去除血清白蛋白及其融合蛋白中雜質(zhì)的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及去除血清白蛋白或其融合蛋白中雜質(zhì)的方法，該方法的特征在于將血清白蛋白或其融合蛋白吸附或結(jié)合于填料填料上，使用包含適量蛋白變性劑的去雜質(zhì)洗液洗去血清白蛋白或其融合蛋白中包裹的雜質(zhì)，然后使用不含變性劑的蛋白復(fù)性液重新使得血清白蛋白或其融合蛋白復(fù)性，最后使用合適的蛋白洗脫液將血清白蛋白或其融合蛋白從填料上洗脫下來(lái)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
去除血清白蛋白及其融合蛋白中雜質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種血清白蛋白或其融合蛋白中雜質(zhì)的去除方法。
【背景技術(shù)】
[0002]血清白蛋白是脊椎動(dòng)物血楽中含量最豐富的蛋白質(zhì)。人血清白蛋白(Humanserumalbumin，HSA)是由585個(gè)氨基酸組成的單鏈無(wú)糖基化的蛋白質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量約為66.5kD，占血漿總蛋白的60%左右。人血清白蛋白是血液系統(tǒng)的重要組分，具有結(jié)合、運(yùn)輸內(nèi)源性與外源性物質(zhì)，維持血漿PH和血液膠體滲透壓，清除自由基及影響動(dòng)脈血管的滲透性等多種生理功會(huì)HiPeters, T.(1995).All About Albumin: B1chemistry ,Genetics and MedicalApplicat1ns ,Academic Press, San Diego]人血清白蛋白在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中是一種重要的臨床生物制品，主要作為血漿容量擴(kuò)充劑，可用于治療出血性休克、腦缺血、燒傷、紅細(xì)胞過(guò)多癥、白蛋白過(guò)少癥等多種疾病。
[0003]作為一種脂肪酸等物質(zhì)的輸運(yùn)蛋白，白蛋白、尤其是從畢赤酵母中獲得的重組白蛋白、常常包裹有一些色素，導(dǎo)致白蛋白呈現(xiàn)為黃色、甚至是深黃色，而不是普通蛋白的無(wú)色、或淡黃色(高濃度時(shí))。人血清白蛋白臨床使用量大，每針劑量通常達(dá)10g，而大多數(shù)蛋白質(zhì)藥物如細(xì)胞因子、激素的劑量?jī)H為yg或ng級(jí)，因此相對(duì)其它蛋白質(zhì)藥物來(lái)說(shuō)，人血清白蛋白的純度要求更為嚴(yán)格。產(chǎn)品中即使有害雜質(zhì)為0.001 %，每針劑仍會(huì)有0.1mg的雜質(zhì)被注入體內(nèi)，對(duì)病人可造成極大的危害。無(wú)論是從血漿中提取的人血清白蛋白(pHSA)，還是利用基因工程制備的重組人血清白蛋白(rHSA)，HSA的去除雜質(zhì)的技術(shù)都是影響其產(chǎn)業(yè)化的一種關(guān)鍵技術(shù)。只有降低其去雜質(zhì)技術(shù)成本，才能使HSA更廣泛的應(yīng)用于醫(yī)療，更好的服務(wù)于病人。因此，國(guó)內(nèi)外已有許多科研機(jī)構(gòu)致力于此方面的研究，但效果不甚理想。
[0004]通過(guò)世界各國(guó)科研者對(duì)重組白蛋白的努力研究，已經(jīng)摸索出一些重組白蛋白的純化方法。重組白蛋白的常見(jiàn)純化步驟:對(duì)分離出來(lái)的rHSA進(jìn)行陽(yáng)離子交換層析、疏水層析、陰離子交換層析、鹽析等初步的純化步驟，然后經(jīng)過(guò)螯合樹(shù)脂、硼酸或硼酸鹽處理或二次疏水層析等進(jìn)一步的純化過(guò)程，得到穩(wěn)定的、較高純度的rHSA。日本的Green Cross公司第一步運(yùn)用STREAMLINE純化方法，將68°C條件下加熱滅活蛋白酶的發(fā)酵液通過(guò)陽(yáng)離子擴(kuò)張床進(jìn)行純化，目的rHSA吸附，酵母菌體及其它雜質(zhì)流穿，再經(jīng)過(guò)疏水及陰離子交換層析得到rHSA，從而縮短了純化周期。英國(guó)的Delta公司申請(qǐng)的PCT專(zhuān)利W000/44772采用的純化步驟是SP FF陽(yáng)離子層析(洗脫含rHSA的結(jié)合組分)、DEAE_FF陰離子層析(洗脫含rHSA的結(jié)合組分)、DBA親和層析(洗脫含rHSA的結(jié)合組分)、PBA親和層析(收集流穿)、SP-FF陽(yáng)離子層析(收集流穿)、DEAE-FF陰離子層析(收集流穿)，最后得到單體純度大于99.9%的rHSA。目前雖然日本和美國(guó)對(duì)重組人血清白蛋白的純化工藝處于世界領(lǐng)先地位，但是其生產(chǎn)工藝成本較高，步驟繁瑣，嚴(yán)重制約著重組人血清白蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)。
[0005]另外重組血清白蛋白融合蛋白也具有很好的藥用價(jià)值。如干擾素-a(IFN-a)有著很好的抗病毒活性，對(duì)乙型肝炎和丙型肝炎有很好的療效。但由于其體內(nèi)半衰期非常短，不僅影響其療效而且給患者帶來(lái)不便。研究人員將干擾素a_2b基因與HSA基因融合，利用畢赤酵母作為宿主細(xì)胞表達(dá)融合蛋白，則會(huì)使其半衰期大大延長(zhǎng)，而且干擾素a_2b的體內(nèi)活性也會(huì)增強(qiáng)。
[0006]無(wú)論是血清白蛋白還是重組血清白蛋白融合蛋白的生產(chǎn)，都面臨著清除雜質(zhì)的難題。白蛋白中的雜質(zhì)有兩種，一種與白蛋白沒(méi)有直接相互作用的其他蛋白或小分子，這些蛋白可以使用常規(guī)的沉淀、色譜分離等方法去除。另一種是包裹在白蛋白內(nèi)部、或與白蛋白有很強(qiáng)相互作用的小分子，如色素等，這是由于白蛋白作為一種輸運(yùn)蛋白的特性導(dǎo)致的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種去除血清白蛋白或其融合蛋白中雜質(zhì)的方法。使用本發(fā)明方法，可以有效去除血清白蛋白或其融合蛋白中包裹的內(nèi)源性雜質(zhì)，如色素等。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案為:一種去除血清白蛋白或其融合蛋白中雜質(zhì)的方法，其特征在于包括以下步驟:
[0009](I)使用去雜質(zhì)洗液對(duì)結(jié)合或吸附在填料上的血清白蛋白或其融合蛋白進(jìn)行去雜質(zhì)操作；
[0010](2)然后使用蛋白復(fù)性液對(duì)可逆變性的血清白蛋白或其融合蛋白進(jìn)行復(fù)性；
[0011](3)然后用蛋白洗脫液將血清白蛋白或其融合蛋白從填料上洗脫下來(lái)。
[0012]其中所述去雜質(zhì)洗液是可以使血清白蛋白或其融合蛋白可逆地變性的溶液，所述蛋白復(fù)性液是不含有蛋白變性劑的溶液，所述蛋白洗脫液是能夠?qū)⒌鞍讖奶盍仙舷疵撓聛?lái)的溶液。
[0013]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述去雜質(zhì)洗液包含蛋白變性劑、無(wú)機(jī)溶劑和有機(jī)溶劑。蛋白變性劑包括但不限于選自尿素、鹽酸胍、低PH變性鹽，丙酮或適宜濃度的堿液中的一種或幾種。術(shù)語(yǔ)“低PH變性鹽”的含義可由其字面意思來(lái)理解，S卩pH值較低的可以使蛋白質(zhì)變性的鹽。有機(jī)溶劑包括但不限于選自酒精、甘油、異丙醇或肉豆蔻酸的一種或幾種。無(wú)機(jī)溶劑包括但不限于水和/或液氨。
[0014]本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定蛋白質(zhì)變性劑和有機(jī)溶劑的適宜濃度。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，蛋白變性劑尿素的濃度在4-8M的范圍內(nèi)，更優(yōu)選為約6M。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，有機(jī)溶劑如酒精的濃度為3% —60%，更優(yōu)選為10%-33%在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述去雜質(zhì)洗液包含適宜濃度的尿素和酒精。更優(yōu)選地，所述去雜質(zhì)洗液包含30-33%的酒精，6M尿素。其中酒精濃度的百分比為體積/體積比。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的去雜質(zhì)洗液含有6M尿素、30 %酒精、20mM Tris-HCl (pH 7.4)。在另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的去雜質(zhì)洗液含有33%酒精、6M尿素、20mM Tris-HCl(pH 7.4)。
[0015]本發(fā)明中，蛋白質(zhì)復(fù)性液可以是本領(lǐng)域中常用于使蛋白質(zhì)復(fù)性的溶液，其成分可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。蛋白質(zhì)復(fù)性液可以是緩沖液，也可以不是緩沖液。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)復(fù)性液可以是所述填料(也可以是裝填有該填料的層析柱或色譜柱)的平衡緩沖液。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)復(fù)性液含有20mMTris-HCl(pH 7.4)、500mM NaCl。
[0016]本發(fā)明中，蛋白質(zhì)洗脫液可以是本領(lǐng)域中常用于從填料(也可以是裝填有該填料的層析柱或色譜柱)上洗脫蛋白質(zhì)的洗脫液。在一些實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)洗脫液含有咪唑。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)洗脫液含有濃度150-750mM的咪唑，更優(yōu)選含有濃度為約500mM的咪唑。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)洗脫液含有20mMTris-HCl pH 7.4、500mM NaCl、500mM咪唑。
[0017]本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“填料”指所有能夠結(jié)合或吸附血清白蛋白或其融合蛋白的物質(zhì)。填料包括但不限于:親和層析填料如N1-NTA填料、抗白蛋白抗體填料;離子交換色譜填料、共價(jià)色譜填料。在一些實(shí)施方案中，所述填料被裝填于層析柱或色譜柱中，待去除雜質(zhì)的血清白蛋白或其融合蛋白結(jié)合或吸附于該層析柱或色譜柱中。術(shù)語(yǔ)“親和層析”指層析填料是用具有特殊結(jié)構(gòu)的親和分子制成的固相吸附劑，當(dāng)要被分離的物質(zhì)通過(guò)層析填料時(shí)，與吸附劑具有親和力的物質(zhì)就會(huì)被吸附而滯留在層析填料中，沒(méi)有親和力的物質(zhì)直接流出，從而與被分離的物質(zhì)分開(kāi)，然后用適當(dāng)?shù)南疵撘焊淖兘Y(jié)合條件將結(jié)合的物質(zhì)洗脫下來(lái)。術(shù)語(yǔ)“離子交換色譜”也可稱(chēng)為“離子交換層析”，指以離子交換劑為固定相，根據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行的層析分離方法。術(shù)語(yǔ)“共價(jià)色譜”也可稱(chēng)為“共價(jià)層析”，指作為層析填料的固相載體與流經(jīng)它的待分離物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)并以共價(jià)鍵相連，洗去不與該固相載體反應(yīng)的其它物質(zhì)之后，再以另一化學(xué)反應(yīng)使目的物從載體上釋放洗脫下來(lái)。
[0018]本發(fā)明中所述“血清白蛋白”包括但不限于人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)等。
[0019]本發(fā)明所述的“融合蛋白”指包含血清白蛋白與其它蛋白的氨基酸序列的嵌合蛋白。制備融合蛋白的方法是本領(lǐng)域公知的，通常融合蛋白由本領(lǐng)域熟知的體外重組技術(shù)產(chǎn)生。
[0020]本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)“包括”、“包含”、“含有”包括以下含義:包含所列舉的成分、基本由所列舉的成分組成或者由所列舉的成分組成。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):(I)去雜質(zhì)洗液、復(fù)性液及其洗脫液成分成本低廉，且溶液配制方法簡(jiǎn)單；(2)無(wú)環(huán)境污染；(3)周期短，適用于工業(yè)化生產(chǎn)；(4)步驟簡(jiǎn)單，效果明顯;能夠應(yīng)用于血清白蛋白及其融合蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1是對(duì)重組人血清白蛋白(左)及融合蛋白ATF-HSA(右)的雜質(zhì)(如色素)的洗脫過(guò)程。
[0023]圖2是經(jīng)去雜質(zhì)洗液和復(fù)性液處理的和未經(jīng)去雜質(zhì)洗液和復(fù)性液處理的重組人白蛋白的對(duì)比，左邊為經(jīng)去雜質(zhì)洗液和復(fù)性液處理的白蛋白，右邊為對(duì)照，即未經(jīng)去雜質(zhì)洗液和復(fù)性液處理的白蛋白。
[0024]圖3是經(jīng)過(guò)去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理的和未經(jīng)去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理的重組白蛋白樣品的紫外-可見(jiàn)光譜對(duì)比圖。
[0025]圖4是經(jīng)過(guò)去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理(圖中表示為“除過(guò)色素”)的和未經(jīng)去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理(圖中表示為“未除色素”)的重組人血清白蛋白和ATF-HSA融合蛋白的SDS-PAGE的電泳圖。
[0026]圖5是經(jīng)過(guò)去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理的(圖中表示為“經(jīng)過(guò)本專(zhuān)利處理的”或“經(jīng)過(guò)本專(zhuān)利除過(guò)色素的”)重組人血清白蛋白和未經(jīng)去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理的(圖中表示為“未經(jīng)本專(zhuān)利處理的”或“未經(jīng)本專(zhuān)利除過(guò)色素的”)重組人血清白蛋白的熒光發(fā)射光譜圖。其中上圖是在波長(zhǎng)為370nm激發(fā)光激發(fā)下的熒光發(fā)射光譜圖；下圖是在不同濃度的ANS熒光探針的條件下，檢測(cè)到的熒光最大發(fā)射值曲線圖(激發(fā)波長(zhǎng)為370nm，熒光強(qiáng)度檢測(cè)波長(zhǎng)為475nm，白蛋白濃度恒為10μΜ)ο
[0027]圖6是經(jīng)過(guò)去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理的(圖中表示為“經(jīng)過(guò)本專(zhuān)利處理過(guò)的”)重組人血清白蛋白和未經(jīng)去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理的(圖中表示為“未用本專(zhuān)利處理過(guò)的”)重組人血清白蛋白經(jīng)AKTA Pure處理后的色譜圖。
[0028]圖7是經(jīng)過(guò)去雜質(zhì)洗液和復(fù)性液處理的和未經(jīng)去雜質(zhì)洗液和復(fù)性液處理的重組ATF-HSA融合蛋白的對(duì)比，左邊為經(jīng)過(guò)去雜質(zhì)洗液和復(fù)性液處理的重組ATF-HSA，右邊為未經(jīng)去雜質(zhì)洗液和復(fù)性液處理的重組ATF-HSA。
[0029]圖8是是經(jīng)過(guò)去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理的和未經(jīng)去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理的重組白蛋白融合蛋白(ATF-HSA)樣品的紫外-可見(jiàn)光譜對(duì)比圖。
[0030]圖9是經(jīng)過(guò)去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理的(圖中表示為“經(jīng)過(guò)本專(zhuān)利處理的”)和未經(jīng)去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理的(圖中表示為“未經(jīng)本專(zhuān)利處理的”)重組人血清白蛋白融合蛋白(ATF-HSA)的熒光發(fā)射光譜圖。其中上圖是在波長(zhǎng)為370nm激發(fā)光激發(fā)下的熒光發(fā)射光譜圖；下圖是在不同濃度的ANS熒光探針的條件下，檢測(cè)到的熒光最大發(fā)射值曲線圖(激發(fā)波長(zhǎng)為370nm，熒光強(qiáng)度檢測(cè)波長(zhǎng)為475nm，白蛋白濃度恒為ΙΟμΜ)。
[0031 ] 圖10是PAItrap-HSA活性檢測(cè)原理示意圖。
[0032]圖11是實(shí)施例3中經(jīng)過(guò)去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理(圖中表示為“除色素”)的和未經(jīng)去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理(圖中表示為“未除色素”)的重組PAItrap-HSA活性檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0033]以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但不應(yīng)該將此理解為本發(fā)明范圍僅限于以下的實(shí)施例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0034]實(shí)施例一去除重組人血清白蛋白(帶有6個(gè)His標(biāo)簽)中的雜質(zhì)(如色素等)
[0035]I)溶液配制
[0036]去雜質(zhì)洗液:6M尿素、30%酒精、20mM Tris-HCl (pH 7.4)，用0.22μπι的濾膜進(jìn)行抽濾處理，所得抽濾液即為去雜質(zhì)洗液。
[0037]蛋白復(fù)性液:20mMTris-HCl(pH 7.4)、500mM NaCl。
[0038]蛋白洗脫液:20mMTris_HCl(pH7.4)、500mM NaCl、500mM咪唑。
[0039]2)使用質(zhì)粒載體pPICZ在酵母中表達(dá)重組人血清白蛋白，取發(fā)酵得到的菌液2L離心30分鐘(7500rpm，Hitachi Koki CR22N高速冷凍離心機(jī)，R9A2轉(zhuǎn)頭)去除沉淀，然后將上清液用孔徑0.45μπι的濾膜進(jìn)行抽濾，得抽濾液。將抽濾液流經(jīng)已經(jīng)平衡好的N1-NTA柱(GE公司，流速5ml/min,柱體積25ml)，此時(shí)抽濾液中帶有6個(gè)Hi s標(biāo)簽的重組人血清白蛋白就會(huì)結(jié)合在N1-NTA柱上。
[0040]3)用兩個(gè)柱體積的平衡液(20mM Tris-HCl pH 7.4，500mM NaCl)沖洗N1-NTA柱。[0041 ] 4)用三個(gè)柱體積的去雜蛋白溶液(20mM Tris-HCl pH 7.4，500mM NaCl，5mM咪唑)對(duì)N1-NTA柱繼續(xù)沖洗，并用紫外檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，直至檢測(cè)到的蛋白質(zhì)吸收光譜消失，表明雜蛋白被洗脫干凈。
[0042]5)用去雜質(zhì)洗液(20mM Tris-HCl pH 7.4，30%的酒精，61尿素)對(duì)附_1^\柱進(jìn)行10個(gè)柱體積的沖洗，可以看到有大量的色素被洗脫下來(lái)(圖1)，并對(duì)洗脫下來(lái)的色素進(jìn)行收集。
[0043]6)用蛋白復(fù)性液(20mM Tris-HCl pH TA, 500mM NaCl)對(duì) N1-NTA 柱再進(jìn)行 5-7 個(gè)柱體積的沖洗，以使蛋白復(fù)性。
[0044]7)用蛋白洗脫液(20mM Tris-HCl pH 7.4，500mM NaCl，500mM咪唑)對(duì)蛋白進(jìn)行洗脫，并用紫外檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)有蛋白質(zhì)流出時(shí)，對(duì)流出的蛋白進(jìn)行收集，此即為重組人血清白蛋白。
[0045]8)對(duì)收集的蛋白用透析液(20mM Tris-HCl pH 8.0,50mM NaCl)進(jìn)行透析兩次，每次透析至少進(jìn)行2個(gè)小時(shí)。也可以直接對(duì)水透析，之后抽凍成重組人血清白蛋白凍干粉。
[0046]9)對(duì)經(jīng)上述步驟處理過(guò)的重組人血清白蛋白與未經(jīng)去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理(即按上述步驟處理但不進(jìn)行第5)和第6)步)的重組人血清白蛋白進(jìn)行顏色對(duì)比(附圖2)，結(jié)果顯示未經(jīng)去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理過(guò)的重組人血清白蛋白(附圖2右)包裹的色素等雜質(zhì)很多，而經(jīng)上述步驟處理過(guò)的重組人血清白蛋白(附圖2左)所包裹的色素等雜質(zhì)基本去除干凈。其中進(jìn)行比對(duì)的兩個(gè)樣品的蛋白濃度均為4mg/ml。
[0047]10)對(duì)經(jīng)上述步驟處理過(guò)的重組人血清白蛋白與未經(jīng)去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理的重組人血清白蛋白進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光譜分析(圖3)，結(jié)果比對(duì)顯示:在相同的濃度下，經(jīng)上述步驟處理過(guò)的重組人血清白蛋白所含的雜質(zhì)吸收光譜(大約在360nm左右)明顯下降。其中進(jìn)行比對(duì)的兩個(gè)樣品的蛋白濃度均為lmg/ml。
[0048]11)將經(jīng)上述步驟處理過(guò)的重組人血清白蛋白和未經(jīng)去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理過(guò)的重組人血清白蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳(圖4)，結(jié)果顯示經(jīng)上述步驟處理過(guò)的重組人血清白蛋白和未經(jīng)去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理過(guò)的重組人血清白蛋白在SDS-PAGE凝膠電泳上的條帶位置相同，其分子量均為66.5kDa，表明去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理步驟不影響重組人血清白蛋白的分子量，經(jīng)去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理過(guò)的重組人血清白蛋白分子鏈不會(huì)發(fā)生斷裂。
[0049]12)應(yīng)用ANS探針對(duì)經(jīng)上述步驟處理過(guò)的重組人血清白蛋白和未經(jīng)去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理過(guò)的重組人血清白蛋白進(jìn)行活性檢測(cè)(圖5)，結(jié)果顯示經(jīng)去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理過(guò)的重組人血清白蛋白活性明顯高于未經(jīng)去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理過(guò)的重組人血清白蛋白活性，且與注射用人血清白蛋白的活性基本相同。
[0050]13)應(yīng)用AKTA Pure(注:柱子型號(hào)為SuperdexTM 200，10/300GL，牛血清白蛋白在此型號(hào)柱的出峰體積約為13.8ml)對(duì)注射用HSA、經(jīng)上述步驟處理過(guò)的重組人血清HSA以及未經(jīng)去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理過(guò)的重組人血清HSA進(jìn)行色譜分析(圖6)，結(jié)果表明經(jīng)去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理過(guò)的重組人血清HSA純度遠(yuǎn)高于注射用HSA，也高于未經(jīng)去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理過(guò)的重組人血清HSA。
[0051 ]實(shí)施例二去除融合蛋白ATF-HSA(帶有6個(gè)His標(biāo)簽)的雜質(zhì)(如色素等)
[0052]I)溶液配制
[0053]去雜質(zhì)洗液、蛋白復(fù)性液和蛋白洗脫液的配制同實(shí)施例一。
[0054]2)使用質(zhì)粒載體pPICZ在酵母中表達(dá)重組人血清白蛋白融合蛋白ATF-HSA(ATF是人尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)的N末端片段)，取發(fā)酵得到的菌液2L離心30分鐘(7500rpm,Hitachi Koki CR22N高速冷凍離心機(jī)，R9A2轉(zhuǎn)頭)去除沉淀，然后將上清液用孔徑0.45μπι的濾膜進(jìn)行抽濾，得抽濾液。將抽濾液流經(jīng)已經(jīng)平衡好的N1-NTA柱(GE公司，流速5ml/min，柱體積25ml)，此時(shí)抽濾液中帶有6個(gè)His標(biāo)簽的ATF-HSA就會(huì)結(jié)合在N1-NTA柱上。
[0055]3)用兩個(gè)柱體積的平衡液(20mM Tris-HCl pH 7.4，500mM NaCl)沖洗N1-NTA柱。
[0056]4)用三個(gè)柱體積的去雜蛋白溶液(20mM Tris-HCl pH 7.4，500mM NaCl，5mM咪唑)對(duì)N1-NTA柱繼續(xù)沖洗，并用紫外檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，直至檢測(cè)到的蛋白質(zhì)吸收光譜消失，表明雜蛋白被洗脫干凈。
[0057]5)用去雜質(zhì)洗液(20mM Tris-HCl pH 7.4，30%的酒精，61尿素)對(duì)附_1^\柱進(jìn)行10個(gè)柱體積的沖洗，可以看到有大量的色素被洗脫下來(lái)(附圖1)，并對(duì)洗脫下來(lái)的色素進(jìn)行收集。
[0058]6)用蛋白復(fù)性液(20mM Tris-HCl pH TA, 500mM NaCl)對(duì) N1-NTA 柱再進(jìn)行 5-7 個(gè)柱體積的沖洗，以使蛋白復(fù)性。
[0059]7)用蛋白洗脫液(20mM Tris-HCl pH 7.4,500mM NaCl，500mM咪唑)對(duì)蛋白進(jìn)行洗脫，并用紫外檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)有蛋白質(zhì)流出時(shí)，對(duì)流出的蛋白進(jìn)行收集，此即為重組人血清白蛋白融合蛋白ATF-HSA。
[0060]8)對(duì)收集的蛋白用透析液(20mM Tris-HCl pH 8.0，50mM的NaCl)進(jìn)行透析兩次，每次透析至少進(jìn)行2個(gè)小時(shí)，之后也可抽凍成重組人血清白蛋白融合蛋白(ATF-HSA)凍干粉。
[0061 ] 9)對(duì)經(jīng)上述步驟處理過(guò)的重組ATF-HSA與未經(jīng)去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理(即按上述步驟處理但不進(jìn)行第5)和第6)步)的重組ATF-HSA進(jìn)行顏色對(duì)比(圖7)，結(jié)果顯示未經(jīng)去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理過(guò)的重組ATF-HSA(圖7右)色素等雜質(zhì)很多，而經(jīng)上述步驟處理過(guò)的重組ATF-HSA(圖7左)色素等雜質(zhì)基本去除干凈。其中進(jìn)行比對(duì)的兩個(gè)樣品的蛋白濃度均為2.8mg/ml。
[0062]10)對(duì)經(jīng)上述步驟處理過(guò)的重組ATF-HSA與未經(jīng)去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理過(guò)的重組ATF-HSA進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光譜分析(圖8)，結(jié)果比對(duì)顯示:經(jīng)上述步驟處理過(guò)的重組ATF-HSA所含的雜質(zhì)吸收光譜(大約在360nm左右)明顯下降。其中進(jìn)行比對(duì)的兩個(gè)樣品的蛋白濃度均為lmg/ml。
[0063]11)將經(jīng)上述步驟處理的和未經(jīng)去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理的重組ATF-HSA進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳(圖4)，結(jié)果顯示經(jīng)上述步驟處理的和未經(jīng)去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理的重組ATF-HSA在SDS-PAGE凝膠電泳上的條帶位置相同，其分子量均為84KDa，表明去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理步驟不會(huì)影響重組白蛋白融合蛋白ATF-HSA的分子量，即去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理步驟不會(huì)使重組白蛋白融合蛋白分子鏈斷裂。
[0064]12)應(yīng)用ANS探針對(duì)經(jīng)上述步驟處理的重組ATF-HSA和未經(jīng)去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理的重組ATF-HSA進(jìn)行活性檢測(cè)(圖9)，結(jié)果顯示經(jīng)上述步驟處理的重組ATF-HSA活性明顯高于未經(jīng)去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理的重組ATF-HSA活性。
[0065]實(shí)施例三去除重組血清白蛋白融合蛋白PAItrap-HSA(帶有6個(gè)His標(biāo)簽)的雜質(zhì)(如色素等)
[0066]PAItrap是基于尿激酶的蛋白酶結(jié)構(gòu)域通過(guò)突變構(gòu)建的人工PA1-1抑制劑，其與野生型尿激酶相比含有以下突變位點(diǎn):3195六，637匕1?，1?2171^(:1224，附450.?41廿&?在體內(nèi)會(huì)很快被內(nèi)源性的PA1-1所滅活，導(dǎo)致其半衰期較短，將其與HSA融合大大延長(zhǎng)了其在體內(nèi)的半衰期(約7倍)。
[0067]I)溶液配制
[0068]去雜質(zhì)洗液:33%的酒精，6M尿素。
[0069]蛋白復(fù)性液和蛋白洗脫液的配制同實(shí)施例一。
[0070]2)使用的質(zhì)粒載體pPICZaA在畢赤酵母X33中表達(dá)重組血清白蛋白融合蛋白PAItrap-HSA，目的蛋白進(jìn)行胞外分泌表達(dá)，每天加入1%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)四天后，將發(fā)酵菌液離心40分鐘(8000rpm，Hitachi Koki CR22N高速冷凍離心機(jī)，R9A2轉(zhuǎn)頭)去除沉淀，然后將上清液用孔徑0.45μπι的過(guò)濾膜抽濾，得抽濾上清，后、將抽濾上清流經(jīng)已經(jīng)平衡好的N1-NTA柱(GE公司，流速15ml/min，柱體積20ml)，此時(shí)抽濾上清中帶有6個(gè)His標(biāo)簽的重組人血清白蛋白融合蛋白就會(huì)結(jié)合在N1-NTA柱上。
[0071]3)用5個(gè)柱體積的平衡液(20mM Tris-HCl pH 7.4，500mM NaCl)沖洗N1-NTA柱。
[0072]4)用去雜質(zhì)洗液(33 %的酒精、6M尿素)對(duì)N1-NTA柱進(jìn)行8個(gè)柱體積的沖洗，可以看到有大量的色素被洗脫下來(lái)，并對(duì)洗脫下來(lái)的色素進(jìn)行收集。
[0073]5)用蛋白復(fù)性液(20mM Tris-HCl pH 7.4，500mM NaCl)對(duì)N1-NTA柱再進(jìn)行6個(gè)柱體積的沖洗，以使蛋白復(fù)性。
[0074]6)用蛋白洗脫液(20mM Tris-HCl pH 7.4，500mM NaCl，500mM咪唑)對(duì)蛋白進(jìn)行洗脫，并用紫外檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)有蛋白質(zhì)流出時(shí)，對(duì)流出的蛋白進(jìn)行收集，此即為重組人血清白蛋白融合蛋白PAItrap-HSA.
[0075]7)對(duì)收集的蛋白用透析液(20mM Tris-HCl pH 7.4，150mM的NaCl)進(jìn)行透析兩次，每次透析至少進(jìn)行2個(gè)小時(shí)。
[0076]8)透析后離心20分鐘(20000rpm，Hitachi Koki CR22N高速冷凍離心機(jī)，R20A2轉(zhuǎn)頭)去除沉淀。所得蛋白溶液用Millipore超濾管(1000Da)進(jìn)行濃縮，然后分裝，-80°C保存。
[0077]9)用已報(bào)道的顯色法(chromogenic assay) [Gorlatova NV(2003).Mapping of aconformat1nal epitope on plasminogen activator inhibitor-1 by randommutagenesis.1mplicat1ns for serpin funct1n.J B1l Chem.]進(jìn)行酉每活測(cè)定和對(duì)比分析。
[0078]其反應(yīng)原理如圖10所示，在10yL體積的反應(yīng)體系中，加入不同濃度的PAItrap-HSA與PA1-1反應(yīng)1min ,PAItrap-HSA會(huì)與PA1-1結(jié)合，然后加入uPA反應(yīng)1min，未與PAItrap-HSA結(jié)合的PA1-1會(huì)共價(jià)結(jié)合到uPA的催化中心上導(dǎo)致其活性喪失。然后加入發(fā)光底物S2444，uPA能特異識(shí)別其中的酶切位點(diǎn)并將其發(fā)色基團(tuán)-P-硝基苯胺(pNA)切下來(lái)，最后通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)405nm的吸光度值就可以測(cè)定uPA和PA1-1的酶活并進(jìn)而間接計(jì)算出PA I trap -HSA 的活性。
[0079]具體測(cè)定過(guò)程:
[0080](a)材料
[0081]經(jīng)上述步驟純化的和與未經(jīng)去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液純化(即按上述步驟純化但不進(jìn)行第4)和第5)步)的PAItrap-HSA ,PA1-1 14-1B，uPA，uPA底物S-2444。
[0082]Buffer:20mM Tris-HCl pH7.4,150mM NaCl，0.I%BSA.0.22ym孔徑濾膜過(guò)濾。
[0083](b)步驟
[0084]用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定各蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，換算成摩爾濃度。
[0085]稀釋蛋白:PAItrap-HSA從ΙΟμΜ四倍往下稀釋六個(gè)梯度，PA1-1 14-1Β和uPA稀釋至ΙΟΟηΜ，方便后面根據(jù)需要加入到ΙΟΟμΙ反應(yīng)體系中配制成實(shí)驗(yàn)所需的終濃度。
[0086]確定uPA和PA1-1在測(cè)定體系中的終濃度:在某一濃度下uPA切割底物在1min內(nèi)產(chǎn)生的信號(hào)較強(qiáng)、線性關(guān)系良好;PA1-1的濃度是經(jīng)過(guò)摸索確定的能剛好完全抑制或者接近完全抑制(90%以上)uPA時(shí)的濃度。uPA 1nM,PA1-1 18nM。
[OO87 ] 對(duì)于經(jīng)上述步驟純化的和未經(jīng)上述步驟純化的PA 11 rap -H SA，均按照以下順序加入樣品:
[0088]①正對(duì)照80μ1buffer+?θμ? uPA+ΙΟμΙ 800μΜ S-2444
[0089]②負(fù)對(duì)照62μ1buffer+?θμ? uPA+18yl ΡΑΙ-1 室溫孵育lOmin+ΙΟμΙ 800μΜ S-2444
[0090]③?⑨52μ1buffer+?θμ? PAItrap-HSA+18yl PA1-1 室溫孵育lOmin+ΙΟμΙ uPA室溫孵育lOmin+ΙΟμΙ 800μΜ S_2444(PAItrap_HSA濃度從低到高:2.44141E-10?1.0E-6M)
[0091]其中將PAItrap-HSA與PA1-1預(yù)先孵育lOmin，接著加入U(xiǎn)PA(1nM)混勻在室溫下反應(yīng)1min，每一步加入溶液后要充分混勻且盡量避免產(chǎn)生氣泡，最后加入發(fā)光底物S2444(Chromogenix)并立即放入B1Tek Synergy 4酶標(biāo)儀中在405nm處，15s/read進(jìn)行檢測(cè)lOmin。每個(gè)測(cè)試至少重復(fù)3次。PAItrap-HSA的IC50使用GraphPad Prism 5軟件中的非線性回歸(nonlinear regress1n)進(jìn)行擬合。
[0092]結(jié)果見(jiàn)圖11，結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理處理過(guò)的重組PAItrap-HSA活性與未經(jīng)去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液處理過(guò)的重組PAItrap-HSA(沒(méi)有第4、5兩步，其余步驟相同)活性基本一致，說(shuō)明使用去雜質(zhì)洗液和蛋白質(zhì)復(fù)性液對(duì)重組PAItrap-HSA進(jìn)行除雜不會(huì)影響蛋白的酶活。
[0093]以上實(shí)施例描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征及優(yōu)點(diǎn)，本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明原理的范圍下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)均落入本發(fā)明保護(hù)的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.去除血清白蛋白或其融合蛋白中雜質(zhì)的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)使用去雜質(zhì)洗液對(duì)結(jié)合或吸附在填料上的血清白蛋白或其融合蛋白進(jìn)行去雜質(zhì)操作； (2)然后使用蛋白復(fù)性液對(duì)可逆變性的血清白蛋白或其融合蛋白進(jìn)行復(fù)性； (3)然后用蛋白洗脫液將血清白蛋白或其融合蛋白從填料上洗脫下來(lái)。 其中所述去雜質(zhì)洗液是可以使血清白蛋白或其融合蛋白可逆地變性的溶液，所述蛋白復(fù)性液是不含有蛋白變性劑的溶液，所述蛋白洗脫液是能夠?qū)⒌鞍讖奶盍仙舷疵撓聛?lái)的溶液。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述去雜質(zhì)洗液包含蛋白變性劑、有機(jī)溶劑和無(wú)機(jī)溶劑。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述蛋白質(zhì)變性劑是選自尿素、鹽酸胍、低pH變性鹽，丙酮或適宜濃度的堿液中的一種或幾種;優(yōu)選，所述蛋白質(zhì)變性劑是尿素，濃度為4-8M;更優(yōu)選，所述蛋白質(zhì)變性劑是尿素，濃度為6M。4.權(quán)利要求2的方法，其中所述有機(jī)溶劑是選自酒精、甘油、異丙醇或肉豆蔻酸或其鹽例如肉豆蔻酸鈉中的一種或幾種。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述有機(jī)溶劑是酒精，濃度為3% —60 % ;優(yōu)選，酒精的濃度為 30-33%。6.權(quán)利要求2的方法，其中所述無(wú)機(jī)溶劑是水和/或液氨。7.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白洗脫液含有咪唑，濃度為150-750mM。8.權(quán)利要求7的方法，其中咪唑的濃度為500mM。9.權(quán)利要求1的方法，其中填料是親和層析填料、離子交換色譜填料或共價(jià)色譜填料。10.權(quán)利要求9的方法，其中親和層析填料是N1-NTA填料或抗白蛋白抗體填料。
【文檔編號(hào)】C07K1/14GK106046149SQ201610486534
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月28日
【發(fā)明人】黃明東, 李世杰, 袁彩, 陳卓, 陳錦燦, 雪光浦, 鄭科
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所