一株具有高表達氰水合酶的重組大腸桿菌及其應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了本發(fā)明提供一株具有高表達氰水合酶的重組大腸桿菌，分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)BL21，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏日期：2016年05月，保藏號為CGMCC No.7.239。所述的重組大腸桿菌為將氰水合酶基因與表達載體連接，然后將該載體轉入大腸桿菌(Escherichia coli)中得到重組菌株。本發(fā)明提供的大腸桿菌，可以合成大量高效可溶性表達的氰水合酶，為合成氰水合酶提供了另一條途徑；本發(fā)明所得氰水合酶純度高，用于降解無機氰化物效果佳，具有極高的降解率。CGMCC NO.573420120116CGMCC No.7.23920160510
【專利說明】
一株具有高表達氰水合酶的重組大腸桿菌及其應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一株重組大腸桿菌及其應用，特別涉及一株具有高表達氰水合酶的重 組大腸桿菌及其應用。
【背景技術】
[0002] 氰在工業(yè)生產(chǎn)中應用較廣，產(chǎn)生的含氰廢水所造成的環(huán)境污染急需治理。生物法 處理含氰廢水具有轉化產(chǎn)物無毒無害、不易發(fā)生二次污染，建設和運行成本較低，能處理金 屬絡合氰化物等優(yōu)勢。在自然界中超過2000種植物以及一些微生物能產(chǎn)生氰或利用氰。另 一方面，氰化氫(HCN)是一種弱酸(pKa = 9.2)，在酸性或中性條件下易形成揮發(fā)性HCN，從而 可能造成空氣污染。而且氰本身對微生物具有毒性，因此從實際應用角度看，只有在高堿性 下具有氰耐受性的菌株才有工業(yè)應用價值。從目前國內(nèi)外的研究情況看來，能在堿性條件 下降解無機氰化物的菌種并不多，而能耐受高濃度氰的菌種則更少。
[0003] 與細胞降解相比，利用酶作催化劑處理環(huán)境污染物具有反應速度快、效率高、條件 溫和、能耗低、操作簡便等優(yōu)點，因此酶治理環(huán)境污染具有廣闊的應用前景。根據(jù)目前研究， 氛水合酶（cyanide hydratase)和氛水解酶（cyanidase/cyanide dihydratase)是兩種較 為重要的無機氰降解酶。但是從野生菌株中無法獲得大量的降解酶，限制了酶在氰方面的 降解。目前Watanabe等從Pseudomonas stutzeri AK61中克隆出氛水解酶cyanidase的基因 并成功在大腸桿菌中表達，Jandhyala等也成功克隆和表達了來自Bacillus pumilus C1的 氰水解酶基因 cynD。國內(nèi)關于降氰酶的克隆研究報道僅見于喬琳等對一株能以氰化物為唯 一碳氮源的銅綠假單胞細菌Pseudomonas aeruginosa KT-C001所產(chǎn)的氰水合酶基因（cya-1)進行了克隆和活性表達的研究，發(fā)現(xiàn)cya-1的表達需要氰化物的誘導。
[0004]公開于該【背景技術】部分的信息僅僅旨在增加對本發(fā)明的總體背景的理解，而不應 當被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已為本領域一般技術人員所公知的現(xiàn)有技術。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一株具有高表達氰水合酶的重組大腸桿菌，分類命名為大腸埃希氏菌 (Escherichia coli)BL21，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保 藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏日期:2016年05月 10日，保藏號為CGMCC No.7.239;所述的重組大腸桿菌為將氰水合酶基因與表達載體連接， 然后將該載體轉入大腸桿菌(Escherichia coli)中得到重組菌株。
[0006] 其中，所述的氰水合酶基因來源于產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes sp. )DN25;所述的大腸 桿菌為大腸桿菌(Escherichia coli)BL21，即Ε·coli BL21。
[0007] 其中，所述的氰水合酶基因序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] -株具有高表達氰水合酶的重組大腸桿菌的構建方法，包含以下操作步驟：
[0009] (1)將氰水合酶基因連接到表達載體相應的多克隆位點上；
[0010] (2)將步驟(1)中所得表達載體導入大腸桿菌中，即得。
[0011] 其更詳細的步驟為：
[0012] (1)將經(jīng)聚合酶鏈式反應(PCR)獲得的氰水合酶目的基因連接到表達載體相應的 多克隆位點上，并轉入大腸桿菌DH5a內(nèi)，經(jīng)測序驗證獲得正確的重組質(zhì)粒；
[0013] ⑵利用熱激法將步驟(1)中所得重組質(zhì)粒導入大腸桿菌BL21內(nèi)，即得重組菌株。
[0014] 其中，步驟(1)中所述的表達載體為pET28a。
[0015] -株具有高表達氰水合酶的重組大腸桿菌，通過誘導劑誘導重組大腸桿菌，可實 現(xiàn)目標氰水合酶的高效表達，獲得可溶性好及活性高的氰水合酶蛋白，分子量約為38kDa; 其誘導條件為〇D6QQ為0.6，溫度為28°C，誘導劑濃度為0.3mM，誘導時間為12小時;其中，所述 的誘導劑為異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。
[0016] 其中，上述所得具有高表達氰水合酶的重組大腸桿菌用于對氰化物進行降解，降 解反應為在pH值為8.0的磷酸緩沖液中，保持溫度為30°C，反應50分鐘，氰化物完全被降解。
[0017] 其中，大腸桿菌內(nèi)所得氰水合酶利用鎳柱親和層析進行純化，即依次使用含濃度 為10mM、100mM咪唑的緩沖液洗脫，最后經(jīng)濃度為500mM的咪唑洗脫可獲得氰水合酶，純度達 95%以上。
[0018] 其中，上述所得純化的氰水合酶用于氰化物降解。
[0019] 其中，利用純化的氰水合酶降解氰化物時，降解反應為在pH值為8.0的磷酸緩沖液 中，保持溫度為30°C，反應50分鐘，氰化物完全被降解。
[0020] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0021] 1)本發(fā)明提供的大腸桿菌，可以合成大量高效可溶性表達的氰水合酶，為合成氰 水合酶提供了另一條途徑；
[0022] 2)本發(fā)明所得氰水合酶純度高，用于降解無機氰化物效果佳，具有極高的降解率。
【附圖說明】
[0023]圖1本發(fā)明菌株構建流程圖。
[0024]圖2本發(fā)明菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶。
[0025] 圖3本發(fā)明菌株的最佳pH和溫度。
[0026] 圖4本發(fā)明菌株的分離純化電泳圖譜。
[0027] 圖5本發(fā)明所得氰水合酶水解氰化鉀的實驗結果。
【具體實施方式】
[0028] 下面結合附圖【具體實施方式】進行詳細描述，但應當理解本發(fā)明的保護范圍并不受
【具體實施方式】的限制。
[0029] 實施例1
[0030] 1.具有高表達氰水合酶的重組大腸桿菌的構建：
[0031] 1)用引物 1:5'-GCCCATATGATGGCGCATTACCCTAAATTC-3'(SEQ ID N0.2)，引物2:5'-TTCAAGCTTTTACTTCCGCAAGCTCCGAAC-3'(SEQ ID N0.3)對Alcaligenes sp.DN25 (Alcaligenes sp.DN25保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號 CGMCC NO. 5734)基因組進行PCR擴增，反應條件如表1所示：
[0032] 表 1
[0033]
[0034] 其中，步驟（2)進行30個循環(huán)，即得目的基因氰水合酶基因，基因序列如SEQ ID NO. 1所示；
[0035] 2)用限制性內(nèi)切酶Hind III和Ndel對所得氰水合酶目的基因和表達載體pET28a 在37°C下酶切8h;
[0036] 3)在16°C下用T4連接酶將酶切后的氰水合酶目的基因和表達載體pET28a連接 l〇h，并轉入大腸桿菌DH5a內(nèi)，經(jīng)測序驗證獲得正確的重組質(zhì)粒，用熱激法將所得重組質(zhì)粒 轉入表達菌株E.coli BL21(即Escherichia coli BL21)，并涂布于50yg/mL卡納霉素抗性 平板培養(yǎng)12h;
[0037] 4)用菌落PCR和雙酶切從平板篩選陽性克隆并經(jīng)測序驗證，對構建成功的重組菌 進行誘導表達12h，經(jīng)蛋白電泳確定目的蛋白條帶為38kDa，可溶性良好。
[0038] 2.具有高表達氰水合酶的重組大腸桿菌的誘導發(fā)酵產(chǎn)酶
[0039]將重組大腸桿菌種子液接種于含1%。卡那霉素的新鮮培養(yǎng)基中，在37°C，180rpm下 培養(yǎng)至〇D6(x)為0.6，加入誘導劑IPTG濃度為0.3mM，再于28°C，180rpm的恒溫搖床中培養(yǎng)12h。
[0040] 3.氰水合酶蛋白分離純化
[0041] 用Binding buffer( 10mM咪唑，500mM NaCl，20mM Tris-HCl，pH 8)重懸菌體，利用 高壓勻漿機(800bar~lOOObar)破碎菌體并以4°C、9000rpm和離心30min獲取粗酶液;將粗 酶液過先用Binding buffer平衡的鎳柱，使用Binding buffer洗掉非目標蛋白，再用 Elution buffer A(100mM咪唑，500mM NaCl，20mM Tris-HCl,pH 8)進一步洗脫，最后用 Elution buff er(500mM 咪唑，500mM NaCl，20mM Tris-HCl, pH 8)洗脫獲得目的蛋白，即得 高純度氰水合酶。
[0042] 所得純化的氰水合酶用于氰化物降解，降解反應在pH值為8.0的磷酸緩沖液中，保 持溫度為30°C，反應50分鐘，氰化物完全被降解。
[0043]圖2表明在本發(fā)明工藝條件下的菌株生長曲線，培養(yǎng)7h后菌株生長達到穩(wěn)定期(實 驗中通常取穩(wěn)定期中部的細胞進行實驗），此時可獲得具有高活性目標酶的重組大腸桿菌。 圖3表明純化所得的氰水合酶降解無機氰化物的最適條件為pH8.0、溫度30°C。圖4說明經(jīng) 過分離純化后，可獲得純度達98%的目標蛋白，其分子量約為38kDa。圖5反映氰水合酶對 10mM氰化鉀的降解進程曲線，由圖可見，目標酶降解活力高，10min可快速降解約50%的氰 化鉀，50min后氰化鉀降解完全。
[0044]前述對本發(fā)明的具體示例性實施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述 并非想將本發(fā)明限定為所公開的精確形式，并且很顯然，根據(jù)上述教導，可以進行很多改變 和變化。對示例性實施例進行選擇和描述的目的在于解釋本發(fā)明的特定原理及其實際應 用，從而使得本領域的技術人員能夠實現(xiàn)并利用本發(fā)明的各種不同的示例性實施方案以及 各種不同的選擇和改變。本發(fā)明的范圍意在由權利要求書及其等同形式所限定。
【主權項】
1. 一株具有高表達氰水合酶的重組大腸桿菌，其特征在于:將氰水合酶基因與表達載 體連接，然后將該載體轉入大腸桿菌(Escherichia coli)中得到重組菌株。2. 根據(jù)權利要求1所述具有高表達氰水合酶的重組大腸桿菌，其特征在于:所述的氰水 合酶基因來源于產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes sp. )DN25;所述的大腸桿菌為大腸桿菌BL21。3. 根據(jù)權利要求1所述具有高表達氰水合酶的重組大腸桿菌，其特征在于:所述的氰水 合酶基因序列如SEQ ID NO. 1所示。4. 一株如權利要求1所述的具有高表達氰水合酶的重組大腸桿菌的構建方法，包含以 下操作步驟： (1) 將氰水合酶基因連接到表達載體相應的多克隆位點上； (2) 將步驟(1)中所得表達載體導入大腸桿菌中，即得。5. 根據(jù)權利要求1所述具有高表達氰水合酶的重組大腸桿菌的構建方法，其特征在于： 步驟(1)中所述的表達載體為pET28a。6. -株如權利要求1所述的具有高表達氰水合酶的重組大腸桿菌的誘導發(fā)酵產(chǎn)酶的方 法，其特征在于:通過誘導劑誘導重組大腸桿菌，可實現(xiàn)目標氰水合酶的高效表達，獲得可 溶性好及活性高的氰水合酶蛋白；其誘導條件為0D6QQ為0.6,溫度為28°C，誘導劑濃度為 0.3mM，誘導時間為12小時，誘導劑為異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。7. 根據(jù)權利要求6所述的誘導發(fā)酵產(chǎn)酶的方法誘導所得的具有高表達氰水合酶的重組 大腸桿菌用于對氰化物進行降解。8. 根據(jù)權利要求6所述誘導發(fā)酵產(chǎn)酶的方法，其特征在于:重組大腸桿菌內(nèi)誘導發(fā)酵所 得的氰水合酶利用鎳柱親和層析進行純化，即依次使用含濃度為10mM、100mM咪唑的緩沖液 洗脫，最后經(jīng)濃度為500mM的咪唑洗脫可獲得氰水合酶，純度達95 %以上。9. 根據(jù)權利要求8所述的誘導發(fā)酵產(chǎn)酶的方法，其特征在于:所得的純化的氰水合酶用 于氰化物降解。10. 根據(jù)權利要求9所述的誘導發(fā)酵產(chǎn)酶的方法，其特征在于：利用純化的氰水合酶降 解氰化物時，降解反應在pH值為8.0的磷酸緩沖液中，保持溫度為30°C，反應50分鐘。
【文檔編號】C12N15/70GK105907694SQ201610342894
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月23日
【發(fā)明人】李青云, 劉幽燕, 梁文思
【申請人】廣西大學, 廣西南寧明科環(huán)?？萍加邢薰?br>