[0167] 發(fā)酵培養(yǎng)基大部分和種子培養(yǎng)基相同，區(qū)別是葡萄糖濃度為50或120g/L、另外還 加入了 100mMKHC03。
[0168] Suc-TllO. NZ-502.NZ-504 和 NZ-506 厭氧發(fā)酵，包括以下步驟：
[0169] (1)種子培養(yǎng)：250ml三角瓶中種子培養(yǎng)基為100ml，115°C滅菌15min。冷卻后將 重鉬大腸桿菌Suc-TllO、NZ-502、NZ-504和NZ-506按照1%(V/V)的接種量接種于種子培 養(yǎng)基，在37°C和IOOrpm的條件下培養(yǎng)12小時得到種子液，用于發(fā)酵培養(yǎng)基接種。
[0170] (2)發(fā)酵培養(yǎng)：500ml厭氧罐中發(fā)酵培養(yǎng)基體積為250ml，將種子液按照終濃度 OD55tl=O. 1的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，37°C，150rpm，發(fā)酵3天，得到發(fā)酵液。中和劑為2. 4M K2CO3 和 I. 2M KOH。
[0171] 發(fā)酵液為發(fā)酵罐內所有物質。培養(yǎng)過程中沒有通任何氣體。
[0172] 分析方法：使用安捷倫（Agilent-1200)高效液相色譜儀對第3天發(fā)酵液中的 組分進行測定。發(fā)酵液中的葡萄糖和有機酸濃度測定采用伯樂（Biorad)公司的Aminex HPX - 87H有機酸分析柱。發(fā)酵結果見表5。
[0173] 使用低濃度葡萄糖（5%，滲透壓為278mosM)，發(fā)酵72小時，Suc-TllO 丁二酸產量為 273禮，轉化率為1.12!11〇1/111〇1。使用高濃度葡萄糖（12%，滲透壓為667111〇8]\〇,311(3-1'110丁 二酸產量和轉化率為192mM和0. 82m〇l/m〇l，分別為低濃度葡萄糖時的70%和73%，說明高 濃度的葡萄糖對Suc-TIIO的丁二酸生產有抑制。
[0174] 使用低濃度葡萄糖（5%，滲透壓為278mosM)，發(fā)酵72小時，NZ-502 丁二酸產量為 326mM，轉化率為I. 24mol/mol。使用高濃度葡萄糖（12%，滲透壓為667mosM)，NZ-502 丁二 酸產量和轉化率為321mM和I. 18m〇l/m〇l，分別為低濃度葡萄糖時的98%和95%，說明高 濃度的葡萄糖對NZ-502的丁二酸生產基本沒有抑制，表明引入的rpoB*突變能使重組菌 Suc-TIIO耐受高濃度葡萄糖。
[0175] 使用低濃度葡萄糖（5%，滲透壓為278mosM)，發(fā)酵72小時，NZ-504 丁二酸產量為 307mM，轉化率為I. 16mol/mol。使用高濃度葡萄糖（12%，滲透壓為667mosM)，NZ-504 丁二 酸產量和轉化率為269mM和I. 14m〇l/m〇l，分別為低濃度葡萄糖時的88%和98%，說明高濃 度葡萄糖對NZ-504 丁二酸生產的抑制變弱，表明引入的cusS*突變能使重組菌Suc-TIIO 耐受高濃度葡萄糖。
[0176] 使用低濃度葡萄糖（5%，滲透壓為278mosM)，發(fā)酵72小時，NZ-506 丁二酸產量為 312mM，轉化率為I. 16mol/mol。使用高濃度葡萄糖（12%，滲透壓為667mosM)，NZ-506 丁二酸 產量和轉化率為348mM和I. 34mol/mol，分別為低濃度葡萄糖時的112%和116%，說明高濃 度的葡萄糖對NZ-502的丁二酸生產沒有抑制，表明引入的mreC*突變能使重組菌Suc-TIIO 耐受高濃度葡萄糖。表5、高濃度葡萄糖對重組大腸桿菌Suc-TllO、NZ-502、NZ-504和 NZ-506發(fā)酵生產丁二
[0177] 酸的影響
[0178]
[0179]
[0180] a使用500ml的發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)基為250ml。發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖濃度為5%，加入 了 IOOmMKHCO3。使用的中和劑為 2· 4M K2CO3 和 I. 2M Κ0Η。
[0181] b使用500ml的發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)基為250ml。發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖濃度為12%，加入 了 IOOmM KHCO3。使用的中和劑為 2· 4M K2CO3 和 L 2M Κ0Η。
[0182] 實施例6 :含不同濃度丁二酸二鈉的培養(yǎng)某對重纟目大腸桿菌Suc-TllO、NZ-502、 NZ-504和NZ-506發(fā)酵牛產丁二酸的影響
[0183] 使用含不同濃度的丁二酸二鈉的無機鹽培養(yǎng)基對重組大腸桿菌Suc-TllO進行發(fā) 酵。
[0184] 種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基組成同實施例5,發(fā)酵培養(yǎng)基含葡萄糖濃度50g/L，IOOmM KHCO3，另外還加入了 0g/L、29g/L或43g/L的丁二酸二鈉。
[0185] 種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)和分析方法同實施例5,中和劑為2. 4M K2CO3和I. 2M Κ0Η。
[0186] 結果如表6所示：
[0187] 在5%的葡萄糖(滲透壓為278mosM)和Og/L 丁二酸二鈉(滲透壓為OmosM)的培養(yǎng) 基中，發(fā)酵96h，Suc-Tl 10 丁二酸產量為280mM ;在5%的葡萄糖(滲透壓為278mosM)和29g/ L 丁二酸二鈉(滲透壓為537mosM)的培養(yǎng)基中，發(fā)酵96h，Suc-T110 丁二酸產量為181mM，為 〇g/L 丁二酸二鈉時的65% ;在5%的葡萄糖(滲透壓為278mosM)和43g/L 丁二酸二鈉(滲透 壓為796mosM)的培養(yǎng)基中，發(fā)酵96h，Suc-T110 丁二酸產量為13mM，為Og/L 丁二酸二鈉時 的5%。隨著丁二酸二鈉濃度的增加，重組大腸桿菌Suc-TllO 丁二酸產量顯著下降，說明高 濃度的丁二酸二鈉對Suc-TllO的生長和丁二酸生產有很大的抑制。
[0188] 在5%的葡萄糖（滲透壓為278mosM)和29g/L 丁二酸二鈉（滲透壓為537mosM)的 培養(yǎng)基中，發(fā)酵96h，NZ-502、NZ-504和NZ-506 丁二酸產量分別為227、245和271mM，為相 同發(fā)酵條件下Suc-TllO的125%、135%和150%。
[0189] 在5%的葡萄糖（滲透壓為278mosM)和43g/L 丁二酸二鈉（滲透壓為796mosM)的 培養(yǎng)基中，發(fā)酵96h，NZ-502、NZ-504和NZ-506 丁二酸產量分別為79、77和99mM，為相同發(fā) 酵條件下Suc-TllO的608%、592%和762%。表明引入的rpoB*、cusS*和mreO突變均能提 高使重組菌Suc-TllO耐受高濃度丁二酸二鈉的能力。
[0190] 表6、含不同濃度丁二酸二鈉的培養(yǎng)基對重組大腸桿菌Suc-TllO、NZ-502、NZ-504 和 NZ-506
[0191] 發(fā)酵生產丁二酸的影響
[0192]
[0193] a使用500ml的發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)基為250ml。發(fā)酵培養(yǎng)基中除加入了 IOOmMKHCO3, 還加入了 Og/L的丁二酸二鈉。使用的中和劑為2. 4MK2C0JP I. 2MK0H。
[0194] b使用500ml的發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)基為250ml。發(fā)酵培養(yǎng)基中除加入了 IOOmMKHCO3, 還加入了 29g/L的丁二酸二鈉。使用的中和劑為2. 4MK2C0JP I. 2MK0H。
[0195] M吏用500ml的發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)基為250ml。發(fā)酵培養(yǎng)基中除加入了 IOOmMKHCO3, 還加入了 43g/L的丁二酸二鈉。使用的中和劑為2. 4MK2C0JP I. 2MK0H。
[0196] 實施例7 :重纟目大腸桿菌MX-202的構律
[0197] 從野生大腸桿菌ATCC8739出發(fā)，按實施例2中的方法將rpoB*突變基因整合。獲 得重組大腸桿菌MX-202。使用的引物序列見表3,其中引物的命名相同于rpoB*突變基因 還原過程中所使用的引物的名稱。
[0198] 實施例8 :重纟目大腸桿菌MX-204的構律
[0199] 從野生大腸桿菌ATCC8739出發(fā)，按實施例3的方法將cusS*突變基因整合，獲得 重組大腸桿菌NZ-504。使用的引物序列見表3，其中引物的命名對應于rpoB*突變基因過 程中所使用的引物的名稱，僅將rpoB替換為cusS。
[0200] 實施例9 :重纟目大腸桿菌MX-206的構律
[0201] 從野生大腸桿菌ATCC8739出發(fā)，按實施例4方法將mreC*突變基因整合，獲得重 組大腸桿菌MX-206。使用的引物序列見表3,其中引物的命名對應于rpoB*突變基因過程 中所使用的引物的名稱，僅將rpoB替換為mreC。
[0202] 實施例10 :高濃度葡萄糖對野牛型大腸桿菌ATCC8739牛長的影響
[0203] 使用不同濃度的葡萄糖培養(yǎng)基對大腸桿菌ATCC8739進行發(fā)酵。
[0204] 種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基組成同實施例5,發(fā)酵培養(yǎng)基含葡萄糖濃度為50g/L、 200g/L、250g/L，不添加 KHCO3。
[0205] 種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)同實施例5,中和劑為6M Κ0Η。
[0206] 每6h測定OD55tol值，繪制生長曲線。生長曲線見圖4。
[0207] 使用低濃度葡萄糖（5%，滲透壓為278mosM)，ATCC8739于12h達到生長最大值， OD55tol約6左右；使用高濃度葡萄糖（20%，滲透壓為1112mosM)，生長30h達到最大值，OD 55tol約6左右；使用更高濃度葡萄糖（25%，滲透壓為1390mosM)時，最終48h達到最大值，OD55tol為 3. 78。
[0208] 在相同時間點12h，使用高濃度葡萄糖（20%，滲透壓為1112m〇sM)培養(yǎng)基， ATCC8739生長的OD55tlmi值是低濃度葡萄糖（5%，滲透壓為278mosM)的7% ;使用更高濃度葡 萄糖（25%，滲透壓為1390mosM)時，OD55tol值是葡萄糖濃度為5%時的1. 6%。
[0209] 隨著培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的增加，野生型大腸桿菌ATCC8739的生長受影響，延遲 期增長，說明高濃度的葡萄糖對ATCC8739生長抑制。
[0210] 實施例11 :高濃度葡萄糖對重纟目大腸桿菌MX-202、MX-204和MX-206牛長的影響
[0211] 使用不同濃度的葡萄糖培養(yǎng)基對重組大腸桿菌MX-202、MX-204和MX-206進行發(fā) 酵。
[0212] 種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基組成同實施例5,發(fā)酵培養(yǎng)基含葡萄糖濃度為200g/L、 250g/L，不添加 KHCO3。
[0213] 種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)同實施例5,中和劑為6M Κ0Η。
[0214] 每6h測定OD55tol值，繪制生長曲線。生長曲線見圖5。
[0215] 使用高濃度的葡萄糖（20%，滲透壓為1112mosM)培養(yǎng)基，18h時，MX-202、MX-204 和MX-206的OD55tlnm值為5. 63、4. 83、4. 32,相對于野生型在相同時間點（圖4, OD55tol值為 2.85)，0055(|"分別提高了118%、87%和67%;在發(fā)酵終點的3011，]\?-202、]\?-204和]\?-206 的 〇〇55。"值為6.89、6.84、6.45，相對于野生型在相同時間點（圖4,0055(|11111值為5.89)，0055〇11111 提高了 17%、17%、10% (圖 5A)。
[0216] 使用更高濃度的葡萄糖（25%，滲透壓為1390mosM)培養(yǎng)基，36h時，MX-202、MX-204 和MX-206的OD55tol值為2. 26、2.45、1.7,相對于野生型在相同時間點（圖4, OD55tol值為 L 56)，OD55tlmi 提高了 45%、57% 和 9% ;在發(fā)酵終點的 48h，MX-202、MX-204 和 MX-206 的 OD55tlnm值為4. 47、4. 51、4. 3，相對于野生型在相同時間點（圖4，OD55tlmi值為3. 79 )，0D550nm提高了 18%、19%、13% (圖 5B)。
[0217] 隨著葡萄糖濃度的提高，重組大腸桿菌MX-202、MX_204和MX-206菌株生長能力降 低，延遲期增長；但在相同條件下，相對于野生型ATCC8739,生長有顯著提高；說明rpoB*、 cuSS*、mreC*單基因突變能顯著提高野生型菌株對高濃度葡萄糖的耐受性。
[0218] 實施例12 :高濃度丁二酸二鈉對大腸桿菌ATCC8739發(fā)酵的影響
[0219] 使用不同濃度的丁二酸二鈉培養(yǎng)基對大腸桿菌ATCC8739進行發(fā)酵。
[0220] 種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基組成同實施例5,發(fā)酵培養(yǎng)基含葡萄糖濃度50g/L，不添 加 KHCO3,另外還加入了 0g/L、29g/L、43g/L、57g/L、71g/L、86g/L 的丁二酸二鈉。
[0221] 種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)同實施例5,中和劑為6M Κ0Η。
[0222] 每6h測定OD55tol值，繪制