一種利用重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)多佐胺中間體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] -種利用重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)多佐胺中間體的方法，屬于微生物基因工程領(lǐng) 域。本發(fā)明還涉及一種多佐胺中間體的制備，該化合物可以用來制備治療青光眼用藥多佐 胺。
【背景技術(shù)】
[0002] 青光眼是一類以特異性視神經(jīng)損害和視野缺損為特征的眼病，是目前主要的、不 可逆性的致盲眼病之一。而多佐胺是一種局部眼用碳酸酐酶抑制劑，廣泛用于高眼壓癥、青 光眼等，全身性不良反應(yīng)少。多佐胺由美國默克公司自主研發(fā)，是第一個(gè)獲美國FDA批準(zhǔn)的 首只碳酸酐酶抑制劑，于1995年在美國上市。
[0003]多佐胺（Dorzolamide):由默沙東公司開發(fā)商品名"舒凈霹"（Trusopt)，F(xiàn)DA于 1994年12月批準(zhǔn)的首只眼用CAI，適用于P-受體阻滯劑治療無效的原發(fā)性開角型青光眼 和剝脫綜合征繼發(fā)性青光眼。本品于1998年1月8日在中國獲行政保護(hù)，已于2005年7 月8日終止，但目前尚未進(jìn)口，亦無國內(nèi)企業(yè)生產(chǎn)及申報(bào)。多佐胺結(jié)構(gòu)見附圖1:
[0004] 多佐胺的化學(xué)合成中涉及到手性中間體的合成，而常規(guī)的合成路線選擇性不明 顯，且手性化合物合成成本較高，因此導(dǎo)致終產(chǎn)品的成本升高；而有的合成路線經(jīng)過改良， 縮減了反應(yīng)步驟，操作簡單，但反應(yīng)產(chǎn)品的構(gòu)型幾乎都是不需要的順式異構(gòu)體。因此，有必 要需找一條更加經(jīng)濟(jì)、高效的制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對目前化學(xué)合成法獲得多佐胺成本高，污染大，提取率低的缺陷，本發(fā)明要解決 的問題是提供一種利用重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)多佐胺關(guān)鍵中間體的方法。
[0006] 本發(fā)明通過將經(jīng)密碼子優(yōu)化后的乙醇脫氫酶基因連接商業(yè)化的表達(dá)載體上，在大 腸桿菌中過量表達(dá)該乙醇脫氫酶，以多佐胺中間體^s)-甲基酮砜為底物，催化產(chǎn)生多佐 胺的手性中間體。
[0007] 本發(fā)明所述的一種利用重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)多佐胺手性中間體的方法，其特征 在于，所述的重組大腸桿菌由如下方法構(gòu)建：利用公布的乙醇脫氫酶的基因序列，按照大腸 桿菌偏愛的密碼子進(jìn)行突變，通過引入酶切序列，將全基因合成并引入pET_28a表達(dá)質(zhì)粒 上，構(gòu)建了可表達(dá)乙醇脫氫酶的重組質(zhì)粒pET-mADH將所構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-mADH轉(zhuǎn)化至 大腸桿菌中，得到過量表達(dá)乙醇脫氫酶基因的重組大腸桿菌。
[0008] 其中，所述的乙醇脫氫酶結(jié)構(gòu)基因來源于來源于粗糙脈胞菌（Neurospora crassa)〇
[0009] 上述表達(dá)乙醇脫氫酶基因的載體為pet_28a，該質(zhì)粒來源于Novagen公司。
[0010] 本發(fā)明所述重組大腸桿菌的構(gòu)建步驟：
[0011] 1?乙醇脫氫酶基因的優(yōu)化
[0012] 基本方法是根據(jù)粗糙脈胞菌（Neurosporacrassa)的乙醇脫氫酶基因，通過優(yōu)化 乙醇脫氫酶的密碼子，消除一些低使用率的密碼子，同時(shí)通過同義轉(zhuǎn)換，優(yōu)化mRNA的一級 結(jié)構(gòu)，使得核糖體能夠順利地沿著起始密碼子向后翻譯。并利用同義轉(zhuǎn)化方法消除NdeI和 XhoI酶切位點(diǎn)。通過個(gè)全基因合成，合成乙醇脫氫酶基因。
[0013] 2.乙醇脫氫酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建
[0014] 基本方法是通過全基因合成的方法合成優(yōu)化后的乙醇脫氫酶基因，然后根據(jù)設(shè)計(jì) 的酶切位點(diǎn)，將乙醇脫氫酶基因片段連接到pET-28a質(zhì)粒上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-mADH。
[0015] 3.乙醇脫氫酶重組表達(dá)菌株的構(gòu)建
[0016] 基本方法是將所構(gòu)建的重組質(zhì)pET-mADH轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，從而獲得過量表達(dá) 乙醇脫氫酶的重組大腸桿菌。
[0017] 本發(fā)明所述重組大腸桿菌在生產(chǎn)多佐胺中間體中的應(yīng)用，具體方法是：
[0018] 挑取重組大腸桿菌單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素50iig/mL)中， 37°〇、200印111過夜培養(yǎng)后，按2%接種量接入2501^搖瓶完全培養(yǎng)基（1%胰蛋白胨，0.5%酵 母抽提物，1%NaCl，pH7. 0-7. 2)，在旋轉(zhuǎn)式搖床中30°C、200rpm培養(yǎng)24h。超聲破菌，離心 收集酶液，在PH4. 0,以^S)-甲基酮砜為底物，催化產(chǎn)生多佐胺的手性中間體。
【附圖說明】
[0019] 附圖1多佐胺的結(jié)構(gòu)式
[0020] 附圖2pET-mADH的結(jié)構(gòu)示意圖
[0021] 附圖3純化后的乙醇脫氫酶HPLC圖
【具體實(shí)施方式】
[0022] -般性說明：實(shí)施例所涉及的酶均購自promega公司，質(zhì)粒提取試劑盒與瓊脂糖 凝膠回收試劑盒均購自omega公司，操作完全按照相應(yīng)說明進(jìn)行。全基因合成由上海生工 公司完成。
[0023]LB培養(yǎng)基（％):1%胰蛋白胨，0.5%酵母抽提物，1%NaCl，pH7.0_7.2。
[0024] 1^11抗性平板：1%胰蛋白胨，0.5%酵母抽提物，1%似(]，卡納青霉素5〇1^/1]11。
[0025] SOC培養(yǎng)基（用于感受態(tài)細(xì)胞的復(fù)蘇）：2% (W/V)胰蛋白胨，0? 5%(W/V)酵母抽 提物，0? 05% (W/V)NaCl, 2. 5mMKCl，10mMMgC12,20mM葡萄糖。
[0026] 5XKCM(大腸桿菌轉(zhuǎn)化緩沖液）：0? 5MKC1, 0? 15MCaC12, 0? 25MMgCL20
[0027] 實(shí)施例I:脯氨酸-4-羥化酶基因序列的設(shè)計(jì)
[0028] 根據(jù)大腸菌桿的密碼子使用頻率來優(yōu)化基因密碼子，消除低使用率的密碼子，同 時(shí)利用同義轉(zhuǎn)化方法消除NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)，故將原始序列中的并將終止子修改為 TAAT強(qiáng)終止子，為了便于將乙醇脫氫酶基因連接到其他質(zhì)粒載體上，因此在終止子后面插 入一個(gè)酶切位點(diǎn)XhoI(CTCGAG)。
[0029] 本實(shí)施方式中乙醇脫氫酶基因序列的原始序列，見GenbankAccession號 3873329。本實(shí)施方式中優(yōu)化的乙醇脫氫酶基因序列提交給上海生工公司人工合成；優(yōu)化的 乙醇脫氫酶基因序列見SEQIDNO:1。
[0030] 實(shí)施例2 :乙醇脫氫酶基因基因表達(dá)載體及重組大腸桿菌的構(gòu)建
[0031] 將全合成的乙醇脫氫酶基因基因用限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI酶雙酶切，同時(shí)， 將質(zhì)粒載體pet-28a也分別用NdeI和XhoI酶雙酶切。將雙切酶后的乙醇脫氫酶基因基 因以及pET-28a質(zhì)粒載體用瓊脂糖凝膠試劑盒回收，然后用T4DNA連接酶將三個(gè)基因片段 連接起來。連接體系為10PL:
[0032] 乙醇脫氫酶基因：5 ii L
[0033]pet_28a質(zhì)粒：1UL
[0034]IOXbuffer：1. 0 U L
[0035]T4DNAligase：2UL
[0036] 無菌水補(bǔ)充至10UL，16°C連接過夜后，將5iiL的連接液轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感 受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化過程為：將5iiL連接液加入至50iiL的DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，然后再加入 10yL的5XKCM緩沖液，混勻后，在冰上放置30min后，42°C熱激90s，然后在冰上放置5min 后，加入500iiL的SOC培養(yǎng)基，37°C，200rpm培養(yǎng)60min后，涂布至Kan抗性平板上，培養(yǎng) 12h后，提取質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證。然后進(jìn)一步測序驗(yàn)證基因序列是否正確。從而得到了構(gòu)建好 的pET-mADH重組質(zhì)粒，質(zhì)粒圖譜如說明書附圖2，同時(shí)獲得重組大腸桿菌BL21/pET-mADH， 純化后的乙醇脫氫酶的純度高達(dá)99%，見附圖3。
[0037] 實(shí)施例3:重組菌株的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)
[0038] 挑取重組大腸桿菌單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基（舍氨芐青霉素50iig/mL)中， 37°C、200rpm過夜培養(yǎng)后，按2 %接種量接入250mL搖瓶完全培養(yǎng)基（1 %胰蛋白胨，0. 5 % 酵母抽提物，1%NaCl，pH7. 0-7. 2)，在旋轉(zhuǎn)式搖床中30°C、200rpm培養(yǎng)24h。超聲破菌，離 心收集酶液，在PH4. 0,以20g(6S)_甲基酮砜為底物，催化產(chǎn)生多佐胺的手性中間體。發(fā)酵 16小時(shí)后過濾，濾液濃素至干，加入200毫升乙酸乙酯和100毫升水，攪拌、分液，水相乙酸 乙酯提取兩次，合并有機(jī)相，飽和食鹽水洗滌，濃縮至干，得到白色固體，固體用乙酸乙酯重 結(jié)晶，得到13. 6g中間體，收率68 %。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 優(yōu)化后的乙醇脫氫酶基因，其特征在于：其核苷酸序列為SEQ IDNO. 1所示。2. -株重組大腸桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟： 將權(quán)利要求1所述的優(yōu)化后的乙醇脫氫酶基因可操作的連接到表達(dá)載體上，構(gòu)建得到 重組質(zhì)粒；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主大腸桿菌中，得到產(chǎn)乙醇脫氫酶的重組菌。3. 如權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的表達(dá)載體為pET-28a質(zhì)粒。4. 由權(quán)利要求2或3所述構(gòu)建方法得到的重組大腸桿菌。5. 權(quán)利要求4所述的重組大腸桿菌在生產(chǎn)多佐胺中間體中的應(yīng)用。6. 按照權(quán)利要求5所述的應(yīng)用.，其特征在于，包括：將所述的重組大腸桿菌接種到培 養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)；超聲破碎，離心收集酶液，催化產(chǎn)生多佐胺的手性中間體。7. 按照權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于：在pH4.0,以（6S)-甲基酮砜為底物的條 件下催化產(chǎn)生多佐胺的手性中間體。
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，利用一種重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)多佐胺中間體的方法，該重組大腸桿菌的構(gòu)建方法如下：利用公布的乙醇脫氫酶的基因序列，按照大腸桿菌偏愛的密碼子進(jìn)行突變，通過引入酶切序列，將全基因合成并引入pET-28a表達(dá)質(zhì)粒上，構(gòu)建了可表達(dá)乙醇脫氫酶的重組質(zhì)pET-mADH。本發(fā)明所述的大腸桿菌產(chǎn)生的重組乙醇脫氫酶可通過底物催化合成多佐胺的中間體，搖瓶發(fā)酵表明，本發(fā)明的重組大腸桿菌的乙醇脫氫酶的表達(dá)量達(dá)到0.53g/L，說明該工程菌具有良好的工業(yè)開發(fā)前景。
【IPC分類】C12N15/53, C12R1/19, C12N15/70, C12N1/21, C12P17/18
【公開號】CN105087608
【申請?zhí)枴緾N201410186709
【發(fā)明人】陳建華
【申請人】陳建華
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2014年5月6日