大腸桿菌表達(dá)的融合蛋白mbp-mart-1及其制備和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白及其制備和應(yīng)用，特別是涉及一種大腸 桿菌表達(dá)的融合蛋白MBP-MART-1及其制備和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] MART-1 (melanoma antigen recognized by T-cellsl，又名 Melan-A)是人類黑 色素細(xì)胞分化抗原，在正常黑色素細(xì)胞和幾乎所有黑色素瘤腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，在其他組織 或細(xì)胞中不表達(dá)。MART-1上有多個(gè)免疫優(yōu)勢表位，它們?cè)隗w內(nèi)外被誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性T細(xì)胞 免疫應(yīng)答，在黑色素瘤特異性免疫治療中擁有良好的應(yīng)用前景。
[0003] 重組MART-1蛋白的表達(dá)、純化在表位肽的發(fā)現(xiàn)及鑒定等發(fā)面發(fā)揮著重要作用。一 方面，重組MART-1蛋白可直接由樹突狀細(xì)胞攝取、加工后，提呈天然表位，刺激T細(xì)胞。 獲得的特異性T細(xì)胞在HLA分型相符的前提下可直接用于免疫治療，進(jìn)一步研究可鑒定得 到其所識(shí)別的表位肽序列。另一方面，重組MART-1蛋白可用于對(duì)人工合成MART-1表位肽 的鑒定。同時(shí)，利用重組蛋白免疫后得到的抗體在黑色素腫瘤研究中將起到重要作用。
[0004] 然而，目前對(duì)于利用大腸桿菌表達(dá)MART-1可溶性蛋白的制備方法還有待提高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種大腸桿菌表達(dá)的融合蛋白MBP (Maltose-binding protein)-MART-1及其制備和應(yīng)用。本發(fā)明解決了很難快速簡便獲得 大量大腸桿菌表達(dá)的MART-1可溶性蛋白的難題。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明的大腸桿菌表達(dá)的融合蛋白MBP-MART-1 (即重組蛋 白MBP-MART-1 )，是通過以下方法制備得到的：
[0007] 通過PCR方法得到人MART-1基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，將其連接到pMAL_p5x載體(質(zhì)粒） 中，得到MART-1-pMAL-p5x重組載體，并將MART-1-pMAL-p5x重組載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中， 經(jīng)25~37°C培養(yǎng)16~20小時(shí)后，經(jīng)PCR鑒定，得到含MART-1-pMAL-p5x重組載體的陽性 大腸桿菌；
[0008] 將該陽性大腸桿菌落接種于LB培養(yǎng)基中，25~37°C培養(yǎng)至0D6QQ=0. 6~0. 8,用 IPTG(異丙基-0 -D-硫代吡喃半乳糖苷)誘導(dǎo)表達(dá)3~4h后，將菌液離心棄上清，將菌體用 細(xì)菌裂解液裂解后，離心取上清，并對(duì)上清進(jìn)行直鏈淀粉樹脂純化，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測， 得到融合蛋白MBP-MART-1。
[0009] 上述大腸桿菌表達(dá)的融合蛋白MBP-MART-1的制備方法，包括步驟：
[0010] 1)通過PCR方法得到人MART-1基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，將其連接到pMAL-p5x載體中，得 到MART-1-pMAL-p5x重組載體（即含MART-1基因的pMAL-p5x載體）；
[0011] 2)將MART-1-pMAL-p5x重組載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，在25~37°C培養(yǎng)16~20 小時(shí)后，經(jīng)PCR鑒定，得到含MART-1-pMAL-p5x重組載體的陽性大腸桿菌（即轉(zhuǎn)化子）；
[0012] 3)將含MART-1-pMAL-p5x重組載體的陽性大腸桿菌的單菌落接種于LB培養(yǎng)基中， 25~37°C培養(yǎng)至0D6(I(I=0. 6~0. 8,用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)3~4h后，將菌液離心棄上清，將菌體 用細(xì)菌裂解液裂解后，離心取上清，并對(duì)上清進(jìn)行直鏈淀粉樹脂純化，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢 測，得到融合蛋白MBP-MART-1。
[0013] 所述步驟1)中，PCR方法中的上下游引物分別如SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2所 /_J、i 〇
[0014] 所述步驟2)中，大腸桿菌包括：大腸桿菌BL21(DE3);IPTG的用量為0. 1~0. 5mM; 細(xì)菌裂解液的配方為：每l〇〇〇mL溶液中含有5~10mM咪唑、500~700mM氯化鈉、20~30mM Tris 和曲拉通 X-100 10mL。
[0015] 所述步驟3)中，進(jìn)行直鏈淀粉樹脂純化的操作包括：用柱緩沖液（Column Buffer)洗直鏈淀粉樹脂柱，用含10~30mM麥芽糖的柱緩沖液洗脫蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳 檢測，得到融合蛋白MBP-MART-1;其中，柱緩沖液配方為：20~30ml 1. 0-1. 5M Tris-HCl、 11. 7g氯化鈉和2. 0ml0. 5M EDTA的混合物；融合蛋白MBP-MART-1的純度為95%以上。 [0016] 本發(fā)明還公開了大腸桿菌表達(dá)的融合蛋白MBP-MART-1的應(yīng)用，其中，所述融合蛋 白MBP-MART-1在制備MART-1抗體中的應(yīng)用。
[0017] 另外，本發(fā)明還提供一種表達(dá)融合蛋白MBP-MART-1的大腸桿菌，其中，所述大腸 桿菌含MART-1-pMAL-p5x重組載體。
[0018] 優(yōu)選地，所述大腸桿菌是含MART-1-pMAL-p5x重組載體的大腸桿菌BL21 (DE3)。
[0019] 本發(fā)明中，MBP是Maltose-binding protein的縮寫，可譯為麥芽糖結(jié)合蛋白，它 是本發(fā)明中所用到的載體pMAL-p5x上帶有的蛋白標(biāo)簽，以便于純化。
[0020] 本發(fā)明可以快速簡便的獲得大量大腸桿菌表的MART-1可溶性蛋白，解決了其它 方法獲得大腸桿菌表達(dá)的MART-1可溶性蛋白需要大量誘導(dǎo)并要透析的復(fù)雜過程。
【附圖說明】
[0021] 下面結(jié)合附圖與【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明：
[0022] 圖1是MART-1基因的PCR結(jié)果圖，其中，1為標(biāo)記（Marker)，2、3為MART-1基因；
[0023] 圖2是含重組載體的菌落鑒定PCR結(jié)果，其中，1、2為含重組載體的菌落，3為標(biāo)記 (Marker)；
[0024] 圖3是質(zhì)粒鑒定PCR結(jié)果，其中，1為標(biāo)記（Marker)，2為MART-1基因；
[0025] 圖4是表達(dá)和純化MART-1的電泳圖，其中，M為標(biāo)記（Marker)，BI為表達(dá)菌誘 導(dǎo)前蛋白條帶（即誘導(dǎo)前)，AI為表達(dá)菌誘導(dǎo)后蛋白條帶（即誘導(dǎo)后)，S為上清，F(xiàn)T為上清 上樣的流穿（即穿透Ni柱的蛋白），E1為用Column Buffer洗脫的第一管洗脫液的蛋白 條帶【即0. 18g/ml (3ml)洗脫液】，E2為用Column Buffer洗脫的第二管洗脫液的蛋白條 帶【即1. 25mg/ml (5ml)洗脫液】，E3為用Column Buffer洗脫的第三管洗脫液的蛋白條帶 【即4. 79mg/ml (4ml)洗脫液】，E4為用Column Buffer洗脫的第四管洗脫液的蛋白條帶【即 8. 09mg/ml (3ml)洗脫液】；
[0026] 圖5是MBP-MART-1重組蛋白酶切結(jié)果，M為Mark;1為Factor Xa:重組蛋白 =2:100 ;2 為 Factor Xa :重組蛋白=4:100 ;3 為 Factor Xa :重組蛋白=6:100 ;4 為 Factor Xa :重組蛋白=8:100。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人， 分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述 的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0028] 另外，實(shí)驗(yàn)中涉及的試劑如未特別說明，則是商業(yè)化產(chǎn)品。
[0029] 實(shí)施例1
[0030] 1?重組載體 MART-1-pMAL_p5x 的構(gòu)建
[0031] 1. 1按下列體系配制反應(yīng)混合液：
[0032] 模板DNA(Template DNA，購自Template DNA open biosystem公司）0?5-0.8 ug， 10XPCRbuffer5. Oil 1，上下游引物各 2. Oil l，dNTPs (2. 5mM)4. Oil l，pfu 聚合酶（5U/ii 1) 0? 5 u 1，增加 ddH20 至 50. 0 u 1，9000rpm 離心 5 秒。
[0033] 其中，dNTPs、pfu聚合酶、10XPCR buffer均購買于北京博海眾誠生物科技有限公 司；
[0034]上游引物序列為：CCGGAAGGAITTCAATGCCAAGAGAAGATG (SEQ ID NO. 1);下游引物序 列為：CCCAAGCTTTTAAGGTGAATAAGGTG (SEQ ID N0.2)。
[0035] 1. 2PCR反應(yīng)循環(huán)條件：
[0036] 94 °C 3分鐘1個(gè)循環(huán)
[0037]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種大腸桿菌表達(dá)的融合蛋白MBP-MART-I，其特征在于，所述融合蛋白MBP-MART-I 是通過以下方法制備得到的： 通過PCR方法得到人MART-I基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，將其連接到pMAL-p5x載體中，得到MART-l-pMAL-p5x重組載體，并將MART-l-pMAL-p5x重組載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，經(jīng)25~ 37°C培養(yǎng)16~20小時(shí)后，經(jīng)PCR鑒定，得到含MART-l-pMAL-p5x重組載體的陽性大腸桿 菌； 將該陽性大腸桿菌落接種于LB培養(yǎng)基中，25~37°C培養(yǎng)至0D_=0. 6~0. 8,用異丙 基-P-D-硫代吡喃半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)3~4h后，將菌液離心棄上清，將菌體用細(xì)菌裂解液 裂解后，離心取上清，并對(duì)上清進(jìn)行直鏈淀粉樹脂純化，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，得到融合蛋 白MBP-MART-I。
2. -種如權(quán)利要求1所述的大腸桿菌表達(dá)的融合蛋白MBP-MRT-I的制備方法，其特征 在于，包括步驟： 1) 通過PCR方法得到人MART-I基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，將其連接到pMAL-p5x載體中，得到 MART-l-pMAL-p5x重組載體； 2) 將MART-l-pMAL-p5x重組載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，在25~37°C培養(yǎng)16~20小時(shí) 后，經(jīng)PCR鑒定，得到含MART-l-pMAL-p5x重組載體的陽性大腸桿菌； 3) 將含MART-l-pMAL-p5x重組載體的陽性大腸桿菌的單菌落接種于LB培養(yǎng)基中，25~ 37°C培養(yǎng)至OD6tltl=O. 6~0. 8,用異丙基-P-D-硫代吡喃半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)3~4h后，將 菌液離心棄上清，將菌體用細(xì)菌裂解液裂解后，離心取上清，并對(duì)上清進(jìn)行直鏈淀粉樹脂純 化，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，得到融合蛋白MBP-MART-1。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述步驟1)中，PCR方法中的上下游引物分 別如SEQIDNO. 1 和SEQIDNO. 2 所示。
4. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述步驟2)中，大腸桿菌包括：大腸桿菌BL21 (DE3)； 異丙基-0 -D-硫代吡喃半乳糖苷的用量為0. 1~0. 5mM; 細(xì)菌裂解液的配方為：每1000 mL溶液中含有5~IOmM咪唑、500~700mM氯化鈉、20~ 30mMTris和曲拉通X-10010mL。
5. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述步驟3)中，進(jìn)行直鏈淀粉樹脂純化的 操作包括：用柱緩沖液洗直鏈淀粉樹脂柱，用含10~30mM麥芽糖的柱緩沖液洗脫蛋白，經(jīng) SDS-PAGE電泳檢測，得到融合蛋白MBP-MART-I; 其中，柱緩沖液配方為：20~30ml1.0-1. 5MTris-HClUL7g氯化鈉和2.OmlO. 5M EDTA的混合物。
6. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述步驟3)中，融合蛋白MBP-MRT-I的純 度為95%以上。
7. -種如權(quán)利要求1所述的大腸桿菌表達(dá)的融合蛋白MBP-MRT-I的應(yīng)用，其特征在 于：所述融合蛋白MBP-MART-I在制備MART-I抗體中的應(yīng)用。
8. -種表達(dá)融合蛋白MBP-MART-I的大腸桿菌，其特征在于：所述大腸桿菌含權(quán)利要求 2所述的MART-l-pMAL-p5x重組載體。
9. 如權(quán)利要求8所述的大腸桿菌，其特征在于：所述大腸桿菌是含MART-l-pMAL-p5x
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種大腸桿菌表達(dá)的融合蛋白MBP-MART-1及其制備和應(yīng)用，該蛋白是通過以下方法制備得到的：將人MART-1基因的擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMAL-p5x載體中，得重組載體，將重組載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，培養(yǎng)，鑒定，得到含重組載體的陽性大腸桿菌；將該陽性大腸桿菌落接種于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，將菌液離心棄上清，將菌體裂解后，離心取上清，對(duì)上清進(jìn)行純化，檢測，得到該蛋白。該蛋白可用于制備MART-1抗體中。本發(fā)明可快速簡便地獲得大量大腸桿菌表的MART-1可溶性蛋白，解決了其它方法獲得大腸桿菌表達(dá)的MART-1可溶性蛋白需要大量誘導(dǎo)并要透析的復(fù)雜過程。
【IPC分類】C07K16-18, C12R1-19, C07K19-00, C12N1-21, C12N15-70
【公開號(hào)】CN104761644
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410003262
【發(fā)明人】王海燕, 何志娟, 連曉寧, 夏瑞紅
【申請(qǐng)人】百奇生物科技（蘇州）有限公司, 蘇州藥明康德新藥開發(fā)股份有限公司
【公開日】2015年7月8日
【申請(qǐng)日】2014年1月3日