技術(shù)：
生物技術(shù)和分子生物學(xué)的發(fā)展使得原先只能從人或動物的組織、血液或尿液樣本中提取的蛋白質(zhì)，能夠在微生物、植物和動物細胞中產(chǎn)生。目前商品化生物產(chǎn)品通常在哺乳動物細胞如CHO細胞(中國倉鼠卵巢細胞)中，或在微生物細胞如酵母或大腸桿菌細胞系 中產(chǎn)生。與已有的動植物細胞培養(yǎng)體系相比，通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生蛋白質(zhì)有若干優(yōu)勢，例如，基于微生物發(fā)酵的過程有以下特性(I)快速產(chǎn)生高濃度的蛋白質(zhì)；(2)能夠使用無菌的、嚴格控制的產(chǎn)生條件，(比如優(yōu)良制造標(biāo)準(zhǔn)(GMP)生產(chǎn)條件)；(3)能夠使用簡單的、化學(xué)組分明確的生長培養(yǎng)基以便簡化發(fā)酵和減少雜質(zhì)；(4)沒有人類或動物病原體污染；(5)容易回收蛋白質(zhì)(如從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離)。此外，與細胞培養(yǎng)設(shè)施相比，發(fā)酵設(shè)備的構(gòu)建成本通常更低。美國公開號2003/0166207(即現(xiàn)在的美國專利7，001, 772)首次披露了適合轉(zhuǎn)化破囊壺菌(包括裂殖壺菌屬(Schizochytrium)在內(nèi))的重組構(gòu)建體。此外，該公開文獻還披露了裂殖壺菌的乙酰乳酸合酶的核酸及氨基酸序列、乙酰乳酸合酶的啟動子和終止子區(qū)域、a-微管蛋白質(zhì)的啟動子、聚酮合酶(PKS)體系的啟動子以及脂肪酸去飽和酶的啟動子。隨后出版的美國公開號2006/0275904及2006/0286650(通過引用全文納入本文)進一步披露了裂殖壺菌的肌動蛋白、efl a (延長因子la)以及甘油醛_3_磷酸脫氫酶(GAPDH)的啟動子和終止子的序列。持續(xù)需要鑒定用于在破囊壺菌微生物中表達蛋白質(zhì)的其它調(diào)控元件，包括差異表達的調(diào)控元件，例如，在不同的時間點、或在一定的培養(yǎng)條件下、或在化學(xué)或環(huán)境因素的刺激下會應(yīng)答的元件。還需要鑒定能夠有效指導(dǎo)蛋白質(zhì)從網(wǎng)粘菌門微生物和破囊壺菌目(Thraustochytriales)微生物(比如裂殖壺菌屬和其它一些破囊壺菌)分泌出來的分泌信號系列。發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種分尚的核酸分子，其包含多核苷酸序列SEQ ID NO :3。本發(fā)明也涉及一種分尚的核酸分子，其包含多核苷酸序列SEQ ID NO :4。本發(fā)明也涉及一種分離的核酸分子，其包含編碼某多肽的多核苷酸序列，所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO :1。在一些實施方式中，所述的多核苷酸序列包含SEQ ID NO2。
本發(fā)明也涉及一種分離的核酸分子，其包含編碼某多肽的多核苷酸序列，所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO :37。在一些實施方式中，所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO:38。本發(fā)明也涉及一種分尚的核酸分子，其包含多核苷酸序列SEQ ID NO :42。在一些實施方式中，所述多核苷酸序列包含SEQ ID N0:43。本發(fā)明也涉及一種分離的核酸分子，其包含多核苷酸序列SEQ ID NO :44。在一些實施方式中，所述多核苷酸序列包含多核苷酸序列SEQ ID N0:45。本發(fā)明也涉及一種分尚的核酸分子，其包含多核苷酸序列SEQ ID NO :46。本發(fā)明也涉及一種分離的核酸分子，其包含與上述的任何一個多核苷酸序列完全互補的多核苷酸序列。本發(fā)明也涉及一種重組的核酸分子，其包含上述任何分離的核酸分子。在一些實 施方式中，所述重組核酸分子是載體。在一些實施方式中，所述分離的核酸分子操作性連接于編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸序列。在一些實施方式中，所述蛋白質(zhì)操作性連接于分泌信號。本發(fā)明也涉及一種宿主細胞，其包含上述任何分離的或重組的核酸分子或其組合。在一些實施方式中，宿主細胞是破囊壺菌目成員。在一些實施方式中，宿主細胞是為裂殖壺菌屬(Schizochytrium)或破囊壺菌屬(Thraustochytrium)。本發(fā)明也涉及一種產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組的破囊壺菌目微生物以產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)，其中所述重組微生物包含上述任何分離的核酸分子，所述核酸分子操作性連接于編碼所述蛋白質(zhì)的多核苷酸序列。在一些實施方式中，所述蛋白質(zhì)從分離的破囊壺菌目生物質(zhì)回收獲得。在一些實施方式中，所述蛋白質(zhì)在所述微生物內(nèi)累積。在一些實施方式中，所述蛋白質(zhì)在所述微生物的膜內(nèi)累積。在一些實施方式中，所述蛋白質(zhì)從培養(yǎng)基中回收獲得。在一些實施方式中，所述蛋白質(zhì)是分泌蛋白質(zhì)。本發(fā)明也涉及一種分離的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO :1。本發(fā)明也涉及一種分離的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO :15。本發(fā)明也涉及一種轉(zhuǎn)化宿主細胞的方法，其包括(a)用具有蛋白酶活性的酶預(yù)處理所述宿主細胞；和(b)通過電穿孔將核酸分子引入所述宿主細胞。附圖簡要說明圖I為裂殖壺菌Na/Pi_IIIb2轉(zhuǎn)運蛋白信號肽的氨基酸序列(SEQ ID NO :1)。圖2為編碼信號肽SEQ ID NO :I的多核苷酸序列(SEQ ID NO 2)。圖3為裂殖壺菌PUFA PKS OrfC啟動子區(qū)域的多核苷酸序列(SEQ ID NO 3)。圖4為裂殖壺菌PUFA PKS OrfC終止子元件I的多核苷酸序列(SEQ ID NO 4)。圖5為pSchizE的質(zhì)粒圖譜。圖6為pSchiz-sG (又稱pCOOOOl)的質(zhì)粒圖譜。圖7為pSchiz-sGr的質(zhì)粒圖譜。圖8為pSchiz-cG的質(zhì)粒圖譜。圖9為eGFP在裂殖壺菌屬細胞的胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的表達情況。圖9A、9C和9已是熒光顯微照片；圖98、90和9F是可見光顯微照片；圖9么和9B是轉(zhuǎn)化pSchiz-sGr后同一個視野下的細胞圖；圖9(和9D是轉(zhuǎn)化pSchiz-cG后同一個視野下的細胞圖；圖9￡和9F是轉(zhuǎn)化pSchiz-E后同一個視野下的細胞圖。
圖IOA為pSchiz-sGr轉(zhuǎn)化的裂殖壺菌細胞中，靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的eGFP和核酸染料4'，6_二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的熒光定位的復(fù)合圖；圖IOB和IOC分別為用于制備該復(fù)合顯微圖的eGFP-ER染色和DAPI-核染色圖；圖IOD為光鏡下的同一視野；圖IOA表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜包裹著各個細胞核，各細胞可包括多個細胞核。標(biāo)示出一個細胞中只有一個核的相關(guān)特征。

圖11為從裂殖壺菌的4個轉(zhuǎn)化克隆得到的無細胞上清液和無細胞提取物樣品的蛋白質(zhì)印跡和相應(yīng)的考馬斯藍染色染色的SDS-PAGE凝膠?！皊up”和“cyto”分別代表無細胞上清液和無細胞提取物；“sG”代表轉(zhuǎn)化了 pSchiz-sGr質(zhì)粒的細胞樣品；“sGr”代表轉(zhuǎn)化了 pSchiz-sGr質(zhì)粒的細胞樣品；“cG”代表轉(zhuǎn)化了 pSchiz-cG質(zhì)粒的細胞樣品；“vec(_)”代表轉(zhuǎn)化了 pSchiz-ElO質(zhì)粒的細胞樣品；“GFP (+) ”代表純化的重組GFP標(biāo)準(zhǔn)品(加利福尼亞州山景城的克隆泰克公司(Clontech, Mountain View, CA)) ;SDS-PAGE膠上樣量無細胞上清液蛋白質(zhì)為3 u g，無細胞提取物蛋白質(zhì)樣品為I U g，在每對樣品、重組GFP標(biāo)準(zhǔn)品和分子量標(biāo)記物之間留有空白泳道。圖12為裂殖壺菌Secl轉(zhuǎn)運蛋白的前30個氨基酸，1-20位氨基酸為信號肽序列(SEQ ID NO 37)。圖13為編碼SEQ ID NO 37的信號肽的多核苷酸序列(SEQ ID NO 38)。圖14 為 pSchiz-Cpt-sleGFP (又稱 pCLOOOl)的質(zhì)粒圖。圖15A為不同發(fā)酵條件下(圖15中定義為B26、B27或B28發(fā)酵條件)培養(yǎng)的三個裂殖壺菌培養(yǎng)中分泌的eGFP蛋白的蛋白質(zhì)印跡圖；圖15B為對應(yīng)的考馬斯藍染色SDS-PAGE凝膠。泳道1-19的上樣量如圖中所示。LH表示以小時計算的發(fā)酵時間；圖15A中的泳道20和圖15B中的泳道20分別加有IOng和0. 5 y g的純化的重組GFP標(biāo)準(zhǔn)品；由于包含接頭序列，裂殖壺菌產(chǎn)生的eGFP條帶略大于對照條帶。圖16 為 pSchiz-Cpt-sl k bh 的質(zhì)粒圖。圖17為裂殖壺菌分泌的K抗體亞單位的蛋白質(zhì)印跡圖，L為無細胞提取物，S為無細胞上清液。圖18A為K抗體亞單位的表達的蛋白質(zhì)印跡圖。圖18A頂部標(biāo)示的孵育時間為收獲培養(yǎng)物上清液樣品的時間。“wt”代表"野生型"裂殖壺菌(即非轉(zhuǎn)化菌)；"+cptsi K "代表用包含編碼人K抗體片段的密碼子優(yōu)化基因、ORFC啟動子和終止子以及Secl信號肽的載體轉(zhuǎn)化的裂殖壺菌。圖18B為轉(zhuǎn)化了 cptSl K質(zhì)粒的裂殖壺菌的培養(yǎng)物上清液中的總蛋白質(zhì)累積(蛋白質(zhì)由Bradford法測定)和抗體k鏈(通過ELISA測定)。圖19為裂殖壺菌EFl短啟動子的多核苷酸系列(SEQ ID NO 42)。圖20為裂殖壺菌EFl長啟動子的多核苷酸系列(SEQ ID NO 43)。圖21為裂殖壺菌60S短啟動子的多核苷酸系列(SEQ ID NO 44)。圖22為裂殖壺菌60S長啟動子的多核苷酸系列(SEQ ID NO 45)。圖23為裂殖壺菌Secl啟動子的多核苷酸系列(SEQ ID NO 46)。圖24為pABOO 11的質(zhì)粒圖。圖25為pABOO 18的質(zhì)粒圖。
圖26為pAB0022的質(zhì)粒圖。圖27為無細胞上清液樣品中eGFP的蛋白質(zhì)印跡圖，所述樣品來自分別轉(zhuǎn)化了含有EFl啟動子(短形式)、EF1啟動子(長形式)、60S啟動子(短形式)、60S啟動子(長形式)、SECl啟動子和OrfC啟動子驅(qū)動的eGFP基因的表達載體的裂殖壺菌的培養(yǎng)物。
圖28 為與 OrfC 啟動子(pCLOOOl-4)或 EFl-L 啟動子(AB0018-9 和-10)驅(qū)動 eGFP表達有關(guān)的轉(zhuǎn)化體細胞系的熒光顯微圖。圖29為裂殖壺菌天然分泌的蛋白質(zhì)的N-聚糖結(jié)構(gòu)圖，N-聚糖結(jié)構(gòu)由NSI-全面MS法分析全甲基化N-聚糖得到。圖30為裂殖壺菌天然分泌的蛋白質(zhì)的N-聚糖結(jié)構(gòu)圖，N-聚糖結(jié)構(gòu)由NSI-總離子圖譜法分析全甲基化N-聚糖得到。圖31 為 pSchiz-EPCT(+)-slSuc2_CL0076(又稱 pCL0076)的質(zhì)粒圖。圖32為細胞沉淀干重(g/L)結(jié)果，所述細胞沉淀來自在蔗糖-SSFM上培養(yǎng)的、轉(zhuǎn)化了 pCL0076質(zhì)粒的ATCC編號為20888的裂殖壺菌培養(yǎng)物。轉(zhuǎn)化子被標(biāo)為1_1、1_3、1_24、3-1、3-2、3-5、3-21、4-1、4-24和4-310 “對照”為在蔗糖-SSFM中培養(yǎng)的的ATCC編號為20888的野生型裂殖壺菌細胞。圖33為細胞沉淀的脂肪含量(表示為生物質(zhì)干重的％ )，細胞沉淀來自在蔗糖-SSFM中培養(yǎng)的、轉(zhuǎn)化了 pCL0076質(zhì)粒的ATCC編號為20888的裂殖壺菌培養(yǎng)物。轉(zhuǎn)化子被標(biāo)為 1-1、1-3、1-24、3-1、3-2、3-5、3-21、4-1、4-24 和 4-310 “對照”為在蔗糖-SSFM 中培養(yǎng)的ATCC編號為20888的野生型裂殖壺菌。圖34為隨時間測量的細胞沉淀干重(g/L)，細胞沉淀來自在蔗糖-SSFM中培養(yǎng)的、轉(zhuǎn)化了 pCL0076質(zhì)粒的ATCC編號為20888的裂殖壺菌培養(yǎng)物。轉(zhuǎn)化子被標(biāo)為1_3和3_5。“對照”為在蔗糖-SSFM中培養(yǎng)的ATCC編號為20888的野生型裂殖壺菌。圖35為細胞沉淀脂肪含量(表示為生物質(zhì)干重的％)，細胞沉淀來自在蔗糖-SSFM中培養(yǎng)的兩個轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物。所述轉(zhuǎn)化體被標(biāo)為1-3和3-5?！皩φ铡睘樵谡崽?SSFM中培養(yǎng)的ATCC編號為20888的野生型裂殖壺菌。圖36為細胞沉淀干重(g/L)，細胞沉淀來自在蔗糖-SSFM中培養(yǎng)2天或I天后收獲的、轉(zhuǎn)化了 PCL0076質(zhì)粒的裂殖壺菌菌株B76-32的培養(yǎng)物；"2118*"代表在蔗糖-SSFM上培養(yǎng)的ATCC編號為20888的野生型裂殖壺菌細胞的亞分離物；"B76-32#"代表在蔗糖-SSFM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的親代菌株B76-32。圖37為細胞沉淀脂肪含量，細胞沉淀來自在蔗糖-SSFM中培養(yǎng)2天或7天后收獲的、轉(zhuǎn)化了 PCL0076質(zhì)粒的裂殖壺菌菌株B76-32的培養(yǎng)物。每個樣品最右邊的柱形代表了脂肪含量占生物質(zhì)干重的％，每個樣品最左邊的柱形代表由18個或更少碳原子(淺灰色)或者20個或更多碳原子(中等灰色)的?；M成脂肪占總脂肪的％。" 2118*"代表在蔗糖-SSFM上培養(yǎng)的ATCC編號為20888的野生型裂殖壺菌的亞分離物；"B76-32#"代表在蔗糖-SSFM培養(yǎng)基上培養(yǎng)的親代菌株B76-32。圖38A和38B分別為轉(zhuǎn)化酶的蛋白質(zhì)印跡圖和相應(yīng)考馬斯藍染色的SDS-PAGE凝膠。釀酒酵母(S. cerevisiae)轉(zhuǎn)化酶對照和pCL0076轉(zhuǎn)化體1_3的3天培養(yǎng)物的無細胞上清液上樣量分別為5 ii g、2. 5 ii g、I. 25 ii g和0. 625 u g，如蛋白質(zhì)印跡圖頂部所示。圖39A為用反應(yīng)速率與蔗糖濃度表示的轉(zhuǎn)化酶的活性實驗結(jié)果。圖39B為用于計算Km和V最大值的標(biāo)準(zhǔn)LB (Lineweaver-Burk)圖。圖40A為裂殖壺菌分泌的蛋白質(zhì)的N-聚糖結(jié)構(gòu)圖，N-聚糖結(jié)構(gòu)由NSI-總離子圖譜法分析全甲基化N-聚糖得到。圖40B為由NSI-總離子圖譜法分析全甲基化N-聚糖得到的聚糖種類的表格。圖41A和41B為使用SignalP算法預(yù)測的裂殖壺菌的天然信號序列。參考，例如，Bendsten 等，J. Mol. Biol. 340 :783-795(2004) ;Nielsen和 Krogh,Proc. Int. Conf. Intell.Syst. Mol. Biol. 6 :122-130 (1998) ；Nielsen 等，Protein Engineering 12:3-9(1999)；Emanuelsson 等，Nature Protocols 2:953-971 (2007)。圖42為裂殖壺菌密碼子使用表。圖43為pCL0120的質(zhì)粒圖。
圖44為經(jīng)過密碼子優(yōu)化的、編碼融合于黑曲霉(Aspergillus nigar)的成熟Sucl轉(zhuǎn)化酶(GenBank登錄號為S33920)的裂殖壺菌Secl信號肽的核酸序列(SEQ ID NO 75)。圖45 為 pCL0137_EPCT(+)-slSucl (又稱 pCLOl37)的質(zhì)粒圖。發(fā)明詳述網(wǎng)粘菌門(Labyrinthulomycota)成員，如裂殖壺菌屬(Schizochytrium)、破囊壺菌屬(Thraustochytrium)和其他破囊壺菌,都是能通過傳統(tǒng)的分泌途徑加工多肽的真核生物。與CHO細胞相比，這些微生物產(chǎn)生的大量分泌蛋白質(zhì)的種類要少得多，導(dǎo)致采用裂殖壺菌比CHO細胞有很大優(yōu)勢。此外，與大腸桿菌(E. coli)不同，網(wǎng)粘菌門成員如裂殖壺菌，還有蛋白質(zhì)糖基化功能，比如N連接的糖基化功能，這對某些蛋白質(zhì)的活性來說是必需的。已確定，破囊壺菌如裂殖壺菌屬的這種N連接的糖基化功能比酵母糖基化更接近哺乳動物的糖基化模式。重組蛋白質(zhì)的有效生產(chǎn)也包括⑴轉(zhuǎn)化所選宿主細胞的方法；⑵選擇轉(zhuǎn)化體的選擇標(biāo)記；(3)包含在特定的宿主細胞內(nèi)起作用的調(diào)控元件的表達盒。這些調(diào)控元件包括對控制多核苷酸序列表達至關(guān)重要的啟動子和終止子序列。本發(fā)明所述的調(diào)節(jié)元件、調(diào)控元件和調(diào)控序列等術(shù)語可以互換使用，包括但不限于啟動子、增強子、轉(zhuǎn)錄終止子、信號序列、核糖體結(jié)合位點、阻抑物結(jié)合位點、莖環(huán)結(jié)構(gòu)、內(nèi)含子剪接位點的序列/或分子。如果需要蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中，也可利用指導(dǎo)蛋白質(zhì)分泌的信號肽(也稱為信號序列、分泌信號肽或前導(dǎo)序列)。宿主細胞本發(fā)明涉及用網(wǎng)粘菌門微生物的宿主細胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)。在一些實施方式中，網(wǎng)粘菌門的宿主細胞用作生產(chǎn)蛋白質(zhì)的生物工廠。在一些實施方式中，重組的網(wǎng)粘菌門宿主細胞是破囊壺菌，如裂殖壺菌屬(Schizochytrium)或破囊壺菌屬(Thraustochytrium)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“破囊壺菌”指所有的破囊壺菌目(Thraustochytriales)微生物,包括破囊壺菌科(Thraustochytriaceae)微生物；術(shù)語“網(wǎng)粘菌”指所有的網(wǎng)粘菌目(Labyrinthulales)微生物，包括網(wǎng)粘菌科(Labyrinthulaceae)微生物。網(wǎng)粘菌科微生物原先被認為是破囊壺菌目微生物,但最近的分類學(xué)更正將網(wǎng)粘菌科認定為網(wǎng)粘菌目中的成員。不管是網(wǎng)粘菌目還是破囊壺菌目都是網(wǎng)粘菌門的成員，分類學(xué)家通常把這兩類微生物與原生藻菌(Stramenopile)譜系中的藻類或藻樣原生生物放在一起。目前分類學(xué)上關(guān)于破囊壺菌和網(wǎng)粘菌的分類可以概括如下
界管毛生物界(Stramenopila)(假菌界(Chromista))門網(wǎng)粘菌門(Labyrinthulomycota)(不等毛門(Heterokonta))綱網(wǎng)粘菌綱(Labyrinthulomycetes)目網(wǎng)粘菌目(Labyrinthulales)科網(wǎng)粘菌科(Labyrinthulaceae)目破囊壺菌目(Thraustochytriales)科破囊壺菌科(Thraustochytriaceae)為了更好地說明本發(fā)明、描述為破囊壺菌的菌株包括下列生物破囊壺菌 目、破囊壺菌科、破囊壺菌屬(種阿迪門多(arudimentale)、奧雷姆(aureum)、碧席考拉(benthicola)、格羅波(globosum)、凱尼(kinnei)、摩迪(motivum)、茂迪待(multirudimentale)、派凱(pachydermum)、普羅弗(proliferum)、羅素(roseum)、斯托特(sttriatum))，吾肯氏壺菌屬(Ulkenia)(種埃摩拜迪(amoeboidea)、科格尼斯(kerguelensis)、米鈕塔(minuta)、普羅弗達(profunda)、雷迪安(radiata)、塞侖(sailens)、賽卡瑞那(sarkariana)、斯佐凱(schizochytrops)、維格斯(visurgensis)、優(yōu)克尼斯(yorkensis))，裂殖壺菌屬(種黃金石斛(aggregatum)、黎姆萘瑟(Iimnaceum)、芒格(mangrovei)、迷你藻(minutum)、歐托(octosporum))，日本壺菌屬(Japonochytrium)(種麥尼(marinum))，阿爾托尼氏壺菌屬(Althornia)(種克勞迪(crouchii))或埃氏壺菌屬(Elina)(種瑪瑞薩(marisalba)和欣諾瑞弗卡(sinorifica))。出于本發(fā)明目的，吾肯氏壺菌屬內(nèi)的種將被認為是破囊壺菌屬的成員。奧蘭蒂克屬(Aurantiacochytrium)和奧羅格屬(Oblogospora)是本發(fā)明網(wǎng)粘菌門內(nèi)包括的另外兩個屬。本發(fā)明描述為網(wǎng)粘菌的菌株包括下列微生物網(wǎng)粘菌目，網(wǎng)粘菌科，網(wǎng)粘菌屬(Labyrinthula)(種埃格瑞尼(algeriensis)、考諾賽斯(coenocystis)、查托尼(chattonii)、瑪克賽斯(macrocystis)、大西洋瑪克賽斯(macrocystis atlantica)、雙重瑪克賽斯(macrocystis macrocystis)、瑪瑞那(marina)、邁紐塔(minuta)、羅斯科弗尼(roscoffensis)、凡卡諾維(valkanovii)、維麗那(vitellina)、太平洋維麗那(vitellina pacifica)，雙重維 _ 那(vitellina vitellina)、佐普菲(zopfi)，拉普利諾屬(Labyrinthuloides)(種海羅迪(haliotidis)、優(yōu)克尼斯(yorkensis))，拉比粘菌屬(Labyrinthomyxa)(種瑪麗娜(marina))，戴普羅弗屬(Diplophrys)(種阿凱瑞(archeri))，皮霍索屬(Pyrrhosorus)(種包括瑪瑞紐斯(marinus))，索羅迪普羅屬(Sorodiplophrys)(種斯特考瑞(stercorea))以及克萊米多屬(Chlamydomyxa)(種拉普利諾(Iabyrinthuloides)、蒙塔那(montana))(但目前學(xué)術(shù)界對索羅迪普羅屬、皮霍索屬和克萊米多屬的準(zhǔn)確分類學(xué)地位還沒有達成一致)。網(wǎng)粘菌門的宿主細胞包括但不限于以下保藏菌株P(guān)TA-10212、PTA-10213、PTA-10214、 PTA-10215、 PTA-9695、 PTA-9696、 PTA-9697、 PTA-9698、 PTA-10208、PTA-10209、PTA-10210、PTA-10211，保藏為SAM2179的微生物(保藏者將其命名為吾肯氏壺菌SAM2179)、破囊壺菌屬的任何種(包括曾劃歸于吾肯氏壺菌屬的維格斯吾肯氏壺菌(U. visurgensis)、埃摩拜迪吾肯氏壺菌(U. amoeboida)、賽卡瑞那吾肯氏壺菌(U. sarkariana)、普羅弗達吾肯氏壺菌(U. profunda)、雷迪安吾肯氏壺菌(U radiata)、米鈕塔吾肯氏壺菌(U. minuta)和吾肯氏壺菌BP-5601等微生物)以及斯托特破囊壺菌(Thraustochytrium striatum)、奧雷姆破囊壺菌(Thraustochytrium aureum)、羅素破囊壺菌(Thraustochytrium roseum);以及日本壺菌屬(Japonochytrium)任何種的微生物。破囊壺菌目包括但不限于以下破囊壺菌(23B) (ATCC 20891);斯托特破囊壺菌(施奈德(Schneider)) (ATCC 24473);奧雷姆破囊壺菌(戈爾茨坦(Goldstein)) (ATCC 34304);羅素破囊壺菌(戈爾茨坦)(ATCC 28210);和日本壺菌(LI) (ATCC 28207)。裂殖壺菌屬包括但不限于黃金石斛裂殖壺菌、利馬昔努裂殖壺菌(Schizochytrium Iimacinum)、裂殖壺菌(S31) (ATCC 20888)、裂殖壺菌(S8) (ATCC 20889)、裂殖壺菌(LC-RM) (ATCC 18915)、裂殖壺菌(SR21)、保藏的ATCC 28209菌株和保藏的利馬昔努裂殖壺菌菌株IFO 32693。在一些實施方式中，宿主細胞是裂殖壺菌屬或破囊壺菌屬。裂殖壺菌屬既能以連續(xù)二分的方式繁殖，也能以形成孢子囊的形式繁殖，而破囊壺菌屬只能以形成孢子囊的形式繁殖。在一些實施方式中，本發(fā)明宿主細胞是重組的宿主細胞。本發(fā)明宿主細胞的有效培養(yǎng)條件包括但不限于允許產(chǎn)生蛋白質(zhì)和/或重組的有效培養(yǎng)基、生物反應(yīng)器、溫度、PH和氧氣條件。有效培養(yǎng)基指通常培養(yǎng)破囊壺菌目細胞，如 裂殖壺菌屬宿主細胞的任何培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基通常包括具有可同化的碳、氮和磷酸鹽來源，以及合適的鹽、礦物質(zhì)、金屬和其它營養(yǎng)素如維生素的水性培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的非限制性例子可參見實施例部分。適合破囊壺菌目微生物的非限制性培養(yǎng)條件也可參見美國專利號5，340，742，通過引用全文納入本文?？梢栽诔Ｒ?guī)的發(fā)酵生物反應(yīng)器、搖瓶、試管、微量滴定皿和皮氏培養(yǎng)板中培養(yǎng)本發(fā)明細胞?？梢栽谶m合重組細胞的溫度、pH和氧氣含量下進行培養(yǎng)。在一些實施方式中，本發(fā)明的網(wǎng)粘菌門宿主細胞包含含有編碼選擇標(biāo)記物的核酸序列的重組載體。在一些實施方式中，所述選擇標(biāo)記物可用于選擇轉(zhuǎn)化的微生物。顯性選擇標(biāo)記物的例子包括降解具有抗生素或殺真菌活性的化合物的酶，例如，來自印度斯坦鏈異壁菌(Steptoalloteichus hindustanus)的Sh ble基因,其編碼“博來霉素結(jié)合蛋白”，由SEQ ID N0:5表示。在一些實施方式中，編碼顯性選擇標(biāo)記物的核酸序列包含破囊壺菌乙酰乳酸合酶序列，如多核苷酸序列SEQ ID NO :6的突變形式。在一些實施方式中，已經(jīng)修飾、突變或選擇了乙酰乳酸合酶，以使其對磺酰脲化合物、咪唑并啉酮類抑制劑和/或嘧啶基氧基苯甲酸酯的抑制作用產(chǎn)生抗性。在一些實施方式中，乙酰乳酸合酶是天然產(chǎn)生的乙酰乳酸合酶的同源物。在一些實施方式中，用包含乙酰乳酸合酶的重組載體轉(zhuǎn)染的破囊壺菌微生物對硫脲化合物、咪唑啉酮類抑制劑和/或嘧啶基氧基苯甲酸酯的敏感性降低。在一些實施方式中，所述重組載體包含編碼乙酰乳酸合酶蛋白的核酸序列，所述乙酰乳酸合酶蛋白包含在以下一個或多個位置上發(fā)生氨基酸缺失、插入或取代的不同于SEQ ID N0:7 的氨基酸序列116G、117A、192P、200A、251K、358M、383D、592V、595W 或 599F。在一些實施方式中，突變的乙酰乳酸合酶蛋白具有選自下組的氨基酸序列SEQ ID NO 8,SEQ ID NO :9和SEQ ID NO 10o在一些實施方式中，所述重組載體包含與SEQ ID NO :7、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO :9 或 SEQ ID NO :10 至少約 70%、至少約 75%、至少約 80%、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98 %或至少約99 %相同的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列編碼至少在破囊壺菌中用作顯性選擇標(biāo)記物的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述重組載體包含編碼SEQ ID NO :7的功能性片段的多核苷酸序列，所述功能性片段至少在破囊壺菌中用作顯性選擇標(biāo)記物。在一些實施方式中，所述重組載體包含選自下組的多核苷酸序列SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :12和SEQ ID NO:13。本發(fā)明用術(shù)語“轉(zhuǎn)化”表示可將外源核酸分子(即重組核酸分子)插入微生物細胞的任何方法。在微生物系統(tǒng)中，用術(shù)語“轉(zhuǎn)化”表示微生物獲得外源核酸引起的遺傳改變，其基本與術(shù)語“轉(zhuǎn)染”同義。適合將外源核酸分子引入網(wǎng)粘菌門宿主細胞的轉(zhuǎn)化技術(shù)包括但不限于粒子轟擊、電穿孔、顯微注射、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、吸附、感染和原生質(zhì)體融合。在一些實施方式中，將外源核酸分子，包括重組載體引入處于靜止期的微生物細胞。在一些實施方式中，將外源核酸分子，包括重組載體引入處于指數(shù)生長期的微生物細胞。在一些實施方式中，當(dāng)600nm光密度達到I. 5至2時，將外源核酸分子，包括重組載體引入細胞。本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)化宿主細胞的方法，包括(a)用具有蛋白酶活性的酶預(yù)處理所述宿主細胞，和(b)通過電穿孔.將核酸分子引入所述宿主細胞。在一些實施方式中，與電穿孔之前不用酶預(yù)處理相比，用酶預(yù)處理能提高宿主細胞的轉(zhuǎn)化效率。所述酶包括但不限于與蝸牛丙酮粉(snail acetone powder)有關(guān)的酶活性、蛋白酶IX、蛋白酶XIV、硫酸酯酶，^ -葡糖醛酸糖苷酶和其組合。在一些實施方式中，用約0. 05mg/ml、約0. lmg/ml、約0. 15mg/ml、約 0. 2mg/ml、約 0. 25mg/ml、約 0. 3mg/ml、約 0. 4mg/ml、約 0. 5mg/ml、約 0. 6mg/ml、0. 7mg/ml、0. 8mg/ml、0. 9mg/ml或約lmg/ml蝸牛丙酮粉、蛋白酶IX、蛋白酶XIV或其組合預(yù)處理宿主細胞。在一些實施方式中，用約0. 05mg/ml至約lmg/ml、約0. lmg/ml至約lmg/ml、約0. lmg/ml至約0. 5mg/ml、或約0. 05mg/ml至約0. 5mg/ml的蝸牛丙酮粉、蛋白酶IX、蛋白酶XIV或其組合處理宿主細胞。在一些實施方式中，用0. 05X、0. 1X、0. 2X、0. 3X、0. 4X、0. 5X、0. 6X、0. 7X、0. 8X、0. 9X或IX硫酸酯酶、P -葡糖醛酸糖苷酶或其組合處理宿主細胞。在一些實施方式中，用約0. 05X至約IX、約0. IX至約IX、約0. IX至約0. 5X或約0.05X至約0.5X硫酸酯酶、3 -葡糖醛酸糖苷酶或其組合處理宿主細胞。在一些實施方式中，蛋白酶預(yù)處理包括用任何上述濃度的蛋白酶IX、蛋白酶XIV、蝸牛丙酮粉末、硫酸酯酶、
葡糖醛酸糖苷酶或其組合預(yù)處理。在一些實施方式中，在0. Icm或0. 2cm的小管間隙距離上使用約100V至約500V的電壓進行電穿孔。在一些實施方式中，在0. Icm或0. 2cm的小管間隙距離上使用約100V、150V、200V、250V、300V、350V、400V、450V* 500V的電壓進行電穿孔。在本發(fā)明的一些實施方式中，遺傳修飾宿主細胞，以引入或刪除參與糖運輸和/或糖合成相關(guān)性生物合成途徑，包括糖基化的基因。例如，可通過刪除內(nèi)源性糖基化基因和/或插入人或動物的糖基化基因修飾宿主細胞，以實現(xiàn)更接近人的糖基化模式。酵母糖基化的修飾可參見,例如，美國專利號7，029，872和美國公開號2004/0171826、2004/0230042、2006/0257399、2006/0029604和2006/0040353。本發(fā)明宿主細胞也包括用RNA病毒元件提高或調(diào)節(jié)基因表達的細胞。表達系統(tǒng)
在一些實施方式中，用于在宿主細胞中表達蛋白質(zhì)的本發(fā)明表達系統(tǒng)包括在藻類細胞中有活性的調(diào)節(jié)控制元件。在一些實施方式中，本發(fā)明表達系統(tǒng)包括在網(wǎng)粘菌門細胞中有活性的調(diào)節(jié)控制元件。在一些實施方式中，本發(fā)明表達系統(tǒng)包括在破囊壺菌中有活性的調(diào)節(jié)控制元件。在一些實施方式中，本發(fā)明表達系統(tǒng)包括在裂殖壺菌屬或破囊壺菌屬中有活性的調(diào)節(jié)控制元件。許多藻類調(diào)節(jié)控制元件，包括各種啟動子，在多種物種中有活性。因此，作為本發(fā)明某方面公開的新型調(diào)節(jié)序列可用于與分離它們的細胞相同的細胞類型，或者可用于與分離它們的細胞不同的細胞類型。這種表達盒的設(shè)計和構(gòu)建采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)。參見例如，Samtoook等，2001，《分子克隆實驗室手冊》(Molecular Cloning A Laboratory Manual),第 3 版。在一些實施方式中，用于在網(wǎng)粘囷丨]細胞中廣生蛋白質(zhì)的表達系統(tǒng)包括衍生自網(wǎng)粘囷I ]序列的調(diào)控兀件。在一些實施方式中，用于在網(wǎng)粘囷丨]細胞中廣生蛋白質(zhì)的表達系統(tǒng)包括衍生自非網(wǎng)粘菌門序列的調(diào)控元件，包括衍生自非網(wǎng)粘菌門藻類序列的序列。在一些實施方式中，本發(fā)明表達系統(tǒng)包括編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列與在網(wǎng)粘菌門宿主細胞中有功能的任何啟動子序列、任何終止子序列和/或任何其它調(diào)節(jié)序列相關(guān)聯(lián)?？刹捎谜T導(dǎo)性或組成性活性序列。合適的調(diào)節(jié)控制元件也包括與本文所述核酸分子相關(guān)聯(lián)的任何調(diào)節(jié)控制元件。 本發(fā)明也涉及一種用于在宿主細胞中表達蛋白質(zhì)的表達盒。本發(fā)明也涉及包含用于在宿主細胞中表達蛋白質(zhì)的表達盒的任何上述宿主細胞。在一些實施方式中，所述表達系統(tǒng)包括含有操作性連接以使其在宿主細胞中有功能的遺傳元件，如至少含有啟動子、編碼序列和終止子區(qū)的表達盒。在一些實施方式中，表達盒包括本文所述的本發(fā)明分離核酸分子中的至少一種。在一些實施方式中，表達盒的所有遺傳兀件是與分尚核酸分子相關(guān)聯(lián)的序列。在一些實施方式中，所述控制序列是誘導(dǎo)性序列。在一些實施方式中，將編碼蛋白質(zhì)的核酸序列整合到宿主細胞基因組中。在一些實施方式中，將編碼蛋白質(zhì)的核酸序列穩(wěn)定整合到宿主細胞基因組中。在一些實施方式中，將編碼待表達蛋白質(zhì)的分離核酸序列操作性連接于啟動子序列和/或終止子序列，二者均在所述宿主細胞中有活性。編碼待表達蛋白質(zhì)的分離核酸序列操作性連接的啟動子和/或終止子序列可包括任何啟動子和/或終止子序列，包括但不限于本發(fā)明的新型核酸序列、已授權(quán)美國專利7，001, 772公開的調(diào)控序列、美國公開號2006/0275904和2006/0286650公開的調(diào)控序列或在轉(zhuǎn)化的宿主細胞中有功能的其它調(diào)控序列，它們操作性連接于編碼蛋白質(zhì)的分離多核苷酸序列。在一些實施方式中，為了最大程度提高蛋白質(zhì)翻譯效率，針對網(wǎng)粘菌門宿主細胞對具體編碼蛋白質(zhì)的核酸序列進行密碼子優(yōu)化。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明表達盒的重組載體。重組載體包括但不限于質(zhì)粒、噬菌體和病毒。在一些實施方式中，所述重組載體是線性化載體。在一些實施方式中，所述重組載體是表達載體。本文所用術(shù)語“表達載體”指適合產(chǎn)生編碼產(chǎn)物(如感興趣蛋白質(zhì))的載體。在一些實施方式中，將編碼待產(chǎn)生的產(chǎn)物的核酸序列插入所述重組載體中產(chǎn)生重組核酸分子。將編碼待產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的核酸序列插入載體中，以將該核酸序列操作性連接于載體中的調(diào)節(jié)序列(如破囊壺菌目的啟動子)，使得能夠在該重組微生物內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯該核酸序列。在一些實施方式中，選擇標(biāo)記物，包括本文所述的任何選擇標(biāo)記物使得能夠選擇成功引入本發(fā)明重組核酸分子的重組微生物。在一些實施方式中，通過本發(fā)明重組宿主細胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)包括但不限于治療性蛋白。本文所用術(shù)語“治療性蛋白”包括可用于治療或預(yù)防動物或人的疾病、病癥或失調(diào)的蛋白質(zhì)。術(shù)語“治療”指治療性處理和預(yù)防性或預(yù)防方法，其目的是防止或減緩(緩解)不良生理狀況、疾病或失調(diào)，或獲得有益或所需的臨床結(jié)果。出于本發(fā)明目的，所述有益或所需的臨床結(jié)果包括但不限于與病癥、疾病或失調(diào)有關(guān)的癥狀或體征的緩解；病癥、疾病或失調(diào)的程度減輕；病癥、疾病或失調(diào)的穩(wěn)定(即病癥、疾病或失調(diào)不惡化)；病癥、疾病或失調(diào)的發(fā)病或進展延遲；病癥、疾病或失調(diào)的好轉(zhuǎn)；病癥、疾病或失調(diào)的緩解(部分或完全，可檢測或不可檢測)；病癥、疾病或失調(diào)的增強或改善。治療包括引發(fā)臨床顯著反應(yīng)而不引起過多的副作用。治療也包括與不接受治療的預(yù)計生存期相比延長生存期。在某些實施方式中，治療性蛋白包括但不限于生物活性蛋白質(zhì)，如酶、抗體或抗原性蛋白。在某些實施方式中，治療性蛋白包括但不限于蛋白A、人生長激素、干擾素、抑肽酶、人a抗胰蛋白酶、親脂性蛋白、人血清白蛋白、谷氨酸脫羧酶、胃脂肪酶、乳鐵蛋白/溶菌酶、轉(zhuǎn)化酶、抗體(包括但不限于=VEGF單克隆抗體(艾瓦斯汀(AVASTIN) )和HER2單克隆抗體(賀賽汀(HERCEPTIN) ))、人疫苗、動物疫苗和動物治療劑。在一些實施方式中，通過本發(fā)明重組宿主細胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)包括但不限于工業(yè)酶。工業(yè)酶包括但不限于用于生產(chǎn)、制備、保存、營養(yǎng)固定或加工某些產(chǎn)品，包括食品、醫(yī)療產(chǎn)品、化學(xué)品、機械產(chǎn)品和其它工業(yè)產(chǎn)品的酶。工業(yè)酶包括但不限于a淀粉酶、a-半乳糖苷酶、3 -淀粉酶、纖維素、3 -葡聚糖酶、右旋糖苷酶、糊精酶、葡糖淀粉酶、半纖維素酶/戊聚糖酶、木聚糖酶、轉(zhuǎn)化酶、乳糖酶、柚皮苷酶、果膠酶、支鏈淀粉酶、酸性蛋白酶、 堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、氨基肽酶、內(nèi)肽酶(胰蛋白酶、糜蛋白酶(chemotrypsin)、胃蛋白酶、彈性蛋白酶)、皺胃酶/高血壓蛋白原酶/凝乳酶、枯草桿菌蛋白酶(subtilism)、嗜熱菌蛋白酶、氨基?；?、谷氨酰胺酶、溶菌酶、青霉素酰化酶、脂酶(triglyceridases)、磷脂酶、前胃酯酶(pregastric esterases)、植酸酶、酰胺酶、異構(gòu)酶、醇脫氫酶、氨基酸氧化酶、過氧化氫酶、氯過氧化物酶、過氧化物酶、乙酰乳酸脫羧酶、天冬氨酸￠-脫羧酶、組氨酸酶、環(huán)式糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、弗洛酶(fromase)、肌醇六磷酸酶和凝乳酶。在一些實施方式中，本發(fā)明重組宿主細胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)包括營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記物、顯性選擇標(biāo)記物(如降解抗生素活性的酶)或參與轉(zhuǎn)化選擇的其它蛋白質(zhì)、用作報道物的蛋白質(zhì)、參與蛋白質(zhì)糖基化的酶和參與細胞代謝的酶。在本發(fā)明的任何實施方式中，本發(fā)明宿主細胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可以是“輸出蛋白質(zhì)”或“異源輸出蛋白質(zhì)”。本文所用的“輸出蛋白質(zhì)”或“異源輸出蛋白質(zhì)”指未參與修飾產(chǎn)生蛋白質(zhì)的宿主細胞的代謝活動并由該宿主細胞產(chǎn)生以便進行后續(xù)分離的異源重組蛋白質(zhì)。本文所用的“輸出蛋白質(zhì)”不包括報道基因編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明重組宿主細胞產(chǎn)生的異源輸出蛋白質(zhì)不包括選擇標(biāo)記物，如零霉素抗性基因(如印度斯坦鏈異壁菌(Steptoalloteichus hindustanus)的ble基因)和大腸桿菌(E. coli)新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(npt)和轉(zhuǎn)座子Tn5,來自土曲霉(Aspergillus terreus)的殺稻瘟素脫氨酶(bsdR)，來自破囊壺菌T23B的PUFA合酶0RFA，來自破囊壺菌T23B的PUFA合酶0RFB，來自破囊壺菌屬T23B的PUFA合酶0RFC，衍生自維多利亞水母(Aequoreavictoria)的合成eGFP,編碼與選自二十二碳六烯酸(DHA)、二十二碳五烯酸(DPA)、二十碳五烯酸(EPA)和花生四烯酸(ARA)的合成脂肪酸相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)的天然基因，脂肪酸合酶，脂肪酸去飽和酶，脂肪酸延長酶，與聚酮化合物合酶復(fù)合物相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)和與將脂肪酸摻入磷脂或三酰基甘油分子相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)， -3脂肪酸去飽和酶，多烯脂肪酸異構(gòu)酶，HMG-CoA合酶，HMG-CoA還原酶，鯊烯合酶，八氫番茄紅素合酶，八氫番茄紅素去飽和酶，類胡蘿卜素環(huán)化酶，類胡蘿卜素羥化酶，類胡蘿卜素酮酶，維生素E和硫辛酸，與類異戊烯生物合成途徑相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)和參與宿主細胞產(chǎn)生多不飽和脂肪酸或類胡蘿卜素的酶。在一些實施方式中,本發(fā)明宿主細胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)是商業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)。商業(yè)規(guī)模包括由尺寸彡100L、彡1，000L、彡10，000L或彡100，000L的通氣發(fā)酵罐培養(yǎng)的微生物產(chǎn)生蛋白質(zhì)。在一些實施方式中，商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)在能夠攪拌的通氣發(fā)酵罐中進行。在一些實施方式中，本發(fā)明宿主細胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可以在細胞內(nèi)累積，或者可以可溶性蛋白質(zhì)的形式從細胞中分泌到(例如)培養(yǎng)基中。
在一些實施方式中，從所述細胞、所述培養(yǎng)基或培養(yǎng)細胞的發(fā)酵培養(yǎng)基中回收本發(fā)明產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。在一些實施方式中，所述蛋白質(zhì)是以可溶蛋白質(zhì)的形式從培養(yǎng)基中回收的分泌蛋白。在一些實施方式中，所述蛋白質(zhì)是包含信號肽的分泌蛋白。在一些實施方式中，本發(fā)明產(chǎn)生的蛋白質(zhì)包含靶向信號，該靶向信號指導(dǎo)其保留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)、指導(dǎo)其分泌到細胞外或?qū)⑵鋵?dǎo)向其它細胞器或細胞隔室。在一些實施方式中，所述蛋白質(zhì)包括信號肽。在一些實施方式中，所述蛋白質(zhì)包括Na/Pi_IIb2轉(zhuǎn)運蛋白信號肽或Sec I轉(zhuǎn)運蛋白。在一些實施方式中，所述信號肽包括氨基酸序列SEQ ID NO :1或SEQ IDN0:37。在一些實施方式中，包含具有氨基酸序列SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :37的信號肽的蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中。在一些實施方式中，在分泌過程中從所述蛋白質(zhì)上切下信號肽，產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的成熟形式。在一些實施方式中，本發(fā)明宿主細胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)是糖基化的。在一些實施方式中，與酵母或大腸桿菌中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)相比，本發(fā)明產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的糖基化模式更接近哺乳動物糖基化模式。在一些實施方式中，本發(fā)明網(wǎng)粘菌門宿主細胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)包含N-連接的糖基化模式。用于治療目的的糖基化蛋白質(zhì)的糖基化模式類似于對象生物體中發(fā)現(xiàn)的糖基化模式時，這種蛋白質(zhì)不大可能刺激抗-糖形免疫應(yīng)答。相反，具有不是對象生物體特征性的連接或糖的糖基化蛋白質(zhì)更可能具有抗原性。可通過特定糖形調(diào)節(jié)效應(yīng)物功能。例如，IgG可介導(dǎo)促炎或抗炎反應(yīng)，這與Fe區(qū)糖形上不存在或存在末端唾液酸相關(guān)聯(lián)(Kaneko等，Science 313(5787) :670-3 (2006))。本發(fā)明還涉及一種產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括在足以表達編碼所述蛋白質(zhì)的多核苷酸序列的條件下培養(yǎng)本發(fā)明重組網(wǎng)粘菌門宿主細胞。在一些實施方式中，所述重組蛋白由所述宿主細胞分泌，并從所述培養(yǎng)基中回收。在一些實施方式中，由所述細胞分泌的蛋白質(zhì)包含分泌信號肽。根據(jù)用于生產(chǎn)的載體和宿主系統(tǒng)，本發(fā)明重組蛋白可保持在重組細胞內(nèi)、分泌到發(fā)酵培養(yǎng)基中、分泌到兩個細胞膜之間的空間內(nèi)、或保留在細胞膜的外表面上。本文所用術(shù)語“回收蛋白質(zhì)”指收集包含蛋白質(zhì)的發(fā)酵培養(yǎng)基，不一定暗含分離和純化等額外步驟。本發(fā)明方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可利用各種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)進行純化，這些技術(shù)例如但不限于親和色譜、離子交換色譜、過濾、電泳、疏水相互作用色譜、凝膠過濾色譜、反相色譜、伴刀豆球蛋白A色譜、色譜聚焦和差異溶解。在一些實施方式中，以“基本純”形式分離本發(fā)明方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。本文所用術(shù)語“基本純”指允許以商業(yè)產(chǎn)品的形式有效利用所述蛋白質(zhì)的純度。在一些實施方式中，所述重組蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)累積，并可從所述細胞回收。在一些實施方式中，所述方法的宿主細胞是破囊壺菌。在一些實施方式中，所述方法的宿主細胞是裂殖壺菌屬或破囊壺菌屬。在一些實施方式中，所述重組蛋白質(zhì)是治療性蛋白質(zhì)、食品酶或工業(yè)酶。在一些實施方式中，重組網(wǎng)粘菌門宿主細胞是裂殖壺菌屬且重組蛋白質(zhì)是包含分泌信號序列的治療性蛋白質(zhì)。
在一些實施方式中，本發(fā)明重組載體是靶向載體。本文所用術(shù)語“靶向載體”指用于將特定核酸分子遞送到重組細胞內(nèi)的載體，其中利用所述核酸分子使宿主細胞的內(nèi)源性基因缺失或失活(即用于靶向基因破壞或敲除技術(shù))。這種載體也稱為“敲除”載體。在一些實施方式中，靶向載體的一部分具有與宿主細胞內(nèi)靶基因(即靶向缺失或失活的基因)的核酸序列同源的核酸序列。在一些實施方式中，插入載體的核酸分子(即插入物)與靶基因同源。在一些實施方式中，經(jīng)設(shè)計，載體插入物的核酸序列能結(jié)合靶基因，以使靶基因和插入物發(fā)生同源重組，從而使內(nèi)源性靶基因缺失、失活或減弱(即至少一部分內(nèi)源性靶基因被突變或缺失)。分離的核酸分子本發(fā)明也涉及可用于在重組宿主細胞中調(diào)節(jié)基因表達和/或指導(dǎo)蛋白質(zhì)分泌的分離的核酸分子或多核苷酸序列。本文所述核酸序列包括可用于調(diào)節(jié)同源或異源蛋白質(zhì)的 轉(zhuǎn)錄和/或分泌的啟動子、終止序列和編碼信號肽的核酸序列。按照本發(fā)明，分離的核酸分子是從其天然環(huán)境取出(即經(jīng)人工操作)的核酸分子，其天然環(huán)境是天然發(fā)現(xiàn)該核酸分子的基因組或染色體。因此，“分離”不一定反映核酸分子的純化程度，但表明該分子不包含天然發(fā)現(xiàn)該核酸分子的完整基因組或完整染色體。分離的核酸分子可包括DNA、RNA (如mRNA)，或者DNA或RNA的衍生物(如cDNA)。雖然術(shù)語“核酸分子”主要指物理的核酸分子，術(shù)語“核酸序列”或“多核苷酸序列”主要指核酸分子的核苷酸序列，但該術(shù)語可互換使用，特別是提到能夠編碼蛋白質(zhì)的核酸分子、多核苷酸序列或核酸序列時。在一些實施方式中，本發(fā)明的分離核酸分子是用重組DNA技術(shù)(如，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增，克隆)或化學(xué)合成產(chǎn)生。分離的核酸分子包括天然核酸分子和其同源物，包括但不限于插入、缺失、取代和/或倒置核苷酸的天然等位基因變體和修飾的核酸分子，這種修飾能對所編碼的肽或蛋白質(zhì)的序列、功能和/或生物學(xué)活性產(chǎn)生所需作用。啟動子序列、終止子序列、信號肽序列或任何其它本發(fā)明序列的核酸序列互補物指與具有啟動子序列、終止子序列、信號肽序列或任何其它本發(fā)明序列的鏈互補的核酸鏈的核酸序列。應(yīng)理解，含有本發(fā)明序列的雙鏈DNA包括單鏈DNA和具有該單鏈DNA的互補序列的互補鏈。同樣，本發(fā)明核酸分子可以是雙鏈或單鏈，包括在“嚴格”雜交條件下與本發(fā)明序列和/或與本發(fā)明序列的互補鏈形成穩(wěn)定雜交體的核酸分子。推倒互補序列的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。術(shù)語“蛋白質(zhì)”包括單鏈多肽分子以及多-多肽復(fù)合物，其中單個組成多肽通過共價或非共價方式連接。術(shù)語“多肽”包括長度為兩個或多個氨基酸，通常大于5、10或20個氨基酸的肽。本發(fā)明的新型核酸分子可用于它們在其中有功能的任何微生物。在一些實施方式中，將核酸分子用于網(wǎng)粘菌門的重組微生物。在一些實施方式中，將重組核酸分子用于破囊壺菌目的重組微生物。在一些實施方式中，將重組核酸分子用于裂殖壺菌目或破囊壺菌目微生物。本文所用的重組微生物具有用重組技術(shù)從其普通(即野生型或天然產(chǎn)生的)形式進一步修飾(即突變或改變)的基因組。本發(fā)明重組微生物可包括插入、缺失或修飾了核酸分子(即通過，例如，插入、缺失、取代和/或倒置核苷酸突變的)微生物，這種遺傳修飾方式能在所述微生物中提供所需效果。在本文中，導(dǎo)致基因表達、基因功能或基因產(chǎn)物(基因編碼的蛋白質(zhì))功能降低的遺傳修飾可稱為基因的失活(完全或部分)、缺失、中斷、阻斷或下調(diào)。例如，基因中導(dǎo)致該基因編碼的蛋白質(zhì)功能降低的遺傳修飾可能是該基因完全缺失(即該重組微生物中不存在該基因，因此該重組微生物中不存在該蛋白)，該基因發(fā)生突變導(dǎo)致不完全或不翻譯蛋白質(zhì)(如不表達蛋白質(zhì))，或該基因發(fā)生突變以降低或消除該蛋白質(zhì)的天然功能(例如，表達活性(如酶的活性或作用)降低或無活性的蛋白質(zhì))的結(jié)果。導(dǎo)致基因表達或功能提高的遺傳修飾可稱為基因的擴增、過度產(chǎn)生、過度表達、活化、增強、增加或上調(diào)。啟動子本發(fā)明也涉及新型調(diào)節(jié)控制元件啟動子。本發(fā)明啟動子是指導(dǎo)相關(guān)編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域。在一些實施方式中，所述啟動子來自網(wǎng)粘菌門微生物。在一些實施方式中，所述啟動子來自破囊壺菌，包括但不限于保藏為SAM2179的微生物(保藏者命名為“吾肯氏壺菌SAM2179”)，吾肯氏壺菌屬或破囊壺菌屬或裂殖壺菌屬的微生物。裂殖壺菌屬包括但不限于黃金石斛裂殖壺菌屬、利馬昔努裂殖壺菌、裂殖壺菌(S31) (ATCC 20888)、裂殖壺菌
(S8)(ATCC 20889)、裂殖壺菌(LC-RM) (ATCC 18915)、裂殖壺菌(SR21)、保藏的裂殖壺菌菌株ATCC 28209和保藏的裂殖壺菌菌株IFO 32693。本發(fā)明啟動子至少在破囊壺菌中具有啟動子活性，包括天然產(chǎn)生啟動子的全長啟動子序列和其功能性片段、融合序列和其同源物?？衫孟拗菩悦赶景l(fā)明核酸分子，然后用合適的試驗測定啟動子活性必需的最小序列。這類片段本身單獨代表本發(fā)明的實施方式。啟動子的同源物不同于天然產(chǎn)生的啟動子，因為至少一個、兩個、三個或若干個核苷酸被刪除、插入、倒置、取代和/或衍生化。啟動子同源物可至少保留在破囊壺菌中作為啟動子的活性，但可提高、降低或根據(jù)特定刺激改變該活性。本發(fā)明啟動子可包含產(chǎn)生發(fā)育和組織特異性調(diào)控或表達的一個或多個序列元件。在一些實施方式中，本發(fā)明的分離核酸分子包含PUFA PKS OrfC啟動子(“PKSOrfC啟動子”)。本發(fā)明PKS OrfC啟動子是天然位于OrfC編碼區(qū)上游(5,區(qū)方向)并指導(dǎo)OrfC轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域。在一些實施方式中，PKS OrfC啟動子具有多核苷酸序列SEQ IDNO :3。在一些實施方式中，本發(fā)明的分離核酸分子包含與SEQ ID NO :3至少約65%、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列至少在破囊壺菌中具有啟動子活性(即至少對PUFA PKS OrfC序列具有基本啟動子轉(zhuǎn)錄活性)?？梢栽谥辽?0、至少20、至少30、至少40、至少50、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少1000、至少1500個核苷酸的序列，或整個序列上發(fā)現(xiàn)同源性(或相同性％ )。本發(fā)明也涉及包含與SEQ ID NO :3或與SEQ ID NO :3至少95%相同的多核苷酸序列雜交的多核苷酸序列的分尚核酸分子。在一些實施方式中，所述分尚的核酸分子包含與SEQ ID NO :3或與SEQ ID NO :3至少95%相同的多核苷酸序列完全互補的多核苷酸序列。在一些實施方式中，本發(fā)明PKS OrfC啟動子包括與天然產(chǎn)生的PKS OrfC啟動子序列足夠相似的PKS OrfC啟動子同源物，所述同源物的核酸序列在中等、高度或極高嚴格條件下(如下所述)能夠與天然產(chǎn)生PKS OrfC啟動子的核酸序列的互補物雜交。在一些實施方式中，本發(fā)明PUFA PKS OrfC啟動子序列在中等、高度或極高嚴格條件下與SEQ ID NO 3的互補物雜交。
在一些實施方式中，本發(fā)明啟動子包括以ATCC登錄號PTA-9615保藏的pCLOOOl的OrfC啟動子。在一些實施方式中，本發(fā)明的分離核酸分子包含EFl短啟動子(“EF1短”或“EF1-S”啟動子)或EFl長啟動子(“EF1長”或“EF1-L”啟動子)。本發(fā)明的EFl短或長啟動子是天然位于EFl編碼區(qū)上游(5'區(qū)方向)并指導(dǎo)EFl轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域。在一些實施方式中，EFl短啟動子具有多核苷酸序列SEQ ID NO 420在一些實施方式中，EFl長啟動子具有多核苷酸序列SEQ ID NO :43。在一些實施方式中，本發(fā)明的分離核酸分子包含與SEQ IDN0:42或SEQ ID NO :43至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列至少在破囊壺菌中具有啟動子活性(即，至少對EFl短或長啟動子序列具有基本啟動子轉(zhuǎn)錄活性)?？梢栽谥辽?0、至少20、至少30、至少40、至少50、至少100、至少200、至少300、至少400或至少500個核苷酸的序列，或整個序列上發(fā)現(xiàn)同源性(或相同性％)。本發(fā)明也涉及分離的核酸分子，其包含與SEQ ID N0:42和/或SEQ ID N0:43，或者與SEQ ID N0:42和/或SEQ ID NO :43至少95%相同的多核苷酸序列雜交的多核苷酸序列。在一些實施方式中，分離的核酸分子包含與SEQ ID N0:42和/或SEQ ID N0:43，或者與SEQ ID N0:42和/或SEQ ID NO :43至少95%相同的多核苷酸序列完全互補的多核苷酸序列。在一些實施方式中，本發(fā)明的EFl短或EFl長啟動子包括與天然產(chǎn)生的EFl短和/或長啟動子序列足夠相似的EFl短或長啟動子同源物，所述同源物的核酸序列在中等、高度或極高嚴格條件下(如下所述)能夠分別與天然產(chǎn)生的EFl短和/或長啟動子的核酸序列的互補物雜交。在一些實施方式中，本發(fā)明的EFl短和/或長啟動子序列在中等、高度或極高嚴格條件下分別與SEQ ID NO 42和/或SEQ ID NO 43的互補物雜交。在一些實施方式中，本發(fā)明啟動子包括以ATCC登錄號PTA-9616保藏的pABOO 18的EFl長啟動子。在一些實施方式中，本發(fā)明的分離核酸分子包含60S短啟動子(“60S短”或“60S-S”啟動子)或60S長啟動子(“60S長”或“60S-L”啟動子)。本發(fā)明的60S短或長啟動子是天然位于60S編碼區(qū)上游(5'區(qū)方向)并指導(dǎo)60S轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域。在一些實施方式中，60S短啟動子具有多核苷酸序列SEQ ID NO 440在一些實施方式中，60S長啟動子具有多核苷酸序列SEQ ID NO :45。在一些實施方式中，本發(fā)明的分離核酸分子包含與SEQ IDN0:44或SEQ ID NO :45至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列至少在破囊壺菌中具有啟動子活性(即，至少對60S短或長啟動子序列具有基本啟動子轉(zhuǎn)錄活性)?？梢栽谥辽?0、至少20、至少30、至少40、至少50、至少100、至少200、至少300、至少400或至少500個核苷酸的序列，或整個序列上發(fā)現(xiàn)同源性(或相同性％)。本發(fā)明也涉及分離的核酸分子，其包含與SEQ ID N0:44和/或SEQ ID N0:45，或者與SEQ ID N0:44和/或SEQ ID NO :45至少95%相同的多核苷酸序列雜交的多核苷酸序列。在一些實施方式中，分離的核酸分子包含與SEQ ID N0:44和/或SEQ ID N0:45，或者與SEQ ID N0:44和/或SEQ ID NO :45至少95%相同的多核苷酸序列完全互補的多核、苷酸序列。在一些實施方式中，本發(fā)明的60S短或60S長啟動子包括與天然產(chǎn)生的60S短或60S長啟動子序列足夠相似的60S短或60S長啟動子同源物，所述同源物的核酸序列在中等、高度或極高嚴格條件下(如下所述)能夠分別與天然產(chǎn)生的60S短和/或60S長啟動子的核酸序列的互補物雜交。在一些實施方式中，本發(fā)明的60S短和/或60S長啟動子序列在中等、高度或極高嚴格條件下分別與SEQ ID N0:44和/或SEQ ID NO :45的互補物雜父。在一些實施方式中，本發(fā)明啟動子包括以ATCC登錄號PTA-9614保藏的pABOO 11的60S長啟動子。在一些實施方式中，本發(fā)明的分離核酸分子包含Secl啟動子(“Seel啟動子”)。本發(fā)明Secl啟動子是天然位于Secl編碼區(qū)上游(5'區(qū)方向)并指導(dǎo)Secl轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域。在一些實施方式中，Secl啟動子具有多核苷酸序列SEQ ID NO :46。在一些實施方式中，本發(fā)明的分離核酸分子包含與SEQ ID NO :46至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列至少在破囊壺菌中具有啟動子 活性(即至少對Secl序列具有基本啟動子轉(zhuǎn)錄活性)?？梢栽谥辽?0、至少20、至少30、至少40、至少50、至少100、至少200、至少300、至少400或至少500個核苷酸的序列，或整個序列上發(fā)現(xiàn)同源性(或相同性％)。本發(fā)明也涉及包含與SEQ ID N0:46或與SEQ ID NO :46至少95%相同的多核苷酸序列雜交的多核苷酸序列的分尚核酸分子。在一些實施方式中，所述分尚的核酸分子包含與SEQ ID N0:46或與SEQ ID NO :46至少95%相同的多核苷酸序列完全互補的多核苷酸序列。在一些實施方式中，本發(fā)明Secl啟動子包括與天然產(chǎn)生的Secl啟動子序列足夠相似的Secl啟動子同源物，所述同源物的核酸序列在中等、高度或極高嚴格條件下(如下所述)能夠與天然產(chǎn)生Secl啟動子的核酸序列的互補物雜交。在一些實施方式中，本發(fā)明Secl啟動子序列在中等、高度或極高嚴格條件下與SEQ ID NO 46的互補物雜交。在一些實施方式中，本發(fā)明啟動子包括以ATCC登錄號PTA-9613保藏的pAB0022的Secl啟動子。終止子本發(fā)明也涉及作為轉(zhuǎn)錄終止子的新型調(diào)控元件。本發(fā)明的終止子區(qū)是在基因組DNA中為轉(zhuǎn)錄標(biāo)出基因序列末端的遺傳序列區(qū)段。在一些實施方式中，所述終止子區(qū)來自網(wǎng)粘菌門微生物。在一些實施方式中，所述終止子區(qū)來自破囊壺菌。在一些實施方式中，所述終止子區(qū)來自裂殖壺菌屬或破囊壺菌屬。裂殖壺菌屬包括但不限于黃金石斛裂殖壺菌屬、利馬昔努裂殖壺菌、裂殖壺菌(S31)(ATCC 20888)、裂殖壺菌(S8) (ATCC 20889)、裂殖壺菌(LC-RM) (ATCC 18915)、裂殖壺菌(SR21)、保藏菌株ATCC 28209和保藏菌株IFO 32693。本發(fā)明終止子區(qū)至少在破囊壺菌中可具有終止子活性，包括天然產(chǎn)生的終止子區(qū)的全長終止子序列和其功能性片段、融合序列和同源物。終止子的同源物不同于天然產(chǎn)生的終止子，因為至少一個或若干，但不限于一個或若干核苷酸被刪除、插入、倒置、取代和/或衍生化。在一些實施方式中，本發(fā)明終止子的同源物至少在破囊壺菌中保持作為終止子區(qū)的活性，但可提高、降低活性或使活性因某些刺激而變。
在一些實施方式中，本發(fā)明包括分離的核酸分子，其包含PUFA PKS OrfC基因的終止子區(qū)(“PKS OrfC終止子區(qū)”)。本發(fā)明的PKS OrfC終止子區(qū)是在基因組DNA中為轉(zhuǎn)錄標(biāo)出OrfC基因序列末端的遺傳序列區(qū)段。在一些實施方式中，終止子區(qū)具有多核苷酸序列SEQ ID N0:4。SEQ ID NO :4所示的終止子區(qū)是來自破囊壺菌微生物的天然產(chǎn)生的(野生型)終止子序列，具體說，是裂殖壺菌屬PKS OrfC終止子區(qū)，稱為“OrfC終止子元件I”。在一些實施方式中，本發(fā)明的分離核酸分子包括與SEQ ID NO :4至少約65%、至少約70%、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98%或至少約99%相同且至少在破囊壺菌中用作PUFA PKS OrfC終止子區(qū)的多核苷酸序列。可以在至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少100、至少150或至少200個核苷酸的序列上，或者在整個序列上發(fā)現(xiàn)同源性(或相同性％ )。本發(fā)明也涉及包含與SEQ ID NO :4或與SEQ ID NO :4至少95%相同的多核苷酸序列雜交的多核苷酸序列的分尚核酸分子。在一些實施方式中，所述分尚的核酸分子包含分離的核酸分子，其包含與SEQ ID NO :4或與SEQ ID NO :4至少95%相同的多核苷酸序列完全互補的多核苷酸序列。在一些實施方式中，本發(fā)明的PKS OrfC終止子區(qū)包括與天然產(chǎn)生的PUFA PKS OrfC終止子區(qū)足夠相似的PKS OrfC終止子區(qū)同源物，所述同源物的核酸序 列在中等、高度或極高嚴格條件下(如下所述)能夠與天然產(chǎn)生的PKS OrfC終止子區(qū)的核酸序列的互補物雜交。在一些實施方式中，PKS OrfC終止子區(qū)序列在中等、高度或極高嚴格條件下與SEQ ID NO 4的互補物雜交。在一些實施方式中，本發(fā)明終止子包括以ATCC登錄號PTA-9614保藏的pABOO 11的OrfC終止子區(qū)。信號肽本發(fā)明也涉及編碼信號肽的新型核酸分子。在一些實施方式中，本發(fā)明涉及分離核酸分子，其包含編碼來自網(wǎng)粘菌門微生物的分泌蛋白的信號肽的多核苷酸序列。在一些實施方式中，所述微生物是破囊壺菌。在一些實施方式中，所述微生物是裂殖壺菌屬或破囊壺菌屬。本發(fā)明信號肽可在破囊壺菌中具有分泌信號活性，并包括天然產(chǎn)生的信號肽的全長肽和其功能片段、融合肽和同源物。信號肽的同源物不同于天然產(chǎn)生的信號肽，因為至少一個或若干，但不限于一個或若干氨基酸被刪除(例如蛋白質(zhì)的截短形式，如肽或片段)、插入、倒置、取代和/或衍生化(如糖基化、磷酸化、乙?；⑷舛罐觉；?、異戊烯化、棕櫚?；?、酰胺化和/或添加糖基磷脂酰肌醇)。在一些實施方式中，信號肽的同源物至少在破囊壺菌中保持信號活性，但可提高、降低活性或使活性因某些刺激而變。在一些實施方式中，分離的核酸分子包含編碼Na/Pi_IIb2轉(zhuǎn)運蛋白信號肽的多核苷酸序列。Na/Pi_IIb2轉(zhuǎn)運蛋白信號肽至少在破囊壺菌中至少對Na/Pi_IIb2轉(zhuǎn)運蛋白可具有信號靶向活性，其包括天然產(chǎn)生的Na/Pi_IIb2轉(zhuǎn)運蛋白信號肽的全長肽和其功能片段、融合肽和同源物。在一些實施方式中，所述Na/Pi_IIb2轉(zhuǎn)運蛋白信號肽具有氨基酸序列SEQ ID N0:1。在一些實施方式中，所述Na/Pi-IIb2轉(zhuǎn)運蛋白信號肽具有氨基酸序列SEQ ID N0:15。在一些實施方式中，本發(fā)明的分離核酸分子包括編碼與SEQ ID N0:1或SEQ ID NO : 15至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98 %或至少約99 %相同的氨基酸序列的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列編碼至少在破囊壺菌中至少對Na/Pi-IIb2轉(zhuǎn)運蛋白而言用作信號肽的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述分離核酸分子包含編碼分離氨基酸序列的多核苷酸序列，所述氨基酸序列包含至少在破囊壺菌中至少對Na/Pi-IIb2轉(zhuǎn)運蛋白而言用作信號肽的SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :15的功能性片段。在一些實施方式中，分離的核酸分子包含SEQ ID NO :2。在一些實施方式中，分離的核酸分子包含與以下任何序列雜交 的多核苷酸序列(i)SEQ ID NO 2 ； (ii)與SEQ ID NO 2至少約60 %、至少約65 %、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98 %或至少約99 %相同的多核苷酸序列；(iii)與編碼SEQ ID NO :1的核酸序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的多核苷酸序列，和(vi)與編碼SEQ ID NO :15的核酸序列至少約60%、至少約65 %、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的多核苷酸序列。在一些實施方式中，分離的核酸分子包含與以下任何序列完全互補的多核苷酸序列(i) SEQ ID NO2 ；
(ii)與SEQ IDNO :2至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98 %或至少約99 %相同的多核苷酸序列與編碼SEQ ID NO :1的核酸序列至少約60%、至少約65%、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的多核苷酸序列，和(vi)與編碼SEQ ID NO:15的核酸序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98 %或至少約99 %相同的多核苷酸序列。本發(fā)明也涉及一種分離多肽，其包含Na/Pi_IIb2轉(zhuǎn)運蛋白信號肽的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述分離的多肽包含選自下組的氨基酸序列(i)SEQ ID NO 1, (ii)SEQ ID N0:15，和(iii)至少在破囊壺菌中至少對Na/Pi-IIb2轉(zhuǎn)運蛋白而言用作信號序列的與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO : 15至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述分離多肽包含SEQ ID N0:15的前 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34 或 35 個氨基酸殘基(即 SEQ ID NO 15，該序列 C 末端的最后 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17 或 18 個氨基酸被刪除)。預(yù)計位于SEQ ID NO: 15的C末端的18個氨基酸是成熟Na/Pi轉(zhuǎn)運蛋白的一部分，預(yù)計所述信號序列的切割位點是在SEQ ID NO: 15的氨基酸殘基35和36之間。然而，本發(fā)明可采用和考慮到至多包含成熟Na/Pi轉(zhuǎn)運蛋白的所有18個氨基酸(即SEQ ID NO 15的最后18個氨基酸殘基)的信號肽。根據(jù)本發(fā)明，分離多肽是從其天然環(huán)境取出(即經(jīng)人工操作)的多肽，可包括(例如)純化的蛋白質(zhì)、純化的肽、部分純化的蛋白質(zhì)、部分純化的肽、重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或肽以及合成產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。因此，“分離”不反映多肽的純化程度。在一些實施方式中，本發(fā)明的分離的Na/Pi-IIb2轉(zhuǎn)運蛋白信號肽是重組產(chǎn)生的。在一些實施方式中，所述分離的核酸分子包含編碼Ct-1，6_甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(ALG12)信號肽的多核苷酸序列。ALG12信號肽至少在破囊壺菌中至少對ALG12蛋白可具有信號靶向活性，其包括天然產(chǎn)生的ALG12信號肽的全長肽和其功能片段、融合肽和同源物。在一些實施方式中，所述ALG12信號肽具有氨基酸序列SEQ ID NO :59。在一些實施方式中，本發(fā)明的分離核酸分子包括編碼與SEQ ID NO :59至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的氨基酸序列的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列編碼至少在破囊壺菌中至少對ALG12蛋白而言用作信號肽的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述分離核酸分子包含編碼分離氨基酸序列的多核苷酸序列，所述氨基酸序列包含至少在破囊壺菌中至少對ALG12蛋白而言用作信號肽的SEQ ID NO :59的功能性片段。在一些實施方式中，分離的核酸分子包含SEQ ID NO :60。在一些實施方式中，分離的核酸分子包含與以下任何序列雜交的多核苷酸序列(i) SEQ ID NO 60 ；(ii)與SEQ ID NO:60至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98 %或至少約99 %相同的多核苷酸序列；和(iii)與編碼SEQ ID NO 59的核酸序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98 %或至少約99 %相同的多核苷酸序列。在一些實施方式中，分離的核酸分子包含 與以下任何序列完全互補的多核苷酸序列(i)SEQ ID NO 60 ；(ii)與SEQ ID NO :60至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的多核苷酸序列；和(iii)與編碼SEQ ID NO :59的核酸序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98%或至少約99%相同的多核苷酸序列。本發(fā)明也涉及一種分離多肽，其包含ALG12信號肽的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述分離的多肽包含選自下組的氨基酸序列(i)SEQ ID NO :59和(ii)至少在破囊壺菌中至少對ALG12蛋白而言用作信號序列的與SEQ ID NO :59至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98 %或至少約99 %相同的氨基酸序列。在一些實施方式中，分離多肽包含SEQ ID NO :59的前24、25、26、27、28、29、30、31或32個氨基酸殘基。在一些實施方式中，本發(fā)明的分離的ALG12信號肽是重組產(chǎn)生的。在一些實施方式中，分離的核酸分子包含編碼結(jié)合性免疫球蛋白(BiP)信號肽的多核苷酸序列。BiP信號肽至少在破囊壺菌中至少對BiP蛋白可具有信號靶向活性，其包括天然產(chǎn)生的BiP信號肽的全長肽和其功能片段、融合肽和同源物。在一些實施方式中，所述BiP信號肽具有氨基酸序列SEQ ID NO :61。在一些實施方式中，本發(fā)明的分離核酸分子包括編碼與SEQ ID NO :61至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98 %或至少約99 %相同的氨基酸序列的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列編碼至少在破囊壺菌中至少對BiP蛋白而言用作信號肽的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述分離核酸分子包含編碼分離氨基酸序列的多核苷酸序列，所述氨基酸序列包含至少在破囊壺菌中至少對BiP蛋白而言用作信號肽的SEQ ID NO :61的功能性片段。在一些實施方式中，分離的核酸分子包含SEQ ID NO :62。在一些實施方式中，分離的核酸分子包含與以下任何序列雜交的多核苷酸序列(i)SEQ ID NO :62 ;(ii)與 SEQ ID NO :62 至少約 60%、至少約 65%、至少約 70%、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98%或至少約99%相同的多核苷酸序列；和(iii)與編碼SEQ ID NO 61的核酸序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的多核苷酸序列。在一些實施方式中，分離的核酸分子包含與以下任何序列完全互補的多核苷酸序列(i)SEQ ID NO :62 ;(ii)與 SEQ ID NO :62 至少約 60%、至少約 65%、至少約 70%、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98%或至少約99%相同的多核苷酸序列；和(iii)與編碼SEQ ID NO 61的核酸序列至少約60 %、至少約65 %、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的多核苷酸序列。本發(fā)明也涉及一種分離多肽，其包含BiP信號肽的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述分離的多肽包含選自下組的氨基酸序列(i)SEQ ID N0:61和(ii)至少在破囊壺菌中至少對BiP蛋白而言用作信號序列的與SEQ ID NO :61至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的氨基酸序列。在一些實施方式中，分離多肽包含SEQ ID NO :61的前23、24、25、26、27、28、29、30或31個氨基酸殘基。在一些實施方式中，本發(fā)明的分離的BiP信號肽是重組產(chǎn)生的。在一些實施方式中，所述分離的核酸分子包含編碼a -I. 3-葡糖苷酶(GLS2)信號肽的多核苷酸序列。GLS2信號肽至少在破囊壺菌中至少對GLS2蛋白可具有信號靶向活性，其包括天然產(chǎn)生的GLS2信號肽的全長肽和其功能片段、融合肽和同源物。在一些實施方式中，所述GLS2信號肽具有氨基酸序列SEQ ID NO :63。在一些實施方式中，本發(fā)明的分離核酸分子包括編碼與SEQ ID NO :63至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的氨基酸序列的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列編碼至少在破囊壺菌中至少對GLS2蛋白而言用作信號肽的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述分離核酸分子包含編碼分離氨基酸序列的多核苷酸序列，所述氨基酸序列包含至少在破囊壺菌中至少對GLS2蛋白而言用作信號肽的SEQ ID NO :63的功能性片段。在一些實施方式中，分離的核酸分子包含SEQ ID NO :64。在一些實施方式中，分尚的核酸分子包含與以下任何序列雜交的多核苷酸序列(i) SEQ ID NO :64 ;(ii)與SEQ ID NO :64至少約60%、至少約65%、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的多核苷酸序列；和(iii)與編碼SEQ ID NO:63的核酸序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98 %或至少約99 %相同的多核苷酸序列。在一些實施方式中，分離的核酸分子包含與以下任何序列完全互補的多核苷酸序列(i)SEQ ID NO :64 ;(ii)與SEQ ID NO :64至少約60%、至少約65%、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少 約97%、至少約98%或至少約99%相同的多核苷酸序列；和(iii)與編碼SEQ ID NO :63的核酸序列至少約60*%、至少約65*%、至少約70*%、至少約75*%、至少約80*%、至少約85*%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的多核苷酸序列。本發(fā)明也涉及一種分離多肽，其包含GLS2信號肽的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述分離的多肽包含選自下組的氨基酸序列(i)SEQ ID NO :63和(ii)至少在破囊壺菌中至少對GLS2蛋白而言用作信號序列的與SEQ ID NO :63至少約60%、至少約65%、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的氨基酸序列。在一些實施方式中，分離多肽包含SEQ ID NO :63的前30、31、32、33、34、35、36、37或38個氨基酸殘基。在一些實施方式中，本發(fā)明的分離的GLS2信號肽是重組產(chǎn)生的。在一些實施方式中，所述分離的核酸分子包含編碼ct-1,3-1,6-甘露糖苷酶樣信號肽的多核苷酸序列。a-I，3-1, 6-甘露糖苷酶樣信號肽至少在破囊壺菌中至少對a-1，3-l，6-甘露糖苷酶樣蛋白可具有信號靶向活性，其包括天然產(chǎn)生的a-l，3_l，6-甘露糖苷酶樣信號肽的全長肽和其功能片段、融合肽和同源物。在一些實施方式中，所述a_l，3-l， 6-甘露糖苷酶樣信號肽具有氨基酸序列SEQ ID NO :65。在一些實施方式中,本發(fā)明的分離核酸分子包括編碼與SEQ ID NO :65至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的氨基酸序列的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列編碼至少在破囊壺菌中至少對a-1，3-1，6-甘露糖苷酶樣蛋白而言用作信號肽的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述分離核酸分子包含編碼分離氨基酸序列的多核苷酸序列，所述氨基酸序列包含至少在破囊壺菌中至少對a-1，3-1，6_甘露糖苷酶樣蛋白而言用作信號肽的SEQ ID NO:65的功能性片段。在一些實施方式中，分離的核酸分子包含SEQ ID NO :66。在一些實施方式中，分尚的核酸分子包含與以下任何序列雜交的多核苷酸序列(i)SEQ ID NO 66 ； (ii)與SEQ ID NO :66至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98 %或至少約99 %相同的多核苷酸序列；和(iii)與編碼SEQ ID NO 65的核酸序列至少約60%、至少約65%、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的多核苷酸序列。在一些實施方式中，分離的核酸分子包含與以下任何序列完全互補的多核苷酸序列(i) SEQ ID NO :66 ； (ii)與SEQID NO 66至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的多核苷酸序列；和(iii)與編碼SEQ ID NO 65的核酸序列至少約60%、至少約65%、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的多核苷酸序列。 本發(fā)明也涉及一種分離多肽，其包含a -I，3-1，6-甘露糖苷酶樣信號肽的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述分離的多肽包含選自下組的氨基酸序列(i) SEQ ID NO :65和(ii)至少在破囊壺菌中至少對a-1,3-1,6-甘露糖苷酶樣蛋白而言用作信號序列的與SEQ ID NO :65至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98 %或至少約99 %相同的氨基酸序列。在一些實施方式中，分離多肽包含SEQ ID NO :65的前24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34個氨基酸殘基。在一些實施方式中，本發(fā)明的分離的a-l，3_l，6_甘露糖苷酶樣信號肽是重組產(chǎn)生的。
在一些實施方式中，所述分離的核酸分子包含編碼ct-1,3-1,6-甘露糖苷酶樣#1信號肽的多核苷酸序列。a -1,3-1,6-甘露糖苷酶樣#1信號肽至少在破囊壺菌中至少對a-1，3-1，6-甘露糖苷酶樣#1蛋白可具有信號靶向活性，其包括天然產(chǎn)生的a-l，3_l，6-甘露糖苷酶樣#1信號肽的全長肽和其功能片段、融合肽和同源物。在一些實施方式中，所述a-I，3-1，6-甘露糖苷酶樣#1信號肽具有氨基酸序列SEQ ID NO :67。在一些實施方式中，本發(fā)明的分離核酸分子包括編碼與SEQ ID NO :67至少約60%、至少約65%、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的氨基酸序列的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列編碼至少在破囊壺菌中至少對0-1，3-1，6-甘露糖苷酶樣#1多肽而言用作信號肽的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述分離核酸分子包含編碼分離氨基酸序列的多核苷酸序列，所述氨基酸序列包含至少在破囊壺菌中至少對a -I，3-1，6-甘露糖苷酶樣#1蛋白而言用作信號肽的SEQ ID NO :67的功能性片段。在一些實施方式中，分離的核酸分子包含SEQ ID NO :68。在一些實施方式中，分離的核酸分子包含與以下任何序列雜交的多核苷酸序列(i)SEQ ID NO :68 ;(ii)與 SEQ ID NO :68 至少約 60%、至少約 65%、至少約 70%、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98%或至少約99%相同的多核苷酸序列；和(iii)與編碼SEQ ID NO 67的核酸序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的多核苷酸序列。在一些實施方式中，分離的核酸分子包含與以下任何序列完全互補的多核苷酸序列
(i)SEQ ID NO :68 ; (ii)與 SEQ ID NO :68 至少約 60%、至少約 65%、至少約 70%、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98%或至少約99%相同的多核苷酸序列；和(iii)與編碼SEQ ID NO 67的核酸序列至少約60 %、至少約65 %、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的多核苷酸序列。本發(fā)明也涉及一種分離多肽，其包含a -I，3-1，6-甘露糖苷酶樣#1信號肽的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述分離的多肽包含選自下組的氨基酸序列a) SEQ ID NO67和(ii)至少在破囊壺菌中至少對a-1，3-1，6-甘露糖苷酶樣#1蛋白而言用作信號序列的與SEQ ID NO :67至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98 %或至少約99 %相同的氨基酸序列。在一些實施方式中，分離多肽包含SEQ ID N0:67的前23、24、25、26、
27、28或29個氨基酸殘基。在一些實施方式中,本發(fā)明的分離的a-1,3-1,6-甘露糖苷酶樣#1信號肽是重組產(chǎn)生的。在一些實施方式中，所述分離的核酸分子包含編碼Ct-1，2-甘露糖苷酶樣信號肽的多核苷酸序列。a-1，2-甘露糖苷酶樣信號肽至少在破囊壺菌中至少對a-l，2_甘露糖苷酶樣蛋白可具有信號靶向活性，其包括天然產(chǎn)生的a-1，2-甘露糖苷酶樣信號肽的全長肽和其功能片段、融合肽和同源物。在一些實施方式中，所述a-1，2-甘露糖苷酶樣信號肽具有氨基酸序列SEQ ID N0:69。在一些實施方式中，本發(fā)明的分離核酸分子包括編碼與SEQ ID NO :69至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的氨基酸序列的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列編碼至少在破囊壺菌中至少對a-1，2-甘露糖苷酶樣蛋白而言用作信號肽的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述分離核酸分子包含編碼分離氨基酸序列的多核苷酸序列，所述氨基酸序列包含至少在破囊壺菌中至少對a-1，2-甘露糖苷酶樣蛋白而言用作信號肽的SEQ ID NO :69的功能性片段。在一些實施方式中，分尚的核酸分子包含SEQ ID NO :70。在一些實施方式中，分尚的核酸分子包含與以下任何序列雜交的多核苷酸序列(i) SEQ ID N070 ；(ii)與SEQ ID NO :70至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的多核苷酸序列；和(iii)與編碼SEQ ID NO :69的核酸序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98 %或至少約99 %相同的多核苷酸序列。在一些實施方式中，分離的核酸分子包含與以下任何序列完全互補的多核苷酸序列(i)SEQ ID NO :70 ； (ii)與SEQ ID NO 70至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的多核苷酸序列； 和(iii)與編碼SEQ ID NO :69的核酸序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98%或至少約99%相同的多核苷酸序列。本發(fā)明也涉及一種分離多肽，其包含a-1，2-甘露糖苷酶樣信號肽的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述分離的多肽包含選自下組的氨基酸序列a) SEQ ID NO :69和
(ii)至少在破囊壺菌中至少對a-1，2-甘露糖苷酶樣蛋白而言用作信號序列的與SEQ IDNO 69至少約60 %、至少約65 %、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的氨基酸序列。在一些實施方式中，分離多肽包含SEQ ID NO :69的前26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36個氨基酸殘基。在一些實施方式中,本發(fā)明的分離的a-1，2-甘露糖苷酶樣信號肽是重組產(chǎn)生的。在一些實施方式中，所述分離的核酸分子包含編碼P -木糖苷酶樣信號肽的多核苷酸序列?！?木糖苷酶樣信號肽至少在破囊壺菌中至少對￠-木糖苷酶樣蛋白而言可具有信號靶向活性，其包括天然產(chǎn)生的￠-木糖苷酶樣信號肽的全長肽和其功能片段、融合肽和同源物。在一些實施方式中，所述P -木糖苷酶樣信號肽具有氨基酸序列SEQ ID NO
71。在一些實施方式中，本發(fā)明的分離核酸分子包括編碼與SEQID NO :71至少約60%、至少約65 %、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的氨基酸序列的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列編碼至少在破囊壺菌中至少對￠-木糖苷酶樣蛋白而言用作信號肽的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述分離核酸分子包含編碼分離氨基酸序列的多核苷酸序列，所述氨基酸序列包含至少在破囊壺菌中至少對￠-木糖苷酶樣蛋白而言用作信號肽的SEQ ID NO :71的功能性片段。在一些實施方式中，分離的核酸分子包含SEQ ID NO:
72。在一些實施方式中，分離的核酸分子包含與以下任何序列雜交的多核苷酸序列(i)SEQID NO 72 ；(ii)與SEQ ID NO :72至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的多核苷酸序列；和(iii)與編碼SEQ ID NO :71的核酸序列至少約60 %、至少約65 %、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的多核苷酸序列。在一些實施方式中，分離的核酸分子包含與以下任何序列完全互補的多核苷酸序列(i)SEQ IDNO 72 ；(ii)與SEQ ID NO :72至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的多核苷酸序列；和(iii)與編碼SEQ ID NO :71的核酸序列至少約60%、至少約65 %、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 % 、至少約95 %、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的多核苷酸序列。本發(fā)明也涉及一種分離多肽，其包含￠-木糖苷酶樣信號肽的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述分離的多肽包含選自下組的氨基酸序列(i)SEQ ID N0:71和(ii)至少在破囊壺菌中至少對￠-木糖苷酶樣蛋白而言用作信號序列的與SEQ ID N0:71至少約60 %、至少約65 %、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的氨基酸序列。在一些實施方式中，分離多肽包含SEQ ID NO :71的前24、25、26、27、28、29或30個氨基酸殘基。在一些實施方式中，本發(fā)明的分離的P -木糖苷酶樣信號肽是重組產(chǎn)生的。在一些實施方式中，所述分離的核酸分子包含編碼胡蘿卜素合酶信號肽的多核苷酸序列。胡蘿卜素合酶信號肽至少在破囊壺菌中至少對胡蘿卜素合酶蛋白可具有信號靶向活性，其包括天然產(chǎn)生的胡蘿卜素合酶信號肽的全長肽和其功能片段、融合肽和同源物。在一些實施方式中，所述胡蘿卜素合酶信號肽具有氨基酸序列SEQ ID NO :73。在一些實施方式中，本發(fā)明的分離核酸分子包括編碼與SEQ ID NO :73至少約60%、至少約65%、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的氨基酸序列的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列編碼至少在破囊壺菌中至少對胡蘿卜素合酶蛋白而言用作信號肽的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述分離核酸分子包含編碼分離氨基酸序列的多核苷酸序列，所述氨基酸序列包含至少在破囊壺菌中至少對胡蘿卜素合酶蛋白而言用作信號肽的SEQ ID NO 73的功能性片段。在一些實施方式中，分離的核酸分子包含SEQ ID NO :74。在一些實施方式中，分離的核酸分子包含與以下任何序列雜交的多核苷酸序列(i) SEQ ID N074 ；(ii)與SEQID NO :74至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的多核苷酸序列；和(iii)與編碼SEQ ID NO 73的核酸序列至少約60%、至少約65%、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的多核苷酸序列。在一些實施方式中，分離的核酸分子包含與以下任何序列完全互補的多核苷酸序列(i)SEQ ID NO 74 ；(ii)與SEQ ID NO 74至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98 %或至少約99 %相同的多核苷酸序列；和(iii)與編碼SEQ ID NO 73的核酸序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98%或至少約99%相同的多核苷酸序列。本發(fā)明也涉及一種分離多肽，其包含胡蘿卜素合酶信號肽的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述分離的多肽包含選自下組的氨基酸序列(i)SEQ ID N0:73和(ii)至少在破囊壺菌中至少對胡蘿卜素合酶蛋白而言用作信號序列的與SEQ ID N0:73至少約60 %、至少約65 %、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的氨基酸序列。在一些實施方式中，分離多肽包含 SEQ ID NO :73 的前 15、16、17、18、19、20、21、29、30、31、32、33 或34個氨基酸殘基。在一些實施方式中，本發(fā)明的分離的胡蘿卜素合酶信號肽是重組產(chǎn)生的。在一些實施方式中，分離的核酸分子包含編碼Secl蛋白(“Seel”)信號肽 的多核苷酸序列。Secl信號肽至少在破囊壺菌中至少對Secl蛋白可具有分泌信號活性，其包括天然產(chǎn)生的Secl信號肽的全長肽和其功能片段、融合肽和同源物。在一些實施方式中，Secl信號肽由SEQ ID NO :37代表。在一些實施方式中，本發(fā)明的分離核酸分子包括編碼與SEQ ID NO :37至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98 %或至少約99 %相同的氨基酸序列的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列編碼至少在破囊壺菌中至少對Secl蛋白而言用作信號肽的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述分離核酸分子包含編碼分離氨基酸序列的多核苷酸序列，所述氨基酸序列包含至少在破囊壺菌中至少對Secl蛋白而言用作信號肽的SEQ ID NO :37的功能性片段。在一些實施方式中，分離的核酸分子包含SEQ ID NO 38o在一些實施方式中，分離的核酸分子包含與以下任何序列雜交的多核苷酸序列(i)SEQ ID NO :38 ;(ii)與 SEQ ID NO :38 至少約 60%、至少約 65%、至少約 70%、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98%或至少約99%相同的多核苷酸序列；和(iii)與編碼SEQ ID NO 37的核酸序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的多核苷酸序列。在一些實施方式中，分離的核酸分子包含與以下任何序列完全互補的多核苷酸序列(i)SEQ ID NO :38 ;(ii)與 SEQ ID NO :38 至少約 60%、至少約 65%、至少約 70%、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98%或至少約99%相同的多核苷酸序列；和(iii)與編碼SEQ ID NO 37的核酸序列至少約60 %、至少約65 %、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的多核苷酸序列。本發(fā)明也涉及一種分離多肽，其包含Secl信號肽的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述分離的多肽包含選自下組的氨基酸序列(i)SEQ ID N0:37和(ii)至少在破囊壺菌中至少對Secl轉(zhuǎn)運蛋白而言用作信號序列的與SEQ ID NO :37至少約60%、至少約65 %、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述分離多肽包含某氨基酸序列，該氨基酸序列包含SEQ ID NO :37的前18或19個氨基酸殘基(即SEQ ID NO :37，該序列的C末端的最后I或2個氨基酸被刪除)。在一些實施方式中，本發(fā)明的分離的Secl信號肽是重組產(chǎn)生的。
在一些實施方式中，本發(fā)明的分離核酸分子包含OrfC啟動子、EFl短啟動子、EFl長啟動子、60S短啟動子、60S長啟動子、Secl啟動子、PKS OrfC終止子區(qū)、Na/Pi_IIb2轉(zhuǎn)運蛋白信號肽的編碼序列或本發(fā)明Secl轉(zhuǎn)運蛋白信號肽的編碼序列，其操作性連接于編碼某蛋白質(zhì)的核酸序列的5'末端。本發(fā)明也包括重組載體(包括但不限于表達載體)、表達盒和宿主細胞，其包含OrfC啟動子、EFl短啟動子、EFl長啟動子、60S短啟動子、60S長啟動子、Secl啟動子、PKS OrfC終止子區(qū)、Na/Pi_IIb2轉(zhuǎn)運蛋白信號肽的編碼序列或本發(fā)明Secl轉(zhuǎn)運蛋白信號肽的編碼序列，其操作性連接于編碼某蛋白質(zhì)的核酸序列的5'末端本發(fā)明也包括包含任何上述本發(fā)明的分尚核酸分子(如包含OrfC啟動子、EFl短啟動子、EFl長啟動子、60S短啟動子、60S長啟動子、Secl啟動子、PKS OrfC終止子區(qū)、Na/Pi-IIb2轉(zhuǎn)運蛋白信號肽編碼序列或Secl轉(zhuǎn)運蛋白信號肽編碼序列)的重組載體(包括但不限于表達載體)、表達盒、宿主細胞和微生物，以及將所述載體和/或表達盒引入所述宿主細胞和重組微生物的方法。可選擇或構(gòu)建合適的載體和表達盒，使其包含合適的調(diào)節(jié)序列、終止子片段、聚腺苷酸化序列、增強子序列、標(biāo)記基因和其它合適序列。本文列出了有關(guān)載體、表達盒和宿主細胞的其它細節(jié)。除非另有說明，本文所用的相同性百分數(shù))(和相同性％ )指利用以下方法進行的同源性評估(1)以標(biāo)準(zhǔn)默認參數(shù)進行BLAST 2.0基本BLAST同源性檢索，利用blastp進行氨基酸檢索，利用blastn進行核酸檢索，其中默認過濾查詢序列的低復(fù)雜性區(qū)域(參見例如，Altschul, S.等，Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402 (1997)，通過引用全文納入本文);(2)采用下述參數(shù)進行BLAST 2比對；(3)和/或采用標(biāo)準(zhǔn)默認參數(shù)進行PSI-BLAST (位置特異性迭代BLAST)。應(yīng)注意，由于BLAST 2. 0基本BLAST和BLAST 2的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)有些差異，采用BLAST 2程序可認定兩個具體序列顯著同源，而用BLAST 2. 0基本BLAST進行的檢索可能不認定第二個序列是第一個查詢序列的最高匹配序列之一。此外，PSI-BLAST提供自動化、容易使用的“概況”檢索，這是一種尋找序列同源物的靈敏方式。該程序首先進行缺口 BLAST數(shù)據(jù)庫檢索。PSI-BLAST程序利用返回的任何顯著比對的信息構(gòu)建位置特異性評分矩陣，其在下一輪數(shù)據(jù)庫檢索中代替查詢序列。因此，應(yīng)理解，可采用這些程序中任何一種確定相同性百分數(shù)?？扇鏣atusova 和 Madden, FEMS Microbiol. Lett. 174 :247-250 (1999)(通過引用全文納入本文)所述,采用BLAST 2序列比對兩個具體序列。采用BLAST 2.0算法中的blastp或blastn進行BLAST 2序列比對，以便在允許在所得比對中引入缺口(缺失和插入)的情況下對兩個序列進行進行缺口 BLAST檢索(BLAST 2. 0)。在一些實施方式中，采用如下所示的標(biāo)準(zhǔn)默認參數(shù)進行BLAST2序列比對。在blastn 中，采用 0 BL0SUM62 矩陣匹配獎勵=I錯配罰分=_2開放缺口(5)和延伸缺口⑵罰分缺口 x_降低(x_dropoff) (50)預(yù)計值(10)字長(11)過濾器(開)。在blastp 中，采用 0 BL0SUM62 矩陣開放缺口(11)和延伸缺口(I)罰分缺口 x_降低(50)預(yù)計值(10)字長(3)過濾器(開)。
本文所用的雜交條件指可利用某核酸分子鑒定相似核酸分子的標(biāo)準(zhǔn)雜交條件。參見例如，Sambrook J.和Russell D. (2001)《分子克隆實驗室手冊》(Molecular cloning A laboratory manual),第3版,紐約冷泉港的冷泉港實驗室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, New York),通過引用全文納入本文。此外，計算允許以不同的核苷酸錯配程度實現(xiàn)雜交的合適雜交和洗滌條件的公式參見例如，Meinkoth等，Anal. Biochem. 138，267-284 (1984)，通過引用全文納入本文。更具體說，本文所用的中等嚴格的雜交和洗滌條件指能夠分離與在雜交反應(yīng)中用于探測的核酸分子的核酸序列至少約70%相同的核酸分子的條件(即，允許約30%或更少的核苷酸錯配的條件)。本文所用的高度嚴格的雜交和洗滌條件指能夠分離與在雜交反應(yīng)中用于探測的核酸分子的核酸序列至少約80%相同的核酸分子的條件(S卩，允許約20%或更少的核苷酸錯配的條件)。極高嚴格的雜交和洗滌條件指能夠分離與在雜交反應(yīng)中用于探測的核酸分子的核酸序列至少約90%相同的核酸分子的條件(S卩，允許約10%或更少的核苷酸錯配的條件)。如上所述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用，例如，Meinkoth等所述的公式計算合適的雜交和洗滌條件，以實現(xiàn)這些具體核苷酸錯配水平。這類條件將根據(jù)是否形成DNAiRNA或DNA = DNA雜交體而改變。DNA = DNA雜交體的解鏈溫度計算值比DNA = RNA雜交體 的計算值低10°C。在具體實施方式
中，DNA = DNA雜交體的嚴格雜交條件包括在6X SSC(O. 9MNa+)離子強度下，在約20°C至約35°C的溫度下(低嚴格性)、約28°C和約40°C的溫度下(提高嚴格性)和約35°C至約45°C的溫度下(更高嚴格性)雜交，并采用合適的洗滌條件。在具體實施方式
中，DNA = RNA雜交體的嚴格雜交條件包括在6X SSC(O. 9M Na+)離子強度下，在約30°C至約45°C的溫度下、約38°C和約50°C的溫度下和約45°C至約55°C的溫度下(更高嚴格性)雜交，并采用類似嚴格性的洗滌條件。這些數(shù)值基于大于約100個核苷酸的分子、0%甲酰胺和G+C含量約40%時的解鏈溫度計算值?；蛘?，可以如SambiOOk等所述根據(jù)經(jīng)驗計算Tm。通常，洗滌條件應(yīng)該盡可能嚴格，并且應(yīng)適合所選的雜交條件。例如，雜交條件可包括比特定雜交體的Tm計算值低約20-25°C的鹽和溫度條件的組合，洗滌條件通常包括比特定雜交體的Tm計算值低約12-20°C的鹽和溫度條件的組合。適用于DNA = DNA雜交體的雜交條件的一個例子包括在6X SSC(50%甲酰胺)中約42°C下雜交2-24小時，隨后是洗滌步驟，包括在室溫下用約2X SSC洗滌一次或多次，隨后在較高溫度和較低的離子強度下進行額外洗滌(如用約O. 1X-0. 5XSSC在約37°C至少洗滌一次，然后用約O. 1X-0. 5X SSC在約68 V至少洗滌一次)。盡管已經(jīng)總的描述了本發(fā)明，但通過參考本文提供的實施例可進一步理解本發(fā)明。這些實施例僅用于說明目的，不構(gòu)成限制。實施例I構(gòu)建裂殖壺菌屬蛋白質(zhì)表達載體pSchizEa.構(gòu)建 p07074#6 :用XbaI和綠豆核酸酶消化pSP73載體(普洛麥格公司(Promega),登錄號X65333)，然后純化和連接產(chǎn)生載體p070604#3。接著，用SphI、HpaI和綠豆核酸酶進一步消化p070604#3，然后純化并再連接產(chǎn)生載體p070704#6。b.構(gòu)建 pSchizl:用BamHI消化pTUBzeoll-2載體(如W002/083869所述)以釋放含有裂殖壺菌屬a-微管蛋白啟動子、ble基因和SV40終止子區(qū)的1122堿基對(bp)片段。凝膠純化該片段，并連接到已經(jīng)用BamHI事先消化的載體pYES2/CT(英杰公司(Invitrogen))中。然后,用SmaKSphI和綠豆核酸酶消化所得構(gòu)建物，以釋放含有a -微管蛋白啟動子的540bp片段。將該片段連接到事先用BamHI、SmaI和綠豆連接酶消化的pUC19 (Genbank登錄號L09137)中，產(chǎn)生pSchizl。c.構(gòu)建 pSchiz2 :在單獨反應(yīng)中，利用摻入用于連接的NcoI和PciI限制性位點(以斜體顯示)的下列引物，通過PCR產(chǎn)生擴增子，該擴增子編碼來自pTUBzeoll-2的SV40終止子引物S4termF :5' -GATC CCATGG CACGTGCTACG(SEQ ID NO 16)引物SAtermRj' -GGCA JC4rG7 ATGATAAGATAC(SEQ ID NO : 17)用NcoI和PciI消化所得的擴增子，以暴露粘性末端。然后，將此265bp的片段連 接到事先用NcoI消化的pSchizl中。所得質(zhì)粒(稱為pSchiz2)含有a-微管蛋白啟動子后接SV40終止子。d.構(gòu)建 pSchiz3 :利用經(jīng)設(shè)計在擴增子兩端加入SmaI位點(斜體顯示)的下列引物，通過PCR從PYES2/CT擴增多克隆位點(MCS)引物C2mcsSmaF :5' -GATC CCCGGG TTAAGCTTGGT (SEQ ID NO 18)引物C2mcsSmaR :5' -ACTG GGGCCC GTTTAAACTC(SEQ ID NO 19)然后，用SmaI消化所得MCS擴增子并連接到事先用NcoI和綠豆核酸酶消化的pSchiz2中。所得載體(稱為pSchiz3)含有a微管蛋白啟動子、SV40終止子和pYES2/CTMCS。e.構(gòu)建 pSchizO. 5#4采用以下引物和模板pSchiz3進行PCR，以產(chǎn)生編碼MCS盒的擴增子，所述MCS盒由a-微管蛋白啟動子、PYES2/CT MCS和SV40終止子區(qū)構(gòu)成。引物5' tubMCS_BglII :5' -GACT AGATCTCAATTTTAGGCCCCCCACTGACCG (SEQ IDNO 20)引物3' SV40MCS_Sal :5' -GACT GTCGAC CATGTATGATAAGATACATTGATG (SEQ IDNO 21)設(shè)計這些引物，以便在MCS盒擴增子末端加入BglII和SalI限制性位點(以斜體顯示)。用BglII和SalI消化所得PCR片段并連接到事先用BglII和SalI消化的p070704#6中，產(chǎn)生 pSchizO. 5#4。f.構(gòu)建 pSchizE用美國專利7，001，772所述的載體pM0N50203作模板，通過PCR產(chǎn)生編碼ALS基因的4776bp的擴增子(包括其啟動子和終止子區(qū))。將包含NdeI和BglII限制性位點(以斜體顯示)的下列引物用于此PCR反應(yīng)引物5' ALSproNde3 :5' -GACT'C47M JG GCCCAGGCCTACTTTCAC(SEQ ID NO 22)引物3' ALStermBglII :5' GACT AGATCT GGGTCAAGGCAGAAGAATTCCGCC(SEQ IDNO 23)接著，用BglII和NdeI消化所得的ALS擴增子。同樣，用BglII和NdeI消化pSchizO. 5#4,凝膠純化較大的3171bp條帶并連接到純化的ALS PCR擴增子中。通過測序驗證所得載體(稱為pSchizE)，其包含ALS基因(包括啟動子和終止子區(qū))，后接含有裂殖壺菌屬α -微管蛋白啟動子、PYES2/CT MCS和SV40終止子區(qū)的表達盒(參見圖5)。實施例2構(gòu)建裂殖壺菌屬蛋白質(zhì)表達載體pSchiz-sG利用pSchiz-sG表達和分泌eGFP(見圖6)。此質(zhì)粒也稱為pCOOOOl，其于2008年11月18日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(美國弗吉尼亞州瑪納薩斯大學(xué)大道10801號專利保藏中心(Patent Depository, 10801 University Boulevard, Manassas, VA20110-2209))，ATCC登錄號為PTA-9617。此載體含有(i)裂殖壺菌屬α-微管蛋白啟動子序列，后接(ii)編碼連接有成熟轉(zhuǎn)運蛋白N-末端部分的片段的裂殖壺菌屬Na/Pi轉(zhuǎn)運蛋白信號序列的序列，(SEQ ID NO : 15)，其與eGFP-編碼序列融合，后接(iii)MCS的其余部分和(iv)SV40終止子區(qū)。此載體還含有裂殖壺菌屬ALS基因作為選擇標(biāo)記物。如下所述構(gòu)建該載體。選擇編碼信號肽的序列(SEQ ID NO 2)來自由裂殖壺菌屬EST文庫分離的Na/Pi 轉(zhuǎn)運蛋白。通過 PCR，利用含 eGFP 的質(zhì)粒 pPha-Tl-eGFP(Apt 等，J. Cell Sci. 115 4061-4069(2002))和設(shè)計加入信號序列的3個引物融合編碼信號肽和eGFP的核苷酸序列。第一個PCR反應(yīng)采用含eGfp的質(zhì)粒(作模板)、eGfp3'末端的小引物(引物sec.Gfp3' Spe，含有SpeI位點，下面以斜體顯示)以及側(cè)接eGfp5'末端和信號序列3'末端的IOObp引物(引物sec. Gfp5/ lb, sec)。引物序列如下引物sec.Gfp5' lb:5' -TACTGGTTCCTTGTCGGCCTCGCCCTTCTCGGCGATGGCTTCAAGGTCATCGCCGGTGACTCCGCCGGTACGCTCTTCATGGTGAGCAAGGGCGAGG(SEQ IDNO 24)引物sec.GfpS' Spe :5 ' -CGTC ACTAGT TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC (SEQ IDNO 25)在第二個PCR反應(yīng)中，將第一個PCR的擴增子產(chǎn)物用作模板。采用相同的3'引物，以及摻入信號序列其余部分的第二個IOObp 5'引物(sec.Gfp5' Bam)。第二個5'弓丨物序列含有BamHI位點(下面以斜體顯示)，如下所示引物sec.GfpS' Bam 5/ -TAAT GGATCC ATGGCCAACATCATGGCCAACGTCACGCCCCAGGGCGTCGCCAAGGGCTTTGGCCTCTTTGTCGGCGTGCTCTTCTTTCTCTACTGGTTCCTTGT(SEQ ID NO 26)第二個PCR反應(yīng)得到的PCR產(chǎn)物含有用于克隆的BamHI和SpeI位點。用BamHI和SpeI消化第二個PCR反應(yīng)的擴增子和pSchizE，互相連接產(chǎn)生載體pSchiz—sG。實施例3構(gòu)建裂殖壺菌屬蛋白質(zhì)表達載體pSchiz-sGr
pSchiz-sGr載體包含α -微管蛋白啟動子、具有編碼ER保留信號的序列的eGFP核苷酸序列、SV40終止子區(qū)和突變的ALS選擇標(biāo)記物。反相翻譯共有的ER保留信號氨基酸序列HDEL，并利用實施例2的pSchiz-sG作模板，通過PCR將此保留信號的編碼序列(SEQ ID NO 14)融合于eGFP。設(shè)計寡核苷酸引物，以包含HDEL編碼序列(下述ss. eGfpHELD3/ RV引物序列中下劃線表示的反向互補物)，在同一讀框內(nèi)還有終止密碼子(方框表示)，其中BamHI位點(以斜體顯示)在一個引物中，EcoRV位點(以斜體顯示)在另一個引物中。引物ss. eGfpHELD3' RV :5' -CCT GATATC TTACAACTCGTCGTGGTTGTACAGCTCGTCC(SEQ ID NO :27)引物sec.GfpS' Bam2:5' -TAAT GGATCC ATGGCCAACATCATGGCCAACGTCACGCCCCAGGGCGTCGCCAAGGGCTTTGGCCTCTTTGTCGGC GTGCTCTTCTTTCTCTACTGGTTCCTTGT(SEQ ID NO :28)用BamHI和EcoRV消化所得PCR產(chǎn)物，與BamHI和EcoRV消化pSchizE獲得的較大片段(如實施例I所述)連接。所得載體稱為pSchiz-sGr (見圖7)。 實施例4構(gòu)建裂殖壺菌屬蛋白質(zhì)表達載體pSchiz-cG作為比較對照，構(gòu)建pSchiz-cG載體以表達eGFP，使得該熒光蛋白在細胞質(zhì)中累積。pSchiz-cG質(zhì)粒包含裂殖壺菌屬OrfC啟動子、編碼eGFP的多核苷酸序列、SV40終止子區(qū)和突變的裂殖壺菌屬ALS選擇標(biāo)記物。首先，用以下引物從裂殖壺菌ATCC 20888的基因組DNA中PCR擴增裂殖壺菌屬ORFC上游的2000bp序列引物prREZ15:5' -C GGr^CC CGCGAATCAAGAAGGTAGGC(SEQ ID NO 29)引物prREZ16:5' -C GG^7CC CGTCTCTGCCGCTTTTTCTT (SEQ ID NO 30)所述prREZ15和prREZ16引物分別包含KpnI和BamHI序列(斜體)。用BamHI和KpnI消化所得擴增子，并進行凝膠純化。接下來，用以下引物從裂殖壺菌ATCC 20888的基因組DNA中PCR擴增裂殖壺菌屬ORFC下游的1985bp序列引物prREZ17:5' -C GGATCC GAAAGTGAACCTTGTCCTAACCC(SEQ ID NO :31)引物prREZ18:5' -CCAGATCCGCACCATCGGCCG(SEQ ID NO 32)所述prREZ17和prREZ18引物分別包含BamHI序列和XbaI序列(斜體)。用BamHI和XbaI消化所得擴增子，并進行凝膠純化。接著，用KpnI和XbaI消化載體pBluescript SK(+)(司查塔基公司(Stratagene)，登錄號X52328)，并進行凝膠純化。同時連接此載體和上述產(chǎn)生的兩個擴增子，以產(chǎn)生載體PREZ22。然后,載體pSchizE (實施例I)用BamHI消化,用綠豆核酸酶處理,節(jié)行柱純化,用XbaI消化，然后進行凝膠純化。接著，用以下引物進行PCR，以產(chǎn)生含有eGFP編碼區(qū)的擴增子(采用pPha-Tl-eGFP作模板):引物5' eGFP_kpn:5' -GACT GGTACC ATGGTGAAGCAAGGGCGAGGAG (SEQ ID NO:
33)引物3' eGFP_xba:5' -GACT TCTAGA TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC (SEQ ID NO
34)接著用XbaI消化此擴增子,與上述pSchizE的片段連接產(chǎn)生載體pSchizE_eGFP。
利用pREZ22作模板，通過PCR產(chǎn)生編碼ORFC的啟動子的擴增子。該PCR中使用以下引物，各自含有KpnI限制性序列(以斜體顯示)引物5 ' 0RFCproKpn-2 5 ' -GATC GGTACC GGTGTTCTTTGTTTTGATTTCT (SEQ IDNO 35)引物3 ' 0RFCproKpn-2 5 ' -GATC GGTACC GTCTCTGCCGCTTTTTCTTTA (SEQ IDNO 36)然后用KpnI消化此擴增子。接著用KpnI消化pSchizE-eGFP載體，產(chǎn)生兩個片段。對較大片段(7554bp)進行凝膠純化，并與上述KpnI消化的擴增子連接產(chǎn)生pSchiz-cG載體，其包含裂殖壺菌屬ORFC啟動子序列，后接eGFP序列和SV40終止子區(qū)(見圖8)。實施例5轉(zhuǎn)化裂殖壺菌屬和后續(xù)蛋白質(zhì)表達 除非另有說明，利用適合給定培養(yǎng)規(guī)模的恰根(Qiagen)試劑盒(加州瓦倫西亞(Valencia，CA))，在用于質(zhì)粒純化的大腸桿菌(E. coli) UltraMax DH5-a FT化學(xué)感受態(tài)細胞(加利福尼亞州卡爾斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA))中擴增所有載體和構(gòu)建物。裂殖壺菌ATCC 20888在M2B培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基由10g/L葡萄糖、O. 8g/L(NH4)2S04、5g/L Na2SO4,2g/L MgSO4 ·7Η20、0· 5g/L ΚΗ2Ρ04、0· 5g/L KC1、0. lg/L CaCl2 ·2Η20、0. IM MES (pH 6·0)、0· 1%PB26 金屬和 0. 1%PB26 維生素(v/v)構(gòu)成。PB26 維生素由 50mg/mL維生素B12、100yg/mL硫胺和100yg/mL泛酸鈣構(gòu)成。將PB26金屬調(diào)節(jié)至pH 4.5，其由 3g/L FeSO4 · 7H20、lg/L MnCl2 · 4H20、800mg/mL ZnSO4 · 7H20、20mg/mL CoCl2 · 6H20、lOmg/mL Na2MoO4 · 2H20、600mg/mL CuSO4 · 5H20 和 800mg/mL NiSO4 · 6H20 構(gòu)成。對 PB26 母液進行單獨過濾除菌，高壓滅菌后加入肉湯中。將葡萄糖、KH2PO4和CaCl2 · 2H20與其余肉湯成分分開單獨滅菌，然后混合，以防止鹽沉淀和糖焦化。所有培養(yǎng)基成分均購自密蘇里州圣路易斯的西格瑪化學(xué)品公司(Sigma Chemical, St. Louis, MO)。將裂殖壺菌培養(yǎng)物培養(yǎng)至指數(shù)期，通過生物射彈(Biolistic) 顆粒轟擊器(加州赫克里斯的伯樂公司(BioRad，Hercules, CA))，利用載體 pSchiz-El (實施例 I)、pSchiz-sG (實施例 2)、pSchiz-sGr (實施例3)或pSchiz-cG (實施例4)轉(zhuǎn)化。生物射彈tmR化方法與先前所述基本相同(參見Apt 等，J. Cell. Sci. 115(Pt 21) 4061-9 (1996)和美國專利 7，001，772)。在固體 M2B 培養(yǎng)基上27°C培育2-6天后選擇原代轉(zhuǎn)化體，該培養(yǎng)基含有20g/L瓊脂(賓夕法尼亞州西切斯特的VWR公司(VWR，West Chester, PA)) UO μ g/mL甲嘧磺隆(SMM)(賓夕法尼亞州西切斯特的化學(xué)服務(wù)公司(Chem Service, Westchester, PA))。將所有原代轉(zhuǎn)化體手工轉(zhuǎn)移到含有SMM的新鮮M2B平板上。通過熒光和普通光顯微鏡分析原代轉(zhuǎn)化體集落。還利用原代轉(zhuǎn)化體集落接種50mL M2B-SMM液體培養(yǎng)基。27 °C培育2_5天后，5500x g離心15分鐘收獲培養(yǎng)物。用CP (Centriprep) 重力濃縮器(馬薩諸塞州比爾里卡的密理博公司(MiIIipore,Billerica7MA))將無細胞上清液濃縮100倍，用水洗滌細胞沉淀，用液氮凍存，然后用兩倍于細胞沉淀重量的裂解緩沖液(由50mM磷酸鈉(pH7.4)、lmM EDTA、5%甘油和ImM新鮮的苯基甲基磺酰氟構(gòu)成)和兩倍于細胞沉淀重量的0. 5_玻璃珠(密蘇里州圣路易斯的西格瑪公司)重懸。接著在多管渦旋器(賓夕凡尼亞州西切斯特的VWR公司)中以最大速度4°C渦旋3小時(h)，以裂解細胞沉淀混合物。然后將細胞裂解物以5500x g 4°C離心10分鐘。保留上清液，并以5500x g 4°C再離心10分鐘。在本文中，將所得上清液定義為“無細胞提取物”。用布拉德福德(Bradford)試劑盒(密蘇里州圣路易斯的西格瑪公司)定量測定無細胞上清液和無細胞提取物的蛋白質(zhì)，在上樣于4-12%聚丙烯酰胺雙Tris凝膠(加州赫克里斯的伯樂公司)之前，按照生產(chǎn)商說明書(加州赫克里斯的伯樂公司)將其與XT樣品緩沖液的混合物煮沸。SDS-PAGE凝膠用考馬斯燃料染色，或通過蛋白質(zhì)印跡轉(zhuǎn)移到PVDF上。印跡后，用Tris-緩沖鹽水(TBS)(密蘇里州圣路易斯的西格瑪公司)沖洗PVDF膜，并用5%脫脂牛奶(NFDM)的TBS溶液室溫處理2小時。根據(jù)生 產(chǎn)商說明書用5% NFDM-TBS稀釋對感興趣蛋白質(zhì)特異的第一抗體。如果需要，除去該溶液并更換新鮮的加入第二抗體的5% NFDM-TBS,所述第二抗體偶聯(lián)于堿性磷酸酶并對第一抗體有特異性。如果不用第二抗體，第一抗體將偶聯(lián)于堿性磷酸酶。然后，用TBS沖洗抗體處理的PVDF，并用5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸/硝基氮藍四唑溶液(BCIP/NBT)(馬里蘭州蓋瑟斯堡的KPL公司(KPL，Gaithersburg，MD))處理。如圖9所示，用pSchizGr轉(zhuǎn)化的裂殖壺菌中eGFP定位于ER(也參見圖10)，而用PSchizcG轉(zhuǎn)化的裂殖壺菌的整個胞質(zhì)中都顯示有eGFP。用pSchizE (空載體對照)轉(zhuǎn)化的裂殖壺菌不表達eGFP。如圖11所示，在pSchiz-sG轉(zhuǎn)化的裂殖壺菌的無細胞上清液樣品(即細胞外)和無細胞提取物中檢測到eGFP。pSchiz-sGr轉(zhuǎn)化的裂殖壺菌的無細胞提取物中含有eGFP，但無細胞上清液中含量較少。最后，在PSchizcG轉(zhuǎn)化的裂殖壺菌中，幾乎只有無細胞提取物中含有eGFP。實施例6鑒定Secl信號肽以前用工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)為BLAST檢索產(chǎn)生、組裝和格式化了裂殖壺菌屬的基因組序列。濃縮在N-充滿條件下培養(yǎng)的裂殖壺菌培養(yǎng)物上清液，并用SDS-PAGE跑膠。從凝膠上剪下主要的分泌蛋白條帶，用于氨基酸測序。通過BLAST比較所得氨基酸序列與裂殖壺菌屬基因組(算法-tBLASTn，低復(fù)雜性過濾-關(guān)閉，預(yù)計值-1000，矩陣-PAM30，無缺口比對-開放)，鑒定相應(yīng)的0RF。利用信號P算法(SignalP algorithm)分析該ORF的5'部分。參見例如，Bendsten 等,J. Mol. Biol. 340 :783-795(2004) ;Nielsen 和 Krogh，Proc.Int. Conf. Intell. Syst. Mol. Biol. 6 122-130 (1998) ；Nielsen 等，Protein Engineering12 3-9 (1999) ;Emanuelsson 等，Nature Protocols 2:953-971 (2007)。根據(jù)該項分析，將Secl蛋白的5'區(qū)鑒定為分泌信號。參見圖12(包含SEQ ID NO 37)和圖13(SEQ ID NO:38)。實施例7構(gòu)建裂殖壺菌載體pSchiz-CptpSchiz-Cpt載體含有OrfC啟動子和終止子，以及ALS選擇標(biāo)記物。簡要說,首先用KpnI/Xbal消化pSchizE質(zhì)粒，然后對所得的6. 89kb片段進行凝膠純化，以構(gòu)建此載體。該消化也導(dǎo)致除去pSchizE質(zhì)粒上的微管蛋白啟動子和大部分多聚接頭；而ALS編碼序列保持不變。向所得的6. 8kb SchizE主鏈中連接4kb KpnI/Xbal片段，該片段含有裂殖壺菌屬OrfC上游的2kb序列和裂殖壺菌屬OrfC下游的2kb序列，用BamHI位點分割所述上游和下游區(qū)段。從質(zhì)粒PREZ22中切下該4kb KpnI/Xbal片段(參見實施例4)。所述6. 8kbpSchizE 主鏈和 4kb KpnI/Xbal 片段連接產(chǎn)生 pSchiz_Cpt。實施例8構(gòu)建裂殖壺菌屬蛋白質(zhì)表達載體pSchizCpt-sleGFP所述pSchizCpt-sleGFP質(zhì)粒包含裂殖壺菌屬OrfC啟動子、eGFP編碼序列之前的Secl信號序列和OrfC終止子，以及突變的裂殖壺菌屬ALS選擇標(biāo)記物序列。參見圖14。此質(zhì)粒也稱為PCL0001，其于2008年11月18日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(美國弗吉尼亞州瑪納薩斯大學(xué)大道10801號專利保藏中心(Patent Depository, 10801 UniversityBoulevard, Manassas, VA 20110-2209) )，ATCC 登錄號為 PTA-9615。實施例9
在發(fā)酵罐中裂殖壺菌表達和分泌eGFP如實施例5所述，用pSchizCpt-sleGFP (見實施例8)轉(zhuǎn)化裂殖壺菌屬細胞。在M2B瓊脂平板上分離SMM抗性細胞系，將其轉(zhuǎn)移到搖瓶中的M2B液體培養(yǎng)物(含有10 μ g/mlSMM)中，27. 5°C振蕩孵育(150rpm)。培育72-168小時后，離心收獲培養(yǎng)物(5000x g，10分鐘)，用 C&M(Centriprep and Microcon)濃縮器(MWC0 10000)濃縮無細胞上清液(約 250倍)。樣品(1-7 μ I)在SDS-PAGE上跑膠，將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用兔抗-eGFPIgG(百信公司(Biovision))探測封閉和洗滌的膜，并且使用堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗-兔IgG(fc)(普洛麥格公司(PiOmega))和BCIP/NBT試劑處理觀察發(fā)生反應(yīng)的蛋白質(zhì)條帶。選擇eGFP表達量最高的細胞系。在2. OL (工作容積)發(fā)酵罐中培育一種高產(chǎn)細胞系。有擋板的接種瓶中含有150mlHDl培養(yǎng)基，在29. 5°C下200rpm振蕩培育24_48h。用接種體培養(yǎng)物接種含有以下物質(zhì)的發(fā)酵罐:50g/L葡萄糖、13. 62g/L Na2S04、0. 72g/L K2S04、0. 56g/L KCl,2. 27g/L MgSO4. 7H20、
1.8g/L KH2PO4'17. 5g/L (NH4) 2S04、0. 19g/L CaCl2. 2H20、51. 5mg FeSO4. 7H20、3. lg/LMnCl2. 4H20、6. 2g/L ZnSO4. 7H20、0. 04mg CoCl2. 6H20、0. 04mg Na2MoO4'2. 07g/L CuSO4. 5H20、
2.07g/L NiSO4. 6H20、9. 75mg硫胺、0. 16mg維生素B12和3. 33mg泛酸鈣。在培養(yǎng)過程中，溫度是29. 5°C，d02%控制在20%，葡萄糖濃度保持在15-20g/L (初始水平落入該范圍后)，pH位置在6. 5。在無菌條件下以一定間隔取出樣品進行分析。通過SDS-PAGE分離未濃縮的無細胞上清液樣品(含有0. 5_5. 0μ g總蛋白)，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。如上所述，檢測經(jīng)封閉和洗滌的膜上分泌的eGFP。參見圖15。實施例10構(gòu)建裂殖壺菌屬蛋白質(zhì)表達載體pSchizCpt-sl κ bh所述pSchizCpt-sl κ bh質(zhì)粒包含裂殖壺菌屬OrfC啟動子、編碼IgG κ亞基的多核苷酸序列之前的Secl信號序列和OrfC終止子區(qū)，以及突變的裂殖壺菌屬ALS選擇標(biāo)記物序列(見圖16)。表達載體的制備如下將藍色合龍生物技術(shù)公司(Blue Heron Biotechnologies)利用圖42的密碼子使用表由相應(yīng)氨基酸序列產(chǎn)生的、再合成的(密碼子優(yōu)化的)IgG κ鏈編碼基因(具有5' Secl分泌信號序列)克隆到質(zhì)粒pSchiz-Cpt中orfC啟動子和orfC終止子之間的位置。簡要說，根據(jù)酶生產(chǎn)商說明(新英格蘭生物實驗室公司(New England Biolabs))用BamHI和堿性磷酸酶消化載體pSchiz-Cpt。將其連接到用以下引物和模板產(chǎn)生的BglII(NEB)消化的擴增子中引物5' ss-X Bgl 長GACTagatctATGAAGTTCGCGACCTCG(SEQ ID NO :39)引物3' ritx_kap_bh_Bgl gactagatctTCAGCACTCACCGCGGTTAAAGG (SEQ ID NO:40)所述模板由藍色合龍生物技術(shù)公司提供，攜帶合成的優(yōu)化的DNA分子，其含有Secl信號肽的多核苷酸序列，后接κ多核苷酸序列(SEQ ID NO :41)。篩選所得細菌轉(zhuǎn)化體集落的載體插入物，適當(dāng)比對以表達。選擇一個克隆(稱為pSchizCPT-sl κ bh)進行進一步分析，驗證序列，并用于轉(zhuǎn)化裂殖壺菌。實施例11 由裂殖壺菌屬表達和篩選抗體亞基K產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細胞系在含50ml M2B培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，27°C培養(yǎng)裂殖壺菌ATCC 2088824小時。在600nm測定吸光度，將相當(dāng)于吸光度為I的Iml培養(yǎng)物的體積在8，OOOx g離心5分鐘。將細胞沉淀重懸于100 μ I Μ2Β,并散布在Μ2Β瓊脂平板上2cm直徑的圓圈內(nèi)。用pSchizCptSl κ (用XbaI線性化)包被的MlO珠，在IlOOPsi壓力下轟擊含有散布的裂殖壺菌屬細胞的平板面積。轟擊后，在27°C培育該M2B平板16小時，挑取在裂殖壺菌散布平板中心生長的集落，并散布到含有10μ g/ml SMM的平板上。24至72小時后，挑取20個集落，接種到25ml培養(yǎng)管中的含10mg/ml SMM的5ml M2B中。27°C、135rpm培育該培養(yǎng)管72小時。檢測K表達從上述培養(yǎng)物中選擇10個最混濁的搖瓶培養(yǎng)物進行表達分析。將O. 5ml試管培養(yǎng)物接種到250mL燒瓶中50ml含10 μ g/ml SMM的M2B中。該培養(yǎng)物在27°C以135rpm振蕩培養(yǎng)24小時，然后通過5500x g離心10分鐘分離細胞沉淀和無細胞上清液。將細胞沉淀重懸于40ml dH20，5500x g離心10分鐘，接著重懸于兩倍于其濕重量的提取緩沖液中。加入兩倍于沉淀濕重量的玻璃珠，4°C振蕩試管3小時。將所得的細胞勻漿物以5000x g離心處理10分鐘，上清液保留成無細胞提取物。利用截止值為10000MW的C&M濃縮器(阿米康公司(Amicon))將無細胞上清液由大約50ml濃縮至〉200 μ I。3μ g來自各所選轉(zhuǎn)化體的蛋白質(zhì)(無細胞提取物和濃縮的無細胞上清液)在4-12% Bis Tris SDS PAGE (xt標(biāo)準(zhǔn)，伯樂公司(BioRad))上以MOPS運行緩沖液200V運行大約45分鐘(直到染料前端剛好跑出凝膠底部)。用牛裴(Nupage)轉(zhuǎn)移緩沖液在70V運行90分鐘，以便將蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5% (w/v)奶粉的TBS溶液封閉膜，所述TBS溶液中還含有O. I %吐溫20，通過蛋白質(zhì)印跡用堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗-人κ IgG (西格瑪公司)定位抗體亞基κ。用BCIP/NBT磷酸酶底物(KPL)觀察陽性條帶。在如上所述培養(yǎng)的搖瓶培養(yǎng)物的無細胞上清液中，抗體亞基K清晰可見(見圖17)。無細胞上清液中出現(xiàn)κ蛋白和麗與真實κ標(biāo)準(zhǔn)品不可區(qū)分的現(xiàn)象與κ亞基是分泌的并且經(jīng)歷了適當(dāng)?shù)姆g后修飾(切割Secl分泌信號)相一致。實施例12在發(fā)酵罐中裂殖壺菌表達抗體亞基κ
培養(yǎng)在2. OL(工作容積)發(fā)酵罐中培養(yǎng)看上去細胞外κ亞基表達量最高的兩個克隆(I和3)。有擋板的接種瓶中含有150ml HDl培養(yǎng)基，在29. 5°C下200rpm振蕩培育24-48小時。用接種體培養(yǎng)物接種含有以下物質(zhì)的發(fā)酵罐50g/L葡萄糖、13. 62g/L Na2SO4,O. 72g/L K2S04、0. 56g/L KC1、2. 27g/L MgSO4. 7H20、I. 8g/L KH2P04、17. 5g/L (NH4) 2S04、0. 19g/L CaCl2. 2H20、51. 5mg FeSO4. 7H20、3. lg/L MnCl2. 4H20、6. 2g/L ZnSO4. 7H20、0. 04mgCoCl2. 6H20、0. 04mg Na2MoO4,2. 07g/L CuSO4. 5H20、2. 07g/L NiSO4. 6H20、9. 75mg硫胺、0. 16mg維生素B12和3. 33mg泛酸鈣。在培養(yǎng)過程中，溫度是29. 5°C，d02%控制在20%，葡萄糖濃度保持在15-20g/L(初始水平落入該范圍后)，pH位置在6. 5。在無菌條件下以一定間隔取出樣品進行分析。
檢測K表達在不濃縮的情況下分析無細胞上清液，用布拉德福德(Bradford)法(西格瑪公司的布拉德福德試劑)測定總蛋白，用BSA作為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品。如上述搖瓶培養(yǎng)物中所述，進打蛋白質(zhì)印跡分析以驗證κ亞基表達。按照生產(chǎn)商說明書，用人K-B+F Elisa定量試劑盒(貝司實驗室公司(BethylLaboratories Inc.))和 F0(Fluoro Omega)讀板機(BMG 實驗室技術(shù)公司(BMG Labtech))對κ表達進行定量測定。參見圖18。實施例13構(gòu)建pABOOll表達載體采用提取自裂殖壺菌ATCC 20888的gDNA作模板，用以下引物進行PCR以產(chǎn)生長度為2015bp的擴增子5' 60S-807 TCGATTTGCGGATACTTGCTCACA(SEQ ID NO 47)3' 60S-2821 GACGACCTCGCCCTTGGACAC(SEQ ID NO 48)對擴增子進行凝膠純化，并用作采用以下引物進行的后續(xù)PCR的模板5' 60Sp-1302-Kpn GACTggtaccTTTTTCCGCTCTGCATAATCCTAA(SEQ ID NO 49)3' 60Sp-Bam GACTggatccTTGGCTTTTTCTTTCTTGTTGC(SEQ ID NO 50)純化所得的1017bp擴增子,用KpnI和BamHI消化,并連接到事先純化并用KpnI和BamHI消化的pSchiz-CPT (+)-slGFP (6h)中。利用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過所得集落的限制性消化物純化和篩選質(zhì)粒。用桑格法測序驗證具有預(yù)期限制性消化物圖樣并包含60S長啟動子的一個質(zhì)?？寺?#4. 1)，將其稱為pABOOll，用于轉(zhuǎn)化裂殖壺菌。參見圖24。載體pABOOll于2008年11月18日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(美國弗吉尼亞州瑪納薩斯大學(xué)大道 10801 號專利保藏中心(Patent Depository, 10801 University Boulevard,Manassas, VA 20110-2209))，ATCC 登錄號為 PTA-9614。實施例14構(gòu)建pAB0018表達載體采用提取自裂殖壺菌ATCC 20888的gDNA作模板，用以下引物進行PCR以產(chǎn)生長度為2268bp的擴增子5' EF1-68 CGCCGTTGACCGCCGCTTGACTCT(SEQ ID NO 51)3' EF1-2312 CGGGGGTAGCCTCGGGGATGGACT(SEQ ID NO 52)
對該擴增子進行凝膠純化，并用作采用以下引物進行的后續(xù)PCR的模板5' EFl-54-Kpn GACTggtaccTCTTATCTGCCTCGCGCCGTTGAC(SEQ ID NO 53)3' EFl-1114-Bam GACTggatccCTTGCTTGCTAGTAGTCGCTTTCGAAC(SEQ ID NO :54)純化所得的1060bp擴增子,用KpnI和BamHI消化,并連接到事先純化并用KpnI和BamHI消化的pSchiz-CPT (+) -slGFP (6h)中。利用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過所得集落的限制性消化物純化和篩選質(zhì)粒。用桑格法測序驗證具有預(yù)期限制性消化物圖樣并包含EF-I長啟動子的一個質(zhì)粒克隆(#6. I)，將其稱為PAB0018，用于轉(zhuǎn)化裂殖壺菌。參見圖25。載體PAB0018于2008年11月18日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(美國弗吉尼亞州瑪納薩斯大學(xué)大道 10801 號專利保藏中心(Patent Depository, 10801 University Boulevard,Manassas, VA 20110-2209) )，ATCC 登錄號為 PTA-9616。實施例15
構(gòu)建pAB0022表達載體通過SDS-PAGE分析裂殖壺菌培養(yǎng)物的無細胞上清液，由此選擇稱為Seclp (指Secl蛋白)的一條蛋白質(zhì)條帶，純化至均質(zhì)。用質(zhì)譜技術(shù)鑒定此蛋白的肽片段序列，并利用BLAST算法(tBLASTn，無缺口比對，低復(fù)雜性過濾_關(guān)閉，預(yù)計值=10000，矩陣=PAM30)(ftp://ncbi.nlm.nih. gov/blast)關(guān)聯(lián)于裂殖壺菌全基因組序列的概念翻譯。鑒定編碼所有肽序列的一個開放閱讀框，稱為Seclg (表示Secl基因)。也鑒定和合成位于起始ATG上游的推定啟動子序列(藍色合龍生物技術(shù)公司)。將含有合成Seclg啟動子的載體用作模板，利用以下引物進行PCR:5' SeclP-kpn GACTggtaccCCGTCCTTGACGCCTTCGC(SEQ ID NO 55)3' SecΙΡ-bam =GACTggatccGATGAGTAATGGACGATCTTC (SEQ ID NO 56)純化所得的1438bp擴增子,用KpnI和BamHI消化,并連接到事先純化并用KpnI和BamHI消化的pSchiz-CPT (+) -slGFP (6h)中。利用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過所得集落的限制性消化物純化和篩選質(zhì)粒。用桑格法測序驗證具有預(yù)期限制性消化物圖樣并包含Secl啟動子的一個質(zhì)?？寺?#8. 1)，將其稱為PAB0022，用于轉(zhuǎn)化裂殖壺菌。參見圖26。載體PAB0022于2008年11月18日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(美國弗吉尼亞州瑪納薩斯大學(xué)大道 10801 號專利保藏中心(Patent Depository, 10801 University Boulevard,Manassas, VA 20110-2209))，ATCC 登錄號為 PTA-9613。實施例16異源基因的轉(zhuǎn)錄將延伸因子I(EFl)和60S核糖體單位的編碼基因的啟動子選作在裂殖壺菌中轉(zhuǎn)錄異源基因的啟動子。檢索裂殖壺菌的基因組序列，鑒定顯示與這兩個基因的公開序列同源的基因。通過PCR克隆各啟動子的兩種形式(一個短形式和一個長形式)。也將驅(qū)動SECl基因表達的啟動子選作用于在裂殖壺菌中轉(zhuǎn)錄異源基因的啟動子。因為SECl基因編碼迄今為止在裂殖壺菌屬培養(yǎng)物中鑒定到的唯一一種天然分泌和糖基化的蛋白質(zhì)，所以該啟動子可將異源蛋白的表達安排在最適合產(chǎn)生分泌型糖基化蛋白質(zhì)的生長期。修飾含有SleGFP構(gòu)建體(即N末端具有SECl分泌信號的eGFP基因，表達由OrfC啟動子驅(qū)動-載體CL0001)的載體cpt (+)，以切下OrfC啟動子并用以下序列代替該元件
EFl啟動子(短形式)=來自載體AB0015的EFl-SEFl啟動子(長形式)=來自載體AB0018的EF1-L60S啟動子(短形式)=來自載體AB0010的60S-S60S啟動子(長形式)=來自載體AB0011的60S-LSECl啟動子=來自載體AB0022的Secl如前所述，通過粒子轟擊用5種載體分別轉(zhuǎn)化裂殖壺菌20888。在每個轉(zhuǎn)化中隨機選擇10個活細胞系進行分析。轉(zhuǎn)化CL0001分別用作這5種載體的對照。在轉(zhuǎn)化CL0001時隨機選擇6個活細胞系進行分析。在包含50ml M2B的250mL搖瓶中以29. 5°C培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體細胞系72小時，其間以200rpm連續(xù)振蕩。5000x g離心10分鐘去除生物質(zhì),用Centriprep濃縮器(MWC0 10000)將無細胞上清液濃縮至 Iml0用布拉德福德法測定無細胞上清液樣品的蛋白質(zhì)濃度。在SDS丙烯酰胺凝膠(XT標(biāo)準(zhǔn))上、還原條件下分離無細胞上清液等份，將分離的蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。利用AP-偶聯(lián)的抗-eGFP抗體檢測eGFP，并用NCIP/NBT試劑觀察。在各個泳道中分離最大量(7 μ I)的濃縮上清液，以確定哪種細胞系表達和分泌eGFP (表I)。雖然對單個啟動子而言，eGFP表達水平隨不同啟動子和細胞系而變，但有33種細胞系(來自分析所比較的6個啟動子的55種細胞系)表達eGFP (數(shù)據(jù)未顯示)。表I.表達可檢測量的分泌型eGFP的來自每個轉(zhuǎn)化的細胞系的數(shù)量
權(quán)利要求
1.一種分離的核酸分子,其包含多核苷酸序列SEQ ID NO :3。
2.—種分離的核酸分子,其包含多核苷酸序列SEQ ID NO :4。
3.一種分離的核酸分子，其包含編碼多肽的多核苷酸序列，所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO : I。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的核酸分子，其特征在于，所述多核苷酸序列包含SEQID NO :2。
5.—種分離的核酸分子,其包含編碼多肽的多核苷酸序列，所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO :37。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離的核酸分子，其特征在于，所述多核苷酸序列包含SEQID NO :38。
7.一種分離的核酸分子，其包含多核苷酸序列SEQ ID NO 420
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的分離的核酸分子，其包含多核苷酸序列SEQID NO 430
9.一種分離的核酸分子,其包含多核苷酸序列SEQ ID NO :44。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離的核酸分子，其特征在于，其包含多核苷酸序列SEQIDNO :45。
11.一種分離的核酸分子，其包含多核苷酸序列SEQ ID NO :46。
12.—種分離的核酸分子,其包含與權(quán)利要求1-11中任一項所述的多核苷酸序列完全互補的多核苷酸序列。
13.—種重組核酸分子，其包含權(quán)利要求1-12中任一項所述的分離的核酸分子或其組入口 o
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的重組核酸分子，其特征在于，所述重組核酸分子為載體。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的重組核酸分子，其特征在于，所述分離的核酸分子操作性連接于編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的重組核酸分子，其特征在于，所述蛋白質(zhì)操作性連接于分泌信號。
17.—種宿主細胞，其包含權(quán)利要求1-12中任一項所述的分離的核酸分子和權(quán)利要求13-16中任一項所述的重組核酸分子或其組合。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞是破囊壺菌目的成員。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞是裂殖壺菌屬或破囊壺菌屬。
20.一種產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，其包括 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)破囊壺菌目重組微生物來表達蛋白質(zhì)，其中所述重組微生物包含操作性連接于編碼所述蛋白質(zhì)的多核苷酸序列的權(quán)利要求1-12中任一項所述的分離的核酸分子。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，從分離的破囊壺菌生物質(zhì)回收所述蛋白質(zhì)。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)在所述微生物中積累。
23.根據(jù)權(quán)利要求20-22中任一項所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)在所述微生物的膜中積累。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，從培養(yǎng)基中回收所述蛋白質(zhì)。
25.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)是分泌的蛋白質(zhì)。
26.一種分離的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:l。
27.一種分離的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO 150
28.一種轉(zhuǎn)化宿主細胞的方法，其包括(a)用具有蛋白酶活性的酶預(yù)處理所述宿主細胞；(b)通過電穿孔將核酸分子引入所述宿主細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及網(wǎng)粘菌門的重組細胞和微生物以及它們在異源蛋白質(zhì)生產(chǎn)中的應(yīng)用，與從重組宿主細胞和微生物有效產(chǎn)生和任選地分泌多肽有關(guān)的新穎啟動子、終止子和信號序列也包含在本發(fā)明中。
文檔編號C07H21/04GK102648207SQ201080022277
公開日2012年8月22日 申請日期2010年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月16日
發(fā)明者D·辛普森, J·C·利普邁耶, J·P·懷恩, J·王, K·E·阿普特, R·澤克爾 申請人:馬太克生物科學(xué)公司