專利名稱：重組質(zhì)粒pdsbcm,轉化微生物,產(chǎn)生一種堿性蛋白梅vapk的方法
技術領域：
本項發(fā)明涉及一種包含有編碼一種堿性蛋白酶VapK的基因vapk二聚體的重組性質(zhì)粒載體pDSBCm，該重組性質(zhì)粒載體轉化的一種微生物metschnikovii弧菌，以及應用該微生物來產(chǎn)生一種堿性蛋白酶VapK的方法。
應用上述的微生物來產(chǎn)生堿性蛋白酶的最重要的因素，是堿性蛋白酶的高生產(chǎn)率問題，這可以影響生產(chǎn)過程中的成本。
根據(jù)最近的發(fā)明，為了提高堿性蛋白酶的生產(chǎn)率，包含有編碼堿性蛋白酶的重組性載體可以應用基因工程的技術加以制備，并且由此制備而來的轉化體。
本發(fā)明人此前所申報的一份名為“用于洗衣店去污劑的堿性蛋白酶VapK，vapk基因，重組性表達載體，以及經(jīng)轉化的微生物”專利申請(KR1999-12588)，其中的微生物是metschnikovii弧菌KS1，并且重組性表達載體為pSBCm。本發(fā)明應用了與之相同的微生物和重組性表達載體。
為了得到具高度活性堿性蛋白酶的轉化微生物，本發(fā)明人曾經(jīng)進行了深入細致和廣泛地研究并加以驗證，并且制備了一種包含有雙重堿性蛋白酶基因的重組性質(zhì)粒載體，分離自metschnikovii弧菌KS1，而且，轉化的metschnikovii弧菌帶有上述的重組性質(zhì)粒載體，因此，產(chǎn)生了帶有已提高了蛋白酶活性的質(zhì)粒載體的轉化微生物。
本發(fā)明還提供了一種得到上述重組性質(zhì)粒載體pDSBCm的方法，得到重組性質(zhì)粒載體pDSBCm包括以下步驟將par基因插入到包含編碼堿性蛋白酶的vapk基因以制備重組性質(zhì)粒載體pSP1，其中的par基因具有改善質(zhì)粒載體自身的穩(wěn)定性的功能；反向定位重組性質(zhì)粒載體pSP1的基因vapk，以制備一種重組性質(zhì)粒載體pSPR1；應用限制性內(nèi)切酶EcoRI在pSPR1的vapk基因和par基因之間進行酶切消化，經(jīng)核酸外切酶Bal31進行處理，并且應用連接酶加以連接制備而成縮短了長度的一種質(zhì)粒性載體pSPR1-47；應用HindIII對質(zhì)粒性載體pSPR1-47進行酶切消化，并將vapk基因插入到經(jīng)HindIII酶切過的pSPR1-47中。
還有，本發(fā)明提供了一種已轉化的宿主細胞，它包含有所述重組性質(zhì)粒載體pDSBCm。
此外，本發(fā)明提供了一種已轉化的宿主細胞，該宿主細胞包括埃菲氏屬大腸桿菌或者metschnikovii弧菌。
本發(fā)明還提供了一種應用上述的轉化的宿主細胞產(chǎn)生一種堿性蛋白酶VapK的方法。


圖1說明了包含有編碼一種堿性蛋白酶vapk基因的重組性質(zhì)粒載體pSBCm的電泳結果。電泳泳道M代表的是標準參照物的大小，電泳泳道1代表的是重組性質(zhì)粒載體pSBCm，電泳泳道2代表的是重組性質(zhì)粒載體pSBCm/HindIII，它由一種2.2千堿基對的運載體pKF3和一種2.9千堿基對的弧菌的堿性蛋白酶基因所組成。
圖2說明了分離自應用pSBCm轉化過的metschnikovii弧菌KS1和埃菲氏屬大腸桿菌的每個堿性蛋白酶VapK的SDS-PAGE結果。電泳泳道M代表的是標準參照物的大小，電泳泳道1代表的是已轉化的埃菲氏屬大腸桿菌的堿性蛋白酶的表達，電泳泳道2代表的是metschnikovii弧菌KS1表達的2.9千堿基對的堿性蛋白酶。
圖3說明了在脫脂乳瓊脂培養(yǎng)基中的每個堿性蛋白酶VapK的活性檢測的結果，堿性蛋白酶VapK分離自應用pSBCm轉化過的metschnikovii弧菌KS1和埃菲氏屬大腸桿菌。電泳泳道1代表的是已轉化的埃菲氏屬大腸桿菌表達的堿性蛋白酶的活性，電泳泳道2代表的是mestchnikovii弧菌KS1表達的堿性蛋白酶的活性。
圖4說明了包含有堿性蛋白酶基因vapk的重組性質(zhì)粒載體pSBCm的限制性內(nèi)切酶譜。
圖5說明了包含有堿性蛋白酶基因vapk和par基因的重組性質(zhì)粒載體pSP1的限制性內(nèi)切酶譜。
圖6說明了包含有par基因和反向堿性蛋白酶基因vapk的重組性質(zhì)粒載體pSPR1的限制性內(nèi)切酶譜。
圖7說明了包含有par基因和反向堿性蛋白酶基因vapk的長度縮短的重組性質(zhì)粒載體pSPR1-47的限制性內(nèi)切酶譜。
圖8說明了包含有編碼雙重堿性蛋白酶的vap堪因的重組性質(zhì)粒載體pDSBCm的限制性內(nèi)切酶譜。
圖9說明了的metschnikovii弧菌KS1、metschnikovii弧菌pSBCm、和metschnikovii弧菌pDSBCm之間堿性蛋白酶活性比較的結果。
本發(fā)明的詳細描述本發(fā)明提供了一種由包含有編碼一種堿性蛋白酶VapK的基因二聚體的重組性質(zhì)粒載體轉化的微生物，并且提供了一種應用上述的微生物生產(chǎn)出更高產(chǎn)量的堿性蛋白酶VapK的方法。
其中所應用的專業(yè)術語“基因二聚體”的意思是把帶有相同核苷酸序列的兩個基因可操作性的連接在一起。
本發(fā)明中，編碼堿性蛋白酶的基因是經(jīng)過以下的幾個步驟加以分離的培養(yǎng)metschnikovii弧菌KS1，離心并回收metschnikovii弧菌KS1細胞，使這些細胞破裂并將其離心以獲得無細胞的上清液，以及從這種無細胞的上清液中提取metchnikovii弧菌KS1的染色體DNA。應用以上提取的metschnikovii弧菌KS1的染色體DNA，形成轉化的埃菲氏屬大腸桿菌，即通過應用如HindIII的限制性內(nèi)切酶，酶切消化上述的metschnikovii弧菌KS1的染色體DNA，形成DNA片段，將這些DNA片段克隆入質(zhì)粒載體中，構建成為pSBCm、pSP1、pSPR1、pSPR1-47和pDSBCm，并將這些載體轉化入埃菲氏屬大腸桿菌中。
首先，堿性蛋白酶的表達是通過應用上面所提及的重組埃菲氏屬大腸桿菌加以引導的，該大腸桿菌中包含有質(zhì)粒載體pSBCm，并且在堿性的情況下，由轉化的埃菲氏屬大腸桿菌所產(chǎn)生的堿性蛋白酶的表達水平是可以測量的。在這種結果的基礎上，正如我們以前所知道的，上面所提及的轉化的埃菲氏屬大腸桿菌的堿性蛋白酶的表達水平是較低的。
為了解決上述問題，本發(fā)明人將重組性質(zhì)粒載體pDSBCm，克隆入metschnikovii弧菌中形成了metschnikovii弧菌pDSBCm。結果，由metschnikovii弧菌pDSBCm菌株表達出的堿性蛋白酶的活性，比由宿主菌株metschnikovii弧菌KS1表達出的堿性蛋白酶的活性高了2.5倍。
本發(fā)明中應用的metschnikovii弧菌KS1菌株，收錄于漢城的韓國微生物培養(yǎng)中心，其登記時間是1998年12月15日，編碼為KFCC-10141。該菌株通過應用N，N-亞硝基胍(NTG)作為突變劑，處理metschnikovii弧菌RH530 N-4-8而產(chǎn)生的，并且metschnikovii弧菌RH 530 N-4-8則收錄于漢城的韓國微生物培養(yǎng)中心，其登記時間是1998年2月23日，編碼為KFCC-11030。結果，由metschnikovii弧菌KS1菌株產(chǎn)生的堿性蛋白酶的量，是metschnikovii弧菌RH 530 N-4-8菌株的兩倍。
還有，包含有本項發(fā)明中重組性質(zhì)粒載體pSBCm的埃菲氏屬大腸桿菌Top10F′菌株，則收錄于漢城的韓國微生物培養(yǎng)中心，其登記時間是1998年12月15日，編碼為KCCM-10142。
在下文中，將通過以下提供的諸多例證，更加詳細地描述了本項發(fā)明的特殊功效，沒有限制在本項發(fā)明應用范圍。
以每分鐘6,000轉離心在上述實施例1的LSC培養(yǎng)基中培養(yǎng)的metschnikovii弧菌KS1菌株10分鐘，獲得上清，作為本項發(fā)明的一個酶的樣本。轉化的埃菲氏大腸桿菌pSBCm菌株生長后，收集和碎裂生長細胞。以每分鐘6，000轉離心碎裂溶液，留取上清液，作為本項發(fā)明的另一酶的樣本。把上述的每一個酶樣本按同樣的比率，加入到含有50mM濃度的磷酸緩沖液、pH7.0、10％(w/v)甘油和0.002％溴酚蘭的緩沖液中，然后在凝膠中電泳。在含有脫脂乳和酸堿度為10.0、50毫摩爾濃度的碳酸鈉的緩沖液的瓊脂平板中，分析堿性蛋白酶的活性。結果如圖3所示，證實了堿性蛋白酶的活性。
為了增加重組質(zhì)粒載體pSBCm的穩(wěn)定性，把基因par克隆入pSBCm的PvuII和HincII的識別位點之間，制備包含堿性蛋白酶基因vapk和par的重組質(zhì)粒載體pSP1(圖5)。
在圖6中，制備含有反向vapk和par基因的重組質(zhì)粒載體pSPR1作為中間產(chǎn)物，目的是為了減少堿性蛋白酶基因vapk在重組質(zhì)粒載體pSP1中的長度。
為了減少堿性蛋白酶vapk在重組質(zhì)粒載體pSPR1中的長度，制備含有反向堿性蛋白酶基因的重組質(zhì)粒載體pSPR1(圖6)。用EcoRI消化上述的重組質(zhì)粒載體pSPR1，EcoRI識別位點在堿性蛋白酶基因vapk和par之間，然后用核酸外切酶Bal31處理，用連接酶退火后制備重組質(zhì)粒載體pSPR1-47(圖7)。
再把實施例1中克隆的2.9kb的堿性蛋白酶基因vapk插入到重組質(zhì)粒載體pSPR1-47的HindIII識別位點，制備重組質(zhì)粒pDSBCm(圖8)。
埃菲氏大腸桿菌HB101菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，把100mM濃度的氯化鈣添加到埃菲氏大腸桿菌HB101的發(fā)酵培養(yǎng)基中。該混合物在0℃儲存15分鐘，然后離心收集埃菲氏大腸桿菌HB101。將沉淀細胞懸浮在100mM氯化鈣溶液中，在0℃儲存15分鐘。把重組質(zhì)粒載體pSBCm添加到懸浮溶液中，在0℃儲存1小時。該上清液在42℃加熱90秒，然后在0℃儲存5分鐘。在上清液中加入1ml的LB培養(yǎng)基，然后鋪在含有34μg/ml的氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基中，30℃孵化24小時，挑選生長的克隆。
在30℃下的LB培養(yǎng)基中孵育培養(yǎng)metschnikovii弧菌KS1菌株后，通過在4℃下，每分鐘6,000轉離心10分鐘，重新獲得生長的細胞，并且將它們以20∶1的體積比，懸浮于一種H-緩沖溶液中，該緩沖液包含有200mM濃度的蔗糖，1mM濃度的HEPES和10％的丙三醇。在重復上述實驗步驟兩次以后，細胞被懸浮在80μl的H-緩沖溶液中。將重組性質(zhì)粒載體添加入懸浮液中，并且將這種溶液倒入-0.2厘米的試管中。在1,500V的電壓、10μF和200Ω下，將含有細胞懸液的試管放入由Bio-Rad公司制造的基因電脈沖儀II中。添加600μl的LB培養(yǎng)基入電穿孔處理溶液并在30℃下孵育。培養(yǎng)基覆蓋在含有25μg/ml氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上面，挑選生長的克隆。
檢測結果是，由轉化的菌株metschnikovii弧菌pDSBCm所表達堿性蛋白酶的活性，比由宿主菌株metschnikovii弧菌KS1表達出的堿性蛋白酶的活性高了2.5倍。本發(fā)明的重組性質(zhì)粒載體的保藏metschnikovii弧菌pDSBCm菌株包含有發(fā)明中的重組性質(zhì)粒載體pDSBCm貯存收錄于漢城的韓國微生物培養(yǎng)中心，其登記時間是2000年7月4日，編碼為KFCC-11180，并且根據(jù)布達佩斯條約的規(guī)則，在2001年7月9日，在同一中心，其貯存編碼改變?yōu)樾碌娜雰跃幋aKCCM-10292。
產(chǎn)業(yè)上的適用性根據(jù)本項發(fā)明的方法所制備的包含有堿性蛋白酶基因二聚體的重組性質(zhì)粒載體轉化體，其生產(chǎn)堿性蛋白酶的能力明顯強于以前的弧菌菌株。因此，包含有本項發(fā)明中的重組性質(zhì)粒載體的轉化的metschnikovii弧菌菌株，能夠作為一種堿性蛋白酶的生產(chǎn)菌株，更有效地加以應用。
國際表至Shin，Kyung Shik第一制糖株式會社韓國漢城市中區(qū)根據(jù)條約7.1條，本頁下面指明的國際南大門路5街500保藏單位出具的原始保藏存單

權利要求
1.一種包含有vapk基因二聚體的重組性質(zhì)粒載體pDSBCm，該基因編碼一種堿性蛋白酶的vapk。
2.一種制備權利要求1中的重組性質(zhì)粒載體pDSBCm的方法，該方法包括通過par基因插入到包含有vapk基因的重組性質(zhì)粒載體pSBCm中，所包含的vapk基因可編碼一種堿性蛋白酶以制備重組性質(zhì)粒載體pSP1，其中par基因具有改善質(zhì)粒載體自身的穩(wěn)定性的功能；反向定位重組性質(zhì)粒載體pSP1的基因vapk，以制備一種重組性質(zhì)粒載體pSPR1；應用限制性內(nèi)切酶EcoRI在pSPR1的vapk基因和par基因之間進行酶切消化，經(jīng)核酸外切酶Bal31進行處理，并且應用連接酶加以連接制備而成縮短了長度的一種質(zhì)粒性載體pSPR1-47；且，應用HindIII對質(zhì)粒性載體pSPR1-47進行酶切消化，并將vapk基因插入到經(jīng)HindIII酶切過的pSPR1-47中。
3.一種轉化的宿主細胞，它包含有權利要求1中的重組性質(zhì)粒載體pDSBCm。
4.根據(jù)權利要求3中的轉化宿主細胞，其中所述宿主細胞包含有埃菲氏屬大腸桿菌或者metschnikovii弧菌。
5.一種產(chǎn)生堿性蛋白酶VapK的方法應用權利要求3或4中的轉化宿主細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及到了一種包含有編碼一種堿性蛋白酶VapK的基因vapk重復區(qū)的重組性質(zhì)粒載體pDSBCm，該重組性質(zhì)粒載體轉化的一種微生物metschnikovii弧菌，以及應用該微生物來產(chǎn)生一種堿性蛋白酶VapK的方法。
文檔編號C12N1/21GK1441846SQ01812799
公開日2003年9月10日 申請日期2001年7月19日 優(yōu)先權日2000年7月19日
發(fā)明者秦基洪, 李賢煥, 盧賢模, 金炯錫 申請人:第一制糖株式會社