、其重組表達(dá)載體及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體設(shè)及一種受滲透壓調(diào)控的啟動(dòng)子Pm。。。。;、其重組表 達(dá)載體及應(yīng)用，該啟動(dòng)子能夠在大腸桿菌基因工程菌株中在低滲透壓環(huán)境中驅(qū)動(dòng)外源基因 的高效表達(dá)。
【背景技術(shù)】
[0002] 啟動(dòng)子是一段位于基因5'端上游的DNA序列，基因的一個(gè)重要組成部分，通過與 RNA聚合酶或其他轉(zhuǎn)錄因子等反式作用元件特異結(jié)合，控制著基因表達(dá)。啟動(dòng)子一般分為組 織特異啟動(dòng)子、組成型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子3類。組織特異啟動(dòng)子又稱為器官特異性啟 動(dòng)子，在運(yùn)類啟動(dòng)子調(diào)控下基因只在某些特定的器官或組織中表達(dá)，通常表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié) 的特性。組成型啟動(dòng)子則與組織特異啟動(dòng)子不同，調(diào)控表達(dá)目的基因在不同組織、部位中表 達(dá)水平?jīng)]有明顯差異，不具有時(shí)間和空間特異性。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在某些特定的物理或化學(xué) 信號(hào)的刺激下，可W大幅度地提高基因的轉(zhuǎn)錄水平和表達(dá)量，因此運(yùn)類啟動(dòng)子具有與誘導(dǎo) 因子特異結(jié)合的順式作用元件。
[0003] 大腸桿菌作為現(xiàn)代基因工程最為常用的原核表達(dá)系統(tǒng)，其核屯、為基因啟動(dòng)元件的 高效性、可控性W及誘導(dǎo)表達(dá)后對(duì)下游工藝不產(chǎn)生影響。誘導(dǎo)性啟動(dòng)子在大腸桿菌表達(dá)系 統(tǒng)中具有廣闊的應(yīng)用前景，尤其是人工構(gòu)建的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如：在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中最 為常見的T7啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子和地AD啟動(dòng)子等。但是運(yùn)類啟動(dòng)子需要加入IPTG等化學(xué) 藥物進(jìn)行誘導(dǎo)，在此過程中運(yùn)些化學(xué)藥物存在一定毒性，尤其在制備醫(yī)學(xué)使用的重組蛋白 并不合適；此外，在進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵時(shí)大量加入IPTG成本高昂，而且會(huì)對(duì)后期的純化W及 生物藥物的應(yīng)用帶來(lái)諸多麻煩。因此為了獲得不依賴IPTG等化學(xué)因子誘導(dǎo)的新型啟動(dòng)子， 開始發(fā)掘和分離天然誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，如溫度誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、抑誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和光誘導(dǎo)型啟 動(dòng)子等。不過通過光和溫度誘導(dǎo)控制會(huì)耗費(fèi)大量的能源，而且由于升溫時(shí)間漫長(zhǎng)，找出誘導(dǎo) 效果不顯著。抑誘導(dǎo)控制雖然節(jié)省，但是對(duì)于某些蛋白尤其是分泌性蛋白來(lái)說(shuō)，在酸性或堿 性條件下失去活性或功能。尋找一種不依賴于IPTG等化學(xué)因子W及溫度等誘導(dǎo)的新型啟 動(dòng)子將具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明從大腸桿菌SSuT-25中發(fā)現(xiàn)、鑒定一個(gè)受滲透壓調(diào)控的啟動(dòng)子，并將該啟 動(dòng)子進(jìn)行應(yīng)用。首先，通過巧光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)大腸桿菌SSuT-25編碼的微型細(xì)菌素 mccPDI基因簇在低滲透壓培養(yǎng)基M9中表達(dá)量明顯高于高滲透壓培養(yǎng)基LB中的表達(dá)量，說(shuō) 明可能受到滲透壓調(diào)控；其次在mccPDI基因簇上游分離到200bp序列，序列分析其具有滲 透壓調(diào)控元件，被命名為PmeePDI;將其插入到報(bào)告基因綠色巧光蛋白GFP上游，構(gòu)建表達(dá)載 體，并轉(zhuǎn)入基因工程菌株大腸桿菌TOPlO中，巧光顯微鏡觀察顯示綠色巧光蛋白GFP在M9 培養(yǎng)的細(xì)菌中高水平表達(dá)，而在LB培養(yǎng)的細(xì)菌中未觀察到表達(dá)，說(shuō)明PmttPDI是低滲透壓誘 導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子。將該啟動(dòng)子應(yīng)用于外源基因的規(guī)?；磉_(dá)，不僅可W節(jié)省成本，而且在表 達(dá)分泌性的蛋白時(shí)，含該啟動(dòng)子的表達(dá)系統(tǒng)有利于目的蛋白的純化和應(yīng)用，在實(shí)際生產(chǎn)中 具有重要價(jià)值。
[0005] 本發(fā)明的目的在于公開了
[0006] 本發(fā)明的目的是通過W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] -種受滲透壓調(diào)控的啟動(dòng)子Pm。。。。;，其中，所述啟動(dòng)子Pm。。?;來(lái)源于大腸桿菌 SSuT-25菌株，其DNA序列如沈QIDNO. 1所示。
[0008] 上述技術(shù)方案所述的一種受滲透壓調(diào)控的啟動(dòng)子P"_PDi，其中，所述啟動(dòng)子Pm。。?; 在體外能與滲透壓調(diào)節(jié)蛋白OmpR相結(jié)合，擁有至少3個(gè)潛在的OmpR結(jié)合位點(diǎn)。
[0009] 一種重組表達(dá)載體，其中，所述重組表達(dá)載體包含上述技術(shù)方案所述的受滲透壓 調(diào)控的啟動(dòng)子Pm。。。。;;在重組表達(dá)載體中，啟動(dòng)子Pm。。?;連接于外源基因序列的上游。
[0010] 上述技術(shù)方案所述的重組表達(dá)載體，其中，所述的外源基因?yàn)榫G色巧光蛋白（GFP) 基因。
[0011] 上述技術(shù)方案所述的重組表達(dá)載體，其中，所述重組表達(dá)載體為 PCR2.l-PmeePDI-GFP。
[0012] 上述技術(shù)方案所述的受滲透壓調(diào)控的啟動(dòng)子Pm。。。。;在驅(qū)動(dòng)外源基因表達(dá)中的應(yīng) 用。
[0013] 上述技術(shù)方案所述的應(yīng)用，其中，所述外源基因?yàn)榫G色巧光蛋白基因或其他待表 達(dá)外源基因。
[0014] 上述技術(shù)方案所述的應(yīng)用，其中，將包含上述技術(shù)方案所述的受滲透壓調(diào)控的啟 動(dòng)子PmeePDI的重組表達(dá)載體PCR2.I-PmeePDI-GFP轉(zhuǎn)化到大腸桿菌基因工程TOPlO菌株中，在 M9培養(yǎng)基中誘導(dǎo)GFP基因的表達(dá)，表明低滲透壓誘導(dǎo)條件下啟動(dòng)子PmttPDI能驅(qū)動(dòng)目標(biāo)基因 在大腸桿菌體系中的高效表達(dá)。
[0015] 本發(fā)明的目的在于提供了一種受滲透壓調(diào)控的啟動(dòng)子及其應(yīng)用，在低滲透壓環(huán)境 中該啟動(dòng)子能驅(qū)動(dòng)下游外源基因的高效表達(dá)。
[0016] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種受滲透壓調(diào)控的啟動(dòng)子PmeePDI，該啟動(dòng)子 具有序列表SEQIDNO: 1所示的堿基序列，來(lái)源于大腸桿菌SSuT-25編碼的微型細(xì)菌素 mccPDI的啟動(dòng)子。
[0017] 本發(fā)明還提供了一種重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含上述的受滲透壓調(diào)控 的啟動(dòng)子Pm。。?;，待表達(dá)的綠色巧光蛋白（GF巧基因連接于啟動(dòng)子的下游，所述重組表達(dá)載 體命名為pCR2. 1-P"_pdi-GFP。其他待表達(dá)外源基因連接到啟動(dòng)子P"_PDI下游構(gòu)建的表達(dá)載 體也在本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[001引本發(fā)明還提供了所述啟動(dòng)子PmeePDI在驅(qū)動(dòng)綠色巧光蛋白（GFP)基因表達(dá)中的應(yīng) 用。將上述所提供的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOPlO中，在低滲透壓培養(yǎng)基中培養(yǎng)誘 導(dǎo)GFP基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)外源基因在啟動(dòng)子PmttPDI驅(qū)動(dòng)下在大腸桿菌體系中表達(dá)應(yīng)用。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的內(nèi)容，其他待表達(dá)外源基因連接到啟動(dòng)子Pm。。。。;下游構(gòu)建的 表達(dá)載體也在本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0020] 本發(fā)明具有W下有益效果：
[0021] 1、發(fā)現(xiàn)一種天然的受滲透壓調(diào)控的啟動(dòng)子，可W不依賴于IPTG等化學(xué)試劑誘導(dǎo) 實(shí)現(xiàn)外源基因在大腸桿菌表達(dá)體系中高效表達(dá)，成本低，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物不產(chǎn)影響。
[0022] 2、因?yàn)樵搯?dòng)子是在M9低滲透壓培養(yǎng)基啟動(dòng)下游基因表達(dá)，M9培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單、 已知；利用該啟動(dòng)子構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)在M9中進(jìn)行規(guī)?；磉_(dá)后，有利于表達(dá)產(chǎn)物的后續(xù)純 化和活性分析，尤其是對(duì)分泌性表達(dá)蛋白。
【附圖說(shuō)明】
[0023] 1、圖1為實(shí)施例1中巧光定量PCR分析mcpM基因在M9和LB兩種培養(yǎng)基中的表 達(dá)情況。
[0024]2、圖2為實(shí)施例2中鑒定啟動(dòng)子PmeePD沒滲透壓調(diào)控的結(jié)果圖，其中（A)圖為凝 膠阻滯實(shí)驗(yàn)，OmpR通過原核表達(dá)純化獲得的蛋白，XRE為其他蛋白作為陰性對(duì)照，其表達(dá)和 純化條件與OmpR相同；其中度）是啟動(dòng)子P"_pDi序列中含有的S個(gè)可能的OmpR結(jié)合位點(diǎn) 度1，B2,B3)，W及與OmpF啟動(dòng)子序列中（F1，F(xiàn)2,F3)、OmpC啟動(dòng)子（Cl)OmpR結(jié)合位點(diǎn)的多 重比對(duì)圖。
[002引 3、圖3為實(shí)施例4中啟動(dòng)子P"_pDi驅(qū)動(dòng)綠色巧光蛋白基因在大腸桿菌體系中表達(dá) 圖，其中（A)和度）是攜帶pCR2.I-PmeePDI-GFP重組質(zhì)粒的大腸桿菌TOPlO在M9培養(yǎng)基中生 長(zhǎng)8小時(shí)后的巧光顯微觀察圖，（C)和值）是同一菌株在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)8小時(shí)后的巧光 顯微觀察圖；其中（A)和（C)中的巧光表示DAPI染色的細(xì)菌核酸，（C)中巧光為表達(dá)的綠 色欠光蛋白。
【具體實(shí)施方式】：
[0026] 為使本發(fā)明的技術(shù)方案便于理解，W下結(jié)合具體試驗(yàn)例對(duì)本發(fā)明一種受滲透壓調(diào) 控的啟動(dòng)子Pm。。。。;、其重組表達(dá)載體及應(yīng)用作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0027] 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法或者按照試劑盒說(shuō)明書 進(jìn)行；下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到；所用引物 合成和測(cè)序工作均由上海生物工程有限公司完成。
[002引連施例1:受滲歲壓調(diào)控的啟動(dòng)子PmeePDI發(fā)現(xiàn)：
[0029]mccPDI是大腸桿菌SSUT25菌株編碼的一種微型微型細(xì)菌素，其編碼基因?yàn)閙cpM。 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)mcpM基因的表達(dá)與所使用培養(yǎng)基（M9vsLB)有關(guān)，預(yù)示著mcpM基因的啟動(dòng)子 (PmccPDI)可能受到滲透壓的調(diào)控。具體的發(fā)現(xiàn)過程如下：
[0030](1)、大腸桿菌SSUT25在兩種不同培養(yǎng)基中的培養(yǎng)：大腸桿菌SSuT25(E25)來(lái)源于 美國(guó)華盛頓州立大學(xué)Douglas化11實(shí)驗(yàn)室。將在LB中過夜培養(yǎng)的E25分別W1:100接種 至新鮮的LB和M9兩種不同滲透壓的培養(yǎng)基，置于37°C搖床20化pm震蕩培養(yǎng)。
[0031]LB培養(yǎng)基配方：10g/L膜蛋白腺，5g/L酵母抽提物，lOg/L氯化鋼，其中膜蛋白腺和 酵母抽提物購(gòu)買抓公司；M9培養(yǎng)基配方：憐酸氨二鋼6g/l，憐酸二氨鐘3g/l，氯化鋼0. 5g/ 1，氯化錠1邑/1，維生素812111邑/1，硫酸儀11111，氯化巧0.11111和0.2%葡萄糖。
[003引似、細(xì)菌RNA提?。涸谂囵B(yǎng)4小時(shí)和8小時(shí)分別收樣，取1~1. 5ml細(xì)菌培養(yǎng)物， 通過1000化pm離屯、收集菌體，并重懸于350JilRNAwiz (Ambion公司產(chǎn)品）；在LB中培 養(yǎng)24小時(shí)的培養(yǎng)物作為對(duì)照；每組樣品隨后RNA提取使用Ambion公司的細(xì)菌RNA提取試 劑盒度acteria Ribopure kit)進(jìn)行完成，操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。RNA定量使用 Nano化op?2000分光光度計(jì)完成。
[0033](3)、cDNA合成：cDNA合成使用BioRad公司的iScriptSupmix完成，20yI反應(yīng) 體系中使用5(K)ngRNA，操作步驟按照說(shuō)明書進(jìn)行。產(chǎn)生的CDNA稀釋10倍后用于巧光定量 PCR。
[0034](4)、巧光定量PCR:PCR反應(yīng)使用BioRad公司的2倍濃縮SsoAdvanceSYBR Mastermix, 2