耐高滲透壓的重組大腸桿菌及其應用
【專利說明】耐高滲透壓的重組大腸桿菌及其應用 發(fā)明領域
[0001] 本發(fā)明涉及通過遺傳工程改造大腸桿菌的領域。具體而言，本發(fā)明提供了一種含 有突變的rpoB、cusS和/或mreC基因的重組大腸桿菌。本發(fā)明還涉及使用所述大腸桿菌 用于生產(chǎn)如丁二酸等化工原料的用途。本發(fā)明還提供了使用所述大腸桿菌生產(chǎn)丁二酸等化 工原料的方法，以及通過引入突變的rpoB、cusS和/或mreC基因而提高大腸桿菌耐滲透壓 能力的方法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 微生物細胞的生理性能是微生物工程菌發(fā)酵的核心問題之一。良好的微生物工 程菌需要具備以下生理特性：耐受高濃度的葡萄糖、耐受高濃度的產(chǎn)物、耐受高溫和耐受低 pH〇
[0004] 微生物細胞為了生存和生長，胞質(zhì)內(nèi)的滲透壓保持在280-320mosM，平均為 300mosM 左右（Higgins et al. 1987, Trends Biochem Sci 12:339-344)。當培養(yǎng)基溶液的滲 透壓高于320mosM，細胞會發(fā)生收縮產(chǎn)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象。細胞生長減慢，在低生長速率情 況下，大部分的基因會停止表達。大腸桿菌細胞同時會啟動滲透壓調(diào)節(jié)機制：吸收K+，積 累脯氨酸，合成海藻糖，甜菜堿等兩性離子化合物等；細胞外膜組分蛋白OmpC的合成增加 (Postma et al. 1996, Escherichia coli and Salmonella, 2rd: 1210-1224)。此外，在高滲透 壓條件下（23g/L NaCl，滲透壓相當于800mosM)，還有40個基因表達上調(diào)，107個基因表達 下調(diào)（Weber et al. 2002, J Bacteriol 184:5502-5507)，這些基因的表達是否和滲透壓調(diào)節(jié) 相關(guān)還有待鑒定。
[0005] 通過適應性進化可以提高菌株對高滲透壓的耐受性，提高工程菌株的產(chǎn)量和產(chǎn) 率。Liu 等（Liu et al. 2007, Biotechnol Bioeng97:825-832)在 70g/l (滲透壓相當于 2392mosM)的NaCl中連續(xù)培養(yǎng)光滑球擬酵母，篩選得到耐高滲透壓的突變株RS23。相 對于野生型，突變株RS23丙酮酸的產(chǎn)量和產(chǎn)率增長41. 1%和11. 1%。Fang等（Fang et al. 2011，World JMicrobiol Biotechnol27:3009-3013)采用相同的手段，在 42g/l (滲透 壓相當于1436mosM)的NaCl中連續(xù)培養(yǎng)琥珀酸放線桿菌，篩選得到耐高滲透壓的突變株 CH050。相對于野生型，突變株CH050 丁二酸的產(chǎn)量和產(chǎn)率增長了 37. 5%和4. 37%。但是，這 些研究對菌株耐高滲透壓的基因及相關(guān)機制并沒有進行解析。
[0006] 用無機鹽培養(yǎng)基發(fā)酵常常需要葡萄糖作為碳源，在一定范圍內(nèi)，目標產(chǎn)物的產(chǎn)量 會隨著葡萄糖濃度的增加而增加。但若葡萄糖濃度過高，由于滲透壓過大，將影響菌株的生 長和代謝。另外，用中性PH進行有機酸發(fā)酵時，發(fā)酵產(chǎn)物有機酸鹽會導致高滲透壓，對細胞 生長和代謝產(chǎn)生抑制作用。因此，微生物工程菌株對滲透壓的耐受性尤為重要。
[0007] 發(fā)明概述
[0008] 在一個方面，本發(fā)明提供了一種重組大腸桿菌，其含有選自如下的一種或多種突 變的基因：（a)突變的rpoB基因，其所編碼的多肽在對應于SEQ ID No. : 1所示氨基酸序列 的位置D654的位置上含有修飾；(b)突變的cusS基因，其所編碼的多肽在對應于SEQ ID No. : 2所示氨基酸序列的位置G210的位置上含有修飾；和（c)突變的mreC基因，其所編碼 的多肽在對應于SEQ ID No. :3所示氨基酸序列的位置G24的位置上含有修飾。
[0009] 在一個實施方案中，本發(fā)明的重組大腸桿菌中所述突變的rpoB基因所編碼的多 肽在對應于SEQ ID No. : 1所示氨基酸序列的位置D654的位置上是用Y置換D。
[0010] 在一個實施方案中，本發(fā)明的重組大腸桿菌中所述突變的cusS基因所編碼的多 肽在對應于SEQ ID No. : 2所示氨基酸序列的位置G210的位置上是用V置換G。
[0011] 在一個實施方案中，本發(fā)明的重組大腸桿菌中所述突變的mreC基因所編碼的多 肽在對應于SEQ ID No. : 3所示氨基酸序列的位置G24的位置上是用D置換G。
[0012] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種重組大腸桿菌，其含有如下的一種或多種 突變的基因：（a)突變的rpoB基因，其核苷酸序列在對應于SEQ ID No. : 4所示核苷酸序列的 位置G1960的位置上含有修飾；(b)突變的cusS基因，其核苷酸序列在對應于SEQ ID No. : 5 所不核苷酸序列的位置G629的位置上含有修飾；和（c)突變的mreC基因，其核苷酸序列在 對應于SEQ ID No. : 6所示核苷酸序列的位置G71的位置上含有修飾。
[0013] 在一個實施方案中，本發(fā)明的重組大腸桿菌中所述突變的rpoB基因的核苷酸序 列在對應于SEQ ID No. : 4所示核苷酸序列的位置G1960的位置上是用T置換G。
[0014] 在一個實施方案中，本發(fā)明的重組大腸桿菌中所述突變的CUsS基因的核苷酸序 列在對應于SEQ ID No. : 5所示核苷酸序列的位置G629的位置上是用T置換G。
[0015] 在一個實施方案中，本發(fā)明的重組大腸桿菌中所述突變的mreC基因的核苷酸序 列在對應于SEQ ID No. : 6所示核苷酸序列的位置G71的位置上是用A置換G。
[0016] 在一個實施方案中，本發(fā)明的重組大腸桿菌中還含有如下修飾：磷酸烯醇式丙酮 酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS)中所涉及的一或多個基因表達的抑制、和/或磷酸烯醇式丙 酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS)中所涉及的基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；PflB和/或 adhE基因表達的抑制、和/或pflB和/或adhE基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；IdhA基 因表達的抑制、和/或IdhA基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；galP基因和/或外源gif基 因表達的增強、和/或galP基因和/或外源gif基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強；和pck 基因表達的增強、和/或pck基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強。
[0017] 在一個實施方案中，本發(fā)明的重組大腸桿菌中的磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移 酶系統(tǒng)（PTS)中所涉及的一或多個基因的表達被抑制或者其所編碼的蛋白質(zhì)的活性被抑 制，其中所述一或多個基因是選自如下的一或多個基因：編碼PTS系統(tǒng)酶I的基因 ptsl、編 碼PTS系統(tǒng)酶Hpr的基因 ptsH、編碼PTS系統(tǒng)酶IIAele的基因 err和編碼PTS系統(tǒng)酶IICBele的基因 ptsG。
[0018] 在一個實施方案中，本發(fā)明的重組大腸桿菌中還含有如下的修飾：pta基因和 ackA基因表達的抑制、和/或pta基因和ackA基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；和aceA基 因、aceB基因和dcuC基因表達的增強、和/或aceA基因、aceB基因和dcuC基因所編碼的 蛋白質(zhì)活性的增強。
[0019] 在一個實施方案中，本發(fā)明的重組大腸桿菌中還含有如下修飾：mgsA基因表達的 抑制、和/或mgsA基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制。
[0020] 在第二個方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)丁二酸的方法，所述方法包括：(a)發(fā)酵培養(yǎng)本 發(fā)明的重組大腸桿菌；和（b)收獲產(chǎn)生的丁二酸；以及任選地分離或純化所述丁二酸。
[0021] 在一個實施方案中，本發(fā)明生產(chǎn)丁二酸的方法中，發(fā)酵培養(yǎng)本發(fā)明的重組大腸桿 菌的步驟包括使用高濃度的葡萄糖和/或高濃度丁二酸鹽。
[0022] 在第三個方面，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的重組大腸桿菌以用于生產(chǎn)丁二酸的用 途。
[0023] 在第四個方面，本發(fā)明提供了提高大腸桿菌耐滲透壓能力的方法，所述方法包括 在大腸桿菌中引入選自如下的一種或多種突變的基因：(a)突變的rpoB基因，其所編碼的 多肽在對應于SEQ ID No. : 1所示氨基酸序列的位置D654的位置上含有修飾；(b)突變的 cusS基因，其所編碼的多肽在對應于SEQ ID No. : 2所示氨基酸序列的位置G210的位置上 含有修飾；和（c)突變的mreC基因，其所編碼的多肽在對應于SEQ ID No. : 3所示氨基酸序 列的位置G24的位置上含有修飾。
[0024] 在一個實施方案中，本發(fā)明的方法中所述突變的rpoB基因所編碼的多肽在對應 于SEQ ID No. : 1所示氨基酸序列的位置D654的位置上是用Y置換D。
[0025] 在一個實施方案中，本發(fā)明的方法中所述突變的cusS基因所編碼的多肽在對應 于SEQ ID No. : 2所示氨基酸序列的位置G210的位置上是用V置換G。
[0026] 在一個實施方案中，本發(fā)明的方法中所述突變的mreC基因所編碼的多肽在對應 于SEQ ID No. : 3所示氨基酸序列的位置G24的位置上是用D置換G。
[0027] 附圖簡述
[0028] 圖I : (A)野生型rpoB基因以及突變的rpoB基因（rpoB*)所編碼的多肽的氨基酸 序列（分別為SEQ ID No. : 1 (野生型）和SEQ ID No. : 7 (突變的））比對；（B)野生型rpoB 基因（SEQIDNo. :4)以及突變的rpoB基因（rpoB*)(SEQIDNo. :10)的核苷酸序列比對。
[0029] 圖2 : (A)野生型cusS基因以及突變的cusS基因（cusS*)所編碼的多肽的氨基酸 序列（分別為SEQ ID No. :2(野生型）和SEQ ID No. :8(突變的））比對；（B)野生型cusS 基因 （SEQ ID No. : 5)以及突變的cusS基因（cusS*) (SEQ ID No. : 11)的核苷酸序列比對。
[0030] 圖3 : (A)野生型mreC基因以及突變的mreC基因（mreC*)所編碼的多肽的氨基酸 序列（分別為SEQ ID No. :3(野生型）和SEQ ID No. :9(突變的））比對；（B)野生型mreC 基因（SEQIDNo. :6)以及突變的mreC基因（mreC*)(SEQIDNo. :12)的核苷酸序列比對。
[0031] 圖4 :野生型大腸桿菌ATCC8739在含5%、20%和25%葡萄糖的無機鹽培養(yǎng)基中的 生長曲線。
[0032] 圖 5 : (A)野生型大腸桿菌 ATCC8739 和突變株 MX-202 (ATCC8739, rpoB*)、MX-204 (ATCC8739, cusS*)、MX-206(ATCC8739，mreC*)在含20%葡萄糖的無機鹽培養(yǎng)基中的生長曲 線。⑶野生型大腸桿菌ATCC8739和突變株MX-202、MX-204、MX-206在含25%葡萄糖的無 機鹽培養(yǎng)基中的生長曲線。
[0033] 圖6 :大腸菌株野生型ATCC8739在含不同濃度丁二酸二鈉培養(yǎng)基中的生長曲線。
[0034] 圖 7 : (A)野生型大腸桿菌 ATCC8739 和突變株 MX-202 (ATCC8739, rpoB*)、 MX-204 (ATCC8739, cusS*)、MX-206(ATCC8739，mreO)含 43g/L 丁二酸二鈉培養(yǎng)基中的 生長曲線。（B)野生型大腸桿菌ATCC8739和突變株MX-202 (ATCC8739, rpoB*)、MX-204 (ATCC8739, cusS*)、MX-206(ATCC8739,mreO)含 86g/L 丁二酸二鈉培養(yǎng)基中的生長曲線。
[0035] 發(fā)明詳述
[0036] 除非另有說明，所有技術(shù)和科學術(shù)語都具有本領域所知的常見含義。所有專利、專 利申請、公開出版物、序列、以及其他公開材料均援引加入本文，除非另有說明。
[0037] 在一個方面，本發(fā)明提供了一種重組大腸桿菌，其含有選自如下的一種或多種突 變的基因：（a)突變的rpoB基因，其所編碼的多肽在對應于SEQ ID No. : 1所示氨基酸序列 的位置D654的位置上含有修飾；(b)突變的cusS基因，其所編碼的多肽在對應于SEQ ID No. : 2所示氨基酸序列的位置G210的位置上含有修飾；和（c)突變的mreC基因，其所編碼 的多肽在對應于SEQ ID No. : 3所示氨基酸序列的位置G24的位置上含有修飾。
[0038] 在一個實施方案中，本發(fā)明的重組大腸桿菌中同時含有2種所述突變的基因。在 一個實施方案中，本發(fā)明的重組大腸桿菌中同時含有3種所述突變的基因。
[0039] 在一個實施方案中，本發(fā)明的重組大腸桿菌中含有如下突變的基因：(a)突變的 rpoB基因，其所編碼的多肽在對應于SEQ ID No. : 1所示氨基酸序列的位置D654的位置上 含有修飾；和（b)突