一種提高氧化葡萄糖酸桿菌同源重組效率的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種提高氧化葡萄糖酸桿菌同源重組效率的方法，屬于基因工程領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 氧化葡萄糖酸桿菌是維生素C經(jīng)典兩步發(fā)酵法的生產(chǎn)菌株之一，也是目前維生素 C一步發(fā)酵法研宄最具潛力的菌株。為了探宄該菌維C相關(guān)代謝網(wǎng)絡(luò)及有效利用各種代 謝工程，基因工程等手段改造氧化葡萄糖酸桿菌，尤其是基因組改造，同源重組效率不可忽 視。傳統(tǒng)的基因工程模式菌株，如大腸桿菌，釀酒酵母，同源重組效率都很高。而氧化葡萄 糖酸桿菌的同源重組效率非常低下，嚴(yán)重阻礙了對(duì)氧化葡萄糖酸桿菌基因組水平的改造。
[0003] Red重組酶系統(tǒng)來(lái)源于A噬菌體，包括Exo、Beta、Gam三種蛋白，各蛋白協(xié)同作 用可指導(dǎo)同源重組過(guò)程。本發(fā)明將外源Red重組酶引入氧化葡萄糖酸桿菌（G.oxydans WSH-003)，得到重組菌G. oxydans WSH-003/Red，并轉(zhuǎn)入同源片段進(jìn)行同源重組。經(jīng)驗(yàn)證， G. oxydans WSH-003/Red重組效率相比野生菌有了極大提高。此外，本發(fā)明以片段作為同源 臂供體，利用外源重組酶輔助氧化葡萄糖酸桿菌同源重組改造。證明外源Red重組酶參與 并有效促進(jìn)了氧化葡萄糖酸桿菌的同源重組過(guò)程，并且以片段作為同源臂供體相對(duì)于質(zhì)粒 載體更加簡(jiǎn)化。這對(duì)氧化葡萄糖酸桿菌甚至葡萄糖酸桿菌屬基因組改造都均有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的第一個(gè)問(wèn)題是提供一種同源重組效率提高的氧化葡萄糖酸桿菌 工程菌，是表達(dá)了外源Red重組酶。
[0005] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，編碼所述Red重組酶的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
[0006] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將攜帶編碼Red重組酶的重組載體PKD46轉(zhuǎn)入氧化 葡萄糖酸桿菌，獲得所述氧化葡萄糖酸桿菌工程菌。
[0007] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述重組載體pKD46的構(gòu)建是以質(zhì)粒pINT-ts為 載體，通過(guò)酶切連接的方法，將來(lái)源于噬菌體的y、e、ex〇三個(gè)基因置于ParaB啟動(dòng)子 控制之下° 具體參見(jiàn) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA, 2000Jun 6 ；97 (12):6640-5. DatsenkoKA,WannerBL0
[0008] 本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種構(gòu)建所述同源重組效率提高的氧化 葡萄糖酸桿菌工程菌的方法，是將編碼Red重組酶的基因連接表達(dá)載體后轉(zhuǎn)入氧化葡萄糖 酸桿菌。
[0009] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是將攜帶編碼Red重組酶的重組載體PKD46通過(guò)電 轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入氧化葡萄糖酸桿菌。
[0010] 所述電轉(zhuǎn)條件：1800V電場(chǎng)強(qiáng)度，200 D電阻和25 y F電容。電轉(zhuǎn)后涂布于氨芐青 霉素抗性山梨醇培養(yǎng)基平板，通過(guò)控制培養(yǎng)溫度（30°C )和抗性濃度（50 yg/ml)篩選重組 菌 G.oxydans WSH-003/Red〇
[0011] 所述山梨醇培養(yǎng)基（g/L):山梨醇15,酵母粉1. 0, pH 4. 8?5. 1，瓊脂20 (固體培 養(yǎng)基），121°C 滅菌 15min。
[0012] 本發(fā)明要解決的第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種應(yīng)用所述同源重組效率提高的氧化 葡萄糖酸桿菌工程菌進(jìn)行同源重組（敲除）的方法，所述方法主要包括（1)分別截取目標(biāo) 基因序列上游SOO-IOOObp和下游SOO-IOOObp作為上游同源臂和下游同源臂，（2)設(shè)計(jì)引 入酶切位點(diǎn)的融合PCR引物，擴(kuò)增并融合上下游同源臂，（3)標(biāo)記基因通過(guò)酶切連接插入上 下游同源臂之間，構(gòu)建得到重組用的同源片段，（4)將同源片段轉(zhuǎn)化氧化葡萄糖酸桿菌工程 菌，利用標(biāo)記基因篩選得到目標(biāo)菌株。
[0013] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述標(biāo)記基因包括卡那基因（kana)和胞嘧啶脫氨 酶基因（codBA)，分別來(lái)自質(zhì)粒pBBRMCS-2和大腸桿菌（E. coli K12)基因組。
[0014]目前用于氧化葡萄糖酸桿菌大規(guī)?；蛲粗亟M的手段極其有限，本發(fā)明提供的 提高氧化葡萄糖酸桿菌同源重組效率的方法，將為利用同源重組進(jìn)行多基因敲除或整合提 供有效途徑。此外，現(xiàn)有氧化葡萄糖酸桿菌同源重組主要是基于載體利用野生菌本身的重 組系統(tǒng)進(jìn)行同源重組，本發(fā)明通過(guò)外源引入同源重組酶并采用同源片段進(jìn)行同源重組，簡(jiǎn) 化了質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程，有效提高了同源重組效率。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1為同源片段構(gòu)建過(guò)程
【具體實(shí)施方式】
[0016] 實(shí)施例 1 質(zhì)粒 pKD46 導(dǎo)入 G. oxydans WSH-003
[0017] 通過(guò)電轉(zhuǎn)化將pKD46導(dǎo)入G. oxydans WSH-003。具體過(guò)程分三步：
[0018] 1.電轉(zhuǎn)感受態(tài)制備：
[0019] 1)取G. oxydans WSH-003甘油管在山梨醇平板上劃線，30°C培養(yǎng)24-48h至可辨別 單菌落；
[0020] 2)挑取一個(gè)單菌落接入裝有25ml山梨醇液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，30°C、 220rpm 預(yù)培養(yǎng) 24-36h，至 0D_>2 ;
[0021] 3)取2. 5ml預(yù)培養(yǎng)的菌液接入裝有25ml山梨醇培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，30°C、 220rpm 培養(yǎng) 6-8h 后測(cè) 0D_，至 OD6tltl到 1. 6-1. 8 ;
[0022] 4) 4°C 下 5000rpm 離心 5min，去上清；
[0023] 5)將菌體置于冰上，加20ml預(yù)冷卻至0°C的10%甘油溶液重懸菌體，使菌體充分 擴(kuò)散；
[0024] 6) 4°C，5000rpm 離心 5min，去上清；
[0025] 7)重復(fù)步驟5)和6);
[0026] 8)將菌體置于冰上，加0. 5ml預(yù)冷的10%甘油溶液，輕微混勻；
[0027] 9)按每管100 y 1進(jìn)行分裝至I. 5ml離心管，保持冰浴狀態(tài)。分裝后以_80°C保存。
[0028] 2?轉(zhuǎn)化 pKD46
[0029] 1)在冰上預(yù)冷純化后的質(zhì)粒pKD46和0,1cm電轉(zhuǎn)化杯，同樣將感受態(tài)置入冰中融 化；
[0030] 2)把5 y 1質(zhì)粒PKD46 (質(zhì)粒濃度50-100ng/ y 1)加入細(xì)胞并用微量移液器進(jìn)行輕 柔混合（避免引入氣泡），冰浴30min;
[0031] 3)將該混合物加入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中（放入之前應(yīng)將電轉(zhuǎn)杯外壁水珠擦拭干凈）；
[0032] 4)按照Bio-Rad電轉(zhuǎn)儀的說(shuō)明進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，1800V電場(chǎng)強(qiáng)度，200 D電阻和25 y F 電容；
[0033] 5)電激結(jié)束，立即加入400 y