一種重組大腸桿菌及其生產(chǎn)l-甲硫氨酸的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重組大腸桿菌及其生產(chǎn)L?甲硫氨酸的應(yīng)用，所述重組大腸桿菌構(gòu)建方法為：將大腸桿菌的metJ基因敲除后，轉(zhuǎn)入metA*基因和yjeH基因，再敲除metI基因，然后敲除lysA基因和/或thrB基因構(gòu)建而成；所相比較于出發(fā)菌株E.coli W3110幾乎不能在胞外積累L?甲硫氨酸(<50mg/l)，本發(fā)明重組大腸桿菌在含有20ml培養(yǎng)基的搖瓶發(fā)酵時(shí)最高產(chǎn)量這里可達(dá)4.083g/l，在3L工作體積的5L發(fā)酵罐中最高效價(jià)可達(dá)9.752g/l。
【專利說明】
一種重組大腸桿菌及其生產(chǎn)L-甲硫氨酸的應(yīng)用 (一)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種L-甲硫氨酸的制備，特別涉及利用重組大腸桿菌制備L-甲硫氨酸 的應(yīng)用。 (二)
【背景技術(shù)】
[0002] 甲硫氨酸(methionine，以下簡稱Met)，又名蛋氨酸，是脊椎動(dòng)物必需的唯--種 含硫氨基酸，Met參與多種生理代謝過程，Met缺乏會(huì)導(dǎo)致多種疾病。在動(dòng)物飼料制造行業(yè)， 為了保證動(dòng)物營養(yǎng)的均衡性，提高動(dòng)物對(duì)飼料的營養(yǎng)利用率，加快生長速度，縮短飼養(yǎng)周 期，一般會(huì)添加5%的Met。目前，每年的Met需求量高達(dá)數(shù)十萬噸，因此Met具有十分廣闊的 市場(chǎng)前景。
[0003] 現(xiàn)有的Met生產(chǎn)方法是化學(xué)合成法，以丙烯醛、甲硫醇、氰化物等為原料，首先甲硫 醇和丙烯醛反應(yīng)生成3-甲硫基丙醛，3-甲硫基丙醛再與HCN、NH4HC0 3合成海因，海因在KHC03 存在的條件下堿水解為甲硫氨酸鉀鹽，最后酸化得到(D，L)-Met，飼料中的D-Met進(jìn)入動(dòng)物 體內(nèi)必須經(jīng)過代謝脫氨作用以及氨基轉(zhuǎn)移作用首先轉(zhuǎn)化成L-Met才能被正常利用。
[0004] 隨著對(duì)微生物代謝細(xì)節(jié)信息的不斷深入理解，以葡萄糖以及礦物質(zhì)鹽等廉價(jià)反應(yīng) 物為原料，以更低的成本利用微生物內(nèi)合適的生物合成途徑的可用性發(fā)酵制備具有生物活 性的L-氨基酸表現(xiàn)出良好的前景。但是，由于野生型菌株因?yàn)樽陨淼募?xì)胞經(jīng)濟(jì)性，胞內(nèi)的氨 基酸生物合成途徑受到非常嚴(yán)格的反饋調(diào)控。所以有效制造方法的重要條件是在制造預(yù)期 氨基酸方面產(chǎn)量大幅增加(與親本微生物相比較)的適當(dāng)微生物。高產(chǎn)微生物的獲得可以通 過傳統(tǒng)的突變/篩選及/或用新的代謝工程技術(shù)。在代謝工程技術(shù)中，由于不同的代謝途徑 之間存在非線性的關(guān)聯(lián)，不同的代謝節(jié)點(diǎn)具有不同的性質(zhì)，首先需要識(shí)別可以引起氨基酸 高產(chǎn)的基因或等位基因。然后將該基因/等位基因引入微生物菌株內(nèi)或利用分子生物學(xué)技 術(shù)將其加以失活，以實(shí)現(xiàn)相應(yīng)的氨基酸高產(chǎn)。但是往往要結(jié)合多種不同的方法才能真正地 實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)。
[0005] 微生物體內(nèi)的L-Met生物合成非常復(fù)雜，L-Met和L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸 同屬于天冬氨酸家族，L-天冬氨酸經(jīng)過天冬氨酸半醛/天冬氨酸酰磷酸轉(zhuǎn)化為L-高絲氨酸。 然后在三個(gè)酶的催化下經(jīng)過三步反應(yīng)，包括(經(jīng)由0-琥珀酰高絲氨酸及胱硫醚)用一個(gè)巰基 (該巰基來自半胱氨酸）替代該分子上的羥基，而形成一個(gè)高半胱氨酸，再將該巰基加以甲 基化后制得L-Met。該甲基是衍生自絲氨酸代謝作用。可見，L-Met的生物合成與天冬氨酸、 絲氨酸及半管氨酸的生物合成關(guān)系緊密，所以其生物合成調(diào)控遠(yuǎn)較其他氨基酸復(fù)雜。除了 主要合成途徑(天冬氨酸-高絲氨酸-高半胱氨酸)之外，半胱氨酸的生物合成以及無機(jī)硫的 固定，C1單位的代謝作用必須要加以最佳協(xié)調(diào)。基于以上理由，過去對(duì)L-Met的發(fā)酵生產(chǎn)尚 未有深入細(xì)致的研究。但是隨著技術(shù)理念的發(fā)展，以及近年來在絲氨酸及半胱氨酸代謝作 用的最適化作用方面已經(jīng)取得決定性進(jìn)步，所以L-Met的發(fā)酵法生產(chǎn)也越來越具有可行性。
[0006] 有關(guān)L-Met的發(fā)酵法生產(chǎn)，利用下列基因/等位基因可以實(shí)現(xiàn)L-Met高產(chǎn)：日本專利 JP 2000139471A中曾述及的metA等位基因。metA等位基因編碼0-高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶，催 化高絲氨酸和琥珀酰輔酶A合成0-琥珀酰高絲氨酸，該0-高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶受到L-Met和 SAM(S-腺苷甲硫氨酸）的反饋抑制。通過上調(diào)metA的表達(dá)量，以及通過定點(diǎn)突變削弱其對(duì)L-Met以及SAM( S-腺苷甲硫氨酸）的敏感性，能夠較大程度地提高L-Met的效價(jià)。日本專利JP 2000139471A中述及的metj敲除，metj基因編碼L-Met代謝作用的核心調(diào)控因子，參與了 L-Met合成代謝支路中幾乎所有酶的轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控，因此敲除metj基因有利于代謝支路中關(guān)鍵 酶的表達(dá)量上調(diào)，最終提高發(fā)酵液中L-Met的效價(jià)。美國專利US 20090298135A1中述及的 y j eH等位基因 。y j eH等位基因編碼的蛋白可能與L_Me t分泌有關(guān)，該基因的表達(dá)上調(diào)可以有 效提高發(fā)酵液中L-Met的效價(jià)。除此之外，還有很多關(guān)于C1單位生成(如metF(編碼亞甲基四 氫葉酸還原酶），gcvTHP(編碼甘氨酸裂解酶系），lpd(編碼硫辛酰胺脫氫酶），glyA(絲氨酸 羥甲基轉(zhuǎn)移酶）等），半胱氨酸生成（如cysE(編碼絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶）），NADPH可用性（如 PntAB(編碼NAD(P)轉(zhuǎn)氫酶），UdhA(編碼NAD(P)轉(zhuǎn)氫酶)等)等相關(guān)的有利于提高L-Met發(fā)酵 效價(jià)的專利報(bào)道。 (三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明目的是提供一種重組大腸桿菌及其在制備L-甲硫氨酸中的應(yīng)用，本發(fā)明通 過1)解除關(guān)鍵酶的轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控，2)增強(qiáng)目標(biāo)產(chǎn)物的分泌和/或削弱目標(biāo)產(chǎn)物的重吸收，3)提 高胞內(nèi)目標(biāo)代謝產(chǎn)物代謝途徑的代謝通量，構(gòu)建一種L-Met高產(chǎn)的大腸桿菌菌株，并利用本 發(fā)明的代謝工程菌株發(fā)酵生產(chǎn)L-Met。
[0008] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0009] 本發(fā)明提供一種重組大腸桿菌，所述重組大腸桿菌構(gòu)建方法為：將大腸桿菌的 metj基因敲除后，轉(zhuǎn)入metA*基因和yjeH基因，再敲除metl基因，然后敲除lysA基因和/或 thrB基因構(gòu)建而成;所述metA*基因是將SEQ ID如.2所示氨基酸序列第881為丙氨酸以)突 變?yōu)楦拾彼?G)，獲得突變0-高絲氨酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶基因 metA*，核苷酸序列為SEQ ID No.3 所示，所述yjeH基因核苷酸序列為SEQ ID No. 5所示，lysA基因核苷酸序列為SEQ ID No. 7 所示，thrB基因核苷酸序列為SEQ ID No.8所示。
[0010] 進(jìn)一步，所述重組大腸桿菌是將大腸桿菌的metj基因敲除后，轉(zhuǎn)入metA*基因和 yjeH基因，再敲除metl基因，然后敲除lysA基因構(gòu)建而成。
[0011] 進(jìn)一步，所述重組大腸桿菌是將大腸桿菌的metj基因敲除后，轉(zhuǎn)入metA*基因和 yjeH基因，再敲除metl基因，然后敲除thrB基因構(gòu)建而成。
[0012] 進(jìn)一步，所述重組大腸桿菌是將大腸桿菌的metj基因敲除后，轉(zhuǎn)入metA*基因和 yjeH基因，再敲除metl基因，然后敲除lysA基因和thrB基因構(gòu)建而成。
[0013] 進(jìn)一步，所述重組大腸桿菌以大腸桿菌為E.coli W3110為出發(fā)菌株。
[0014]本發(fā)明還提供一種所述重組大腸桿菌在生成L-甲硫氨酸中的應(yīng)用，具體所述的應(yīng) 用為:將重組大腸桿菌接種到含50mg/L的Amp的LB培養(yǎng)基中，37°C、200rpm培養(yǎng)8-12h，將培 養(yǎng)液以體積濃度5%的接種量接種到含50mg/L的Amp的MS培養(yǎng)基中，添加終濃度為100μ mol/ L IPTG，在30 ± 2°C、100~500rpm(優(yōu)選30°C、150rpm)培養(yǎng)發(fā)酵48h，發(fā)酵結(jié)束后，獲得含L-甲硫氨酸的發(fā)酵液，將發(fā)酵液分離純化，獲得L-甲硫氨酸;所述MS培養(yǎng)基終濃度組成為:葡 萄糖20g/L、（NH4) 2S〇4 16g/L、KH2P〇4 lg/L、酵母提取物2g/L、CaC03 10g/L、lml/L微量元素 溶液，溶劑為水，pH值自然；其中微量元素溶液組成為：0.15g/L Na2Mo〇4 · 2H20、2.5g/L Na3B03、0.7g/L CoCl2.6H20、0.25g/L CuS〇4.5H20、1.6g/L MnCl2.4H20、0.3g/L ZnS〇4· 7H20,溶劑為水；當(dāng)重組大腸桿菌敲除lysA時(shí)，向MS培養(yǎng)基中添加終濃度0.02g//L的L-賴氨 酸；當(dāng)重組大腸桿菌敲除thrB基因時(shí)，向MS培養(yǎng)基中添加終濃度為0.8g/L的L-蘇氨酸；當(dāng)重 組大腸桿菌同時(shí)敲除lysA基因和thrB基因時(shí)，向培養(yǎng)基中添加終濃度0.02g/L的L-賴氨酸 和終濃度為0.8g/L的L-蘇氨酸。
[0015] 本發(fā)明以E.coli W3110為出發(fā)菌株，首先使用基因敲除技術(shù)構(gòu)建了E.coli W3110 AmetJ。然后定點(diǎn)突變技術(shù)和DNA重組技術(shù)從E.COliW3110的基因組中克隆并突變獲得抗 反饋抑制的〇-高絲氨酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶基因 metA*，同時(shí)也克隆了L-Met輸出蛋白基因 y jeH， 構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pTrc99A/metA*/yjeH，并將其轉(zhuǎn)化到宿主菌E. coli W3110 Δ metj中獲 得菌株E.coli W3110 ΔmetJ/pTrc99A/metA*/yjeH。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明敲除了與E·coli W3110攝入L-Met相關(guān)的基因 metl (編碼甲硫氨酸透酶，與甲硫氨酸結(jié)合酶，ATP合酶共同組 成甲硫氨酸攝入系統(tǒng)），破壞攝入與分泌的平衡，構(gòu)建E .coli W311〇AmetJAmetI/ pTrC99A/metA*/y jeH。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明敲除了參與賴氨酸生物合成的關(guān)鍵基因 lysA(編 碼二氨基庚二酸脫羧酶)或參與蘇氨酸生物合成的關(guān)鍵基因 thrB(編碼高絲氨酸激酶），切 斷了賴氨酸生物合成支路或蘇氨酸生物合成支路，構(gòu)建E.coli W311〇AmetJAmetI Δ lysA/pTrc99A/metA*/yjeH和E.coli W3110 Δ metj Δ metlΔ thrB/pTrc99A/metA*/yjeH。在 此基礎(chǔ)上，本發(fā)明同時(shí)敲除了參與賴氨酸生物合成的關(guān)鍵基因 lysA(編碼二氨基庚二酸脫 羧酶)和參與蘇氨酸生物合成的關(guān)鍵基因 thrB(編碼高絲氨酸激酶），切斷了賴氨酸生物合 成支路和蘇氨酸生物合成支路，構(gòu)建E · coli W3110 Δ met J Δ metl Δ lysA Δ thrB/pTrc99A/ metA*/yjeH〇
[0016] 構(gòu)建獲得的菌株接入MS培養(yǎng)基中，對(duì)于賴氨酸缺陷菌添加0.02g/l的L-賴氨酸，對(duì) 于蘇氨酸缺陷菌添加〇.8g/l的L-蘇氨酸，Amp的工作濃度為50mg/L，IPTG的工作濃度為100μ 111〇1/1^，30°(：發(fā)酵4811生產(chǎn)1^-1以，在含有2〇1111培養(yǎng)基的搖瓶發(fā)酵時(shí)最高產(chǎn)量這里可達(dá) 4.083g/l，在3L工作體積的5L發(fā)酵罐中最高效價(jià)可達(dá)9.752g/l。
[0017] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在:與以往的發(fā)明不同，本發(fā)明除了考 慮解除L-甲硫氨酸生物生成途徑中關(guān)鍵酶的轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控，上調(diào)部分關(guān)鍵酶及分泌因子外， 還考慮了削弱L-甲硫氨酸攝入系統(tǒng)，切斷競(jìng)爭代謝支路，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)代謝物流向L-甲 硫氨酸代謝支路調(diào)動(dòng)的最大化，以及減少L-甲硫氨酸在胞內(nèi)的積累，盡可能削弱反饋調(diào)控， 最終提高L-甲硫氨酸的發(fā)酵效價(jià);相比較于出發(fā)菌株E.coli W3110幾乎不能在胞外積累L-甲硫氨酸（<50mg/l)，本發(fā)明重組大腸桿菌在含有20ml培養(yǎng)基的搖瓶發(fā)酵時(shí)最高產(chǎn)量這里 可達(dá)4.083g/l，在3L工作體積的5L發(fā)酵罐中最高效價(jià)可達(dá)9.752g/l。 (四）
【附圖說明】
[0018] 圖1為重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建流程；
[0019]圖2為重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)驗(yàn)證；
[0020]圖3為最優(yōu)高產(chǎn)菌株的發(fā)酵進(jìn)程。 (五)
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0022] 本發(fā)明所述親本菌株E.coli W3110保藏于耶魯大學(xué)CGSC保藏中心(Coli Genetic Stock Center)，保藏日期1975年8月5日，保藏編號(hào)CGSC#4474,已在專利US 2009/0298135 Al,US 2010/0248311 A1 中公開。
[0023] 實(shí)施例1:構(gòu)建表達(dá)重組質(zhì)粒pTrc99A/metA*
[0024] 將E.coli W3110在LB平板(2%瓊脂，下同）上劃線分離單菌落，挑取單克隆接種到 LB試管中，200rpm，37°C培養(yǎng)過夜。取1.5ml過夜培養(yǎng)的菌液，12000rpm，室溫離心lmin，棄上 清，重復(fù)操作一次。獲得菌體后，用FastDNA" SPIN Kit for Soil(MP Biomedicals)提取 E. co 1 i W3110基因組DNA，0.9 %瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。
[0025] E.coli W3110來源的0-高絲氨酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶基因 metA是L-甲硫氨酸合成支路 的第一個(gè)關(guān)鍵酶，其核苷酸序列見SEQ ID No. 1，氨基酸序列見SEQ ID No.2,設(shè)計(jì)兩條特異 性引物P1和P2(見表1)，以E.coli W3110基因組為模板擴(kuò)增獲得metA基因，上下游分別帶有 Nco I和Sac I兩個(gè)酶切位點(diǎn)，膠回收純化后將metA基因克隆到pGEM-T easy上，獲得pGEM-T easy/metA〇
[0026] 根據(jù)報(bào)道，111的#8%^>(；有利于降低其對(duì)L-Met的敏感性，從而抵抗反饋抑制，核苷 酸序列見SEQ ID No. 3,氨基酸序列見SEQ ID No. 4 (SEQ ID No. 2氨基酸第881位A突變?yōu)?G)。因此設(shè)計(jì)引物P3和P4(見表1)對(duì)pGEM-T easy/metA進(jìn)行定點(diǎn)突變，具體流程參考 (Current Protocols in Protein Science.2011,26.6.1-26.6.10；Analytical Biochemistry.2008,375:376-378)的描述，獲得pGEM-T easy/metA*。用Nco I和Sac I處理 pTrc99A和pGEM-T easy/metA*，膠回收純化后用T4DNA 1 igase連接，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒 pTrc99A/metA*。
[0027] 實(shí)施例2:構(gòu)建表達(dá)重組質(zhì)粒pTrc99A/metA*/y jeH
[0028] E.coli W3110yjeH基因是L-甲硫氨酸的重要分泌因子，其核苷酸序列見SEQ ID No.5,氨基酸序列見SEQ ID No.6,設(shè)計(jì)特異性引物P5，P6(見表1)，以E.coli W3110基因組 為模板(見實(shí)施例1)擴(kuò)增獲得yjeH基因，上下游分別帶有BamH I和Hind III兩個(gè)酶切位點(diǎn)， P5的BamH I位點(diǎn)和yjeH的起始密碼子ATG之間加一段RBS序列:AAGGAGATATAC。膠回收純化 后，連接pGEM-T easy(同實(shí)施例1)后測(cè)序，結(jié)果表明克隆到的yjeH序列和GenBank公布的序 列一致。用Sac I和Hind III處理pGEM-T easy/yjeH和pTrc99A/metA*后T4DNA ligase連 接，構(gòu)建獲得pTrc99A/metA*/yjeH重組表達(dá)質(zhì)粒。
[0029] 實(shí)施例3:構(gòu)建E.coli W3110 AmetJ/pTrc99A/metA*/yjeH
[0030] 在E.coli中metj基因與L-Met生物合成有十分重要的作用，所以本發(fā)明首先要構(gòu) 建一個(gè)metj基因敲除菌，解除其對(duì)L-Met生物合成途徑中眾多關(guān)鍵酶的轉(zhuǎn)錄抑制?；蚯贸?技術(shù)參考（Construction of Escherichia coli K-12in-frame , single-gene knockout mutants:the Keio collection.Molecular Systems Biology.2006)的描述，具體過程如 下：
[0031] 為了敲除E.coli W3110中的metj基因，設(shè)計(jì)引物P7，P8(見表1)擴(kuò)增獲取線性打靶 片段，膠回收純化后，再經(jīng)過一步醇沉濃縮，使DNA濃度> lyg/μL。
[0032] 將pKD46轉(zhuǎn)化到E.coli W3110中，單克隆接種到LB試管中，30°C過夜培養(yǎng)，再以體 積濃度1%的接種量接種到含50ml LB培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，并加入500μ1 lmol/1的L-阿 拉伯糖，150rpm，30°C培養(yǎng)至0D6qq Ο · 4~Ο · 6，4000rpm，4°C離心1 Omin收集細(xì)胞，制備電轉(zhuǎn)化 感受態(tài)，詳細(xì)過程見（Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3ed Edition,99-102)的 描述。
[0033] 取5μ1線性打靶片段與40μ1電擊感受態(tài)細(xì)胞混合，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的2mm電擊杯中，冰浴 lmin左右，用電穿孔儀(MicroPluser?，BI〇-RAD)進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，電擊完成后立即加入lml LB培養(yǎng)基并立即輕柔吸出，轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，37 °C復(fù)蘇2-3h后涂布含0.05mg/l Kan (卡那霉素）的LB平板，37°C倒置培養(yǎng)12-16h。
[0034] 根據(jù)GenBank公布的序列，設(shè)計(jì)兩條位于metj基因外側(cè)的引物P9，P10(見表1)，以 及位于kan抗性基因內(nèi)部的引物kl和k2(見表1)，以P9和k2為一對(duì)引物，kl和P10為一對(duì)引 物，P9和P10為一對(duì)引物，E. co 1 i W3110的基因組(見實(shí)例1)為陰性對(duì)照，對(duì)篩選平板上長出 的菌落進(jìn)行菌落PCR檢驗(yàn)，其中陰性對(duì)照不能用P9和k2以及P10和kl擴(kuò)增出條帶，而能用P9 和P10擴(kuò)增與GenBank公布的序列大小一致的條帶。而陽性對(duì)照則可以用三對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增 能出條帶，而且前兩對(duì)引物擴(kuò)增出的條帶長度之和等于第三對(duì)引物擴(kuò)增所得的條帶長度。 [0035]回收以陽性菌落為模板，P9和P10為引物擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物，測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明 E.coli W3110中的metj基因被兩端帶有FRT位點(diǎn)的kan片段成功替換。
[0036] 制備E.coli W3110metJ: :kan化轉(zhuǎn)感受態(tài)，轉(zhuǎn)化輔助質(zhì)粒pCP20,涂布含Amp的抗性 平板，30°C培養(yǎng)過夜。用P9和P10對(duì)單克隆進(jìn)行菌落PCR檢驗(yàn)，以E.coli W3110的基因組為陰 性對(duì)照，理論上陽性克隆可以擴(kuò)增出比對(duì)照小的片段。得到的陽性克隆接種LB試管，37°C培 養(yǎng)8-10h，然后42°C培養(yǎng)10_12h，然后再無抗LB平板上劃線分離單菌落，37°C倒置培養(yǎng)，得到 的單菌落分別在含Amp和含Kan的LB平板上檢驗(yàn)抗性，同時(shí)喪失Amp(氨芐青霉素)和Kan(卡 那霉素)抗性的單菌落為陽性菌落，即E. co 1 i W3110 Δ metJ，將以陽性克隆為模板，P9和P10 為引物的擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收純化后，送樣測(cè)序，結(jié)果表明metj已經(jīng)成功敲除。
[0037] 將重組表達(dá)質(zhì)粒pTrc99A/metA*/yjeH(見實(shí)施例2)轉(zhuǎn)化到E. coli W3110 Δ metj中 構(gòu)建獲得E.coli W3110 AmetJ/pTrc99A/metA*/yjeH〇
[0038] 實(shí)施例4:構(gòu)建E.coli W3110 AmetJAmetI/pTrc99A/metA*/yjeH
[0039] 在E·coli中存在兩套L_Met攝入系統(tǒng)（transport system) :MetD和MetP，其中MetD 為主要的攝入系統(tǒng)，由metD基因座編碼，其中包含metl(編碼甲硫氨酸透酶），metN(編碼ATP 合酶)和metQ(編碼甲硫氨酸結(jié)合酶)三個(gè)基因。本發(fā)明旨在E.coli W3110 ΔmetJ的基礎(chǔ)上 通過基因敲除破壞L-Met攝入系統(tǒng)，破壞攝入與分泌的平衡，提高L-Met的發(fā)酵效價(jià)。用與實(shí) 施例3相同的方法，設(shè)計(jì)線性打靶片段擴(kuò)增引物P11和P12(見表1)，檢驗(yàn)引物P13和P14(見表 1)。測(cè)序表明成功構(gòu)建了E. coli W3110 Δ metj Δ metI/pTrc99A/metA*/y jeH〇
[0040] 實(shí)施例5:構(gòu)建E.coli W3110 AmetJAmetl Δ lysA/pTrc99A/metA*
[0041] /yjeH
[0042] L-Met和L-賴氨酸都以L-天冬氨酸為前體，在代謝通量上存在相互競(jìng)爭的關(guān)系。本 發(fā)明在E. coli W3110 Δ metJ Δ metl的基礎(chǔ)上，用實(shí)施例3相同的方法，設(shè)計(jì)線性片段擴(kuò)增引 物P15和P16,檢驗(yàn)引物P19和P20,敲除了lysA基因，核苷酸序列見SEQ ID如.7，切斷了1^-賴 氨酸生物合成途徑，成功構(gòu)建了E.coli W3110 AmetJAmetl Δ lysA/pTrc99A/metA*/yjeH〇
[0043] 實(shí)施例6:構(gòu)建E.coli W3110 AmetJAmetl Δ thrB/pTrc99A/metA*/yjeH
[0044] L-Met和L-蘇氨酸都以L-天冬氨酸為前體，在代謝通量上存在相互競(jìng)爭的關(guān)系。本 發(fā)明在E. coli W3110 Δ metJ Δ metl的基礎(chǔ)上，用實(shí)施例3相同的方法，設(shè)計(jì)線性片段擴(kuò)增引 物P17和P18,檢驗(yàn)引物P21和P22,敲除了thrB基因，核苷酸序列見SEQ ID如.8，切斷了1^-蘇 氨酸生物合成途徑，成功構(gòu)建了E.coli W3110 AmetJAmetl Δ thrB/pTrc99A/metA*/yjeH〇
[0045] 表1引物
[0047] 實(shí)施例7:構(gòu)建E.coli W3110 AmetJAmetl Δ lysAA thrB/pTrc99A/metA*/yjeH
[0048] 在E. col i W3110 Δ met J Δ metl Δ lySA的基礎(chǔ)上，繼續(xù)實(shí)施例5相同的方法敲除 thrB基因，同時(shí)切斷L-賴氨酸和L-蘇氨酸生物合成途徑，成功構(gòu)建E. coli W3110 Δ met J Δ metlΔlysA Δ thrB/pTrc99A/metA*/yjeH〇
[0049] 實(shí)施例8:搖瓶發(fā)酵及效價(jià)比較
[0050] 將生產(chǎn)菌株(包括E.coli W3110、E.coli W311〇AmetJ/pTrc99A、E.coli W3110A metJ/pTrc99A/metA*/yjeH、E·coli W3110 Δ metj Δ metI/pTrc99A/metA*/yjeH、E·coli W3110 Δ metJ Δ metlΔlysA/pTrc99A/metA*/yjeH、E.coli W311〇AmetJΔmetlΔ thrB/ pTrc99A/metA*/yjeH、E.coli W3110 Δ metj Δ metlΔlysA Δ thrB/pTrc99A/metA*/yjeH)接 種到10ml含50mg/L Amp的LB培養(yǎng)基（lOg/L蛋白胨，5g//L酵母提取物，lOg/L NaCl，溶劑為 水，pH值自然）中，37 °C、200rpm培養(yǎng)用作預(yù)培養(yǎng)物，其中E · co 1 i W3110 Δ met J/pTrc99A為陰 性對(duì)照。8-12h后，接種lml預(yù)培養(yǎng)物到裝20ml含50mg/L的MS培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L、（NH4)2S〇4 16g/L、KH2P〇4 lg/L、酵母提取物2g/L、CaC03 10g/L(單獨(dú)滅菌）、lml/L微量元素溶液，溶劑 為水，pH值自然;其中微量元素溶液組成為:0.15g/L Na2Mo〇4· 2H20、2.5g/L Na3B03、0.7g/L C0CI2 · 6H20、0.25g/L CuS〇4 · 5H20、1.6g/L MnCh · 4H20、0.3g/L ZnS〇4 · 7H20,溶劑為水） 的500ml搖瓶中，添加終濃度為100μ mol/L IPTG，然后在30°C、150rpm培養(yǎng)發(fā)酵48h，發(fā)酵結(jié) 束后，取lml發(fā)酵液，12000rpm，室溫離心3min，將發(fā)酵上清稀釋100倍，用全自動(dòng)氨基酸分析 儀（SYKAM S-433D，德國）分析氨基酸效價(jià)。發(fā)酵液上清中的L-Met含量如表2所示。E. co 1 i W3110 AmetJAmetl Δ lysA/pTrc99A/metA*/yjeH向MS培養(yǎng)基中添加終濃度0.02g/L的L-賴 氨酸；E.coli W3110 AmetJAmetl Δ thrB/pTrc99A/metA*/yjeH向MS培養(yǎng)基中添加終濃度 為0 · 8g/L 的 L-蘇氨酸；E · coli W3110 Δ metj AmetlAlysAA thrB/pTrc99A/metA*/y jeH 向 培養(yǎng)基中添加終濃度〇. 〇2g/L的L-賴氨酸和終濃度為0.8g/L的L-蘇氨酸。
[0051 ]表2不同高產(chǎn)菌株的效價(jià)
[0053] 實(shí)施例9:最優(yōu)菌株E · coli W3110 Δ metj Δ metl Δ lysA/pTrc99A/metA*/y jeH 5L 罐分批補(bǔ)料發(fā)酵
[0054] 在實(shí)施例 8 基礎(chǔ)上，對(duì)最優(yōu)高產(chǎn)菌株 E.coli W3110 AmetJAmetl Δ lysA/pTrc99A/ metA*/yjeH進(jìn)行了 5L發(fā)酵罐放大。具體過程如下：
[0055] 將生產(chǎn)菌株(E.coli W3110、E.coli W311〇AmetJ/pTrc99A、E.coli W311〇AmetJ Ametl Δ lysA/pTrc99A/metA*/yjeH)接種到 10ml含有50mg/l的Amp的LB培養(yǎng)基中，37°C、 200rpm培養(yǎng)用作一級(jí)種子。8-12h后，接種0.5ml到含有50ml LB培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，共接 3瓶，37°C、200rpm培養(yǎng)作為二級(jí)種子。6-8h后，將3瓶種子液混合后接種到含有3L MS培養(yǎng)基 (其中的葡萄糖為30g/l，添加終濃度0.02g/L的L-賴氨酸）的5L發(fā)酵罐中，添加終濃度為100 ymol/L IPTG，31°C，攪拌轉(zhuǎn)速500rpm，通氣量為21/min，pH 7.0,用氨水或磷酸調(diào)節(jié)pH，發(fā)酵 48h，每6h取一次樣，當(dāng)發(fā)酵液中的葡萄糖濃度降低到5g/l以下，加入100ml補(bǔ)料培養(yǎng)基（葡 萄糖500g/L、（NH4)2S〇4 16g/L、KH2P〇4 12.5g/L、L-lysine 4.357g/L、Na2S2〇3 23.83g/L、酵 母提取物lg/L、Vb12 0.02g/L、溶劑為水，pH值自然），使葡萄糖達(dá)到20g/L。樣品處理方式如 實(shí)施例8所述，結(jié)果表明陰性對(duì)照在整個(gè)發(fā)酵過程中發(fā)酵液中的甲硫氨酸效價(jià)都小于50mg/ 1，而E · coli W3110 Δ metj Δ metl Δ lysA/pTrc99A/metA*/y jeH的發(fā)酵進(jìn)程見圖3，發(fā)酵效價(jià) 隨著菌體干重的增加而增加，發(fā)酵42h，發(fā)酵效價(jià)即可達(dá)到9.417g/l，最高發(fā)酵效價(jià)可達(dá) 9.752g/l。
[0056] 本發(fā)明不受上述具體文字描述的限制，本發(fā)明可在權(quán)利要求書所概括的范圍內(nèi)做 各種改變，如以其他屬于大腸桿菌屬的微生物作為出發(fā)菌株，對(duì)另一套攝入系統(tǒng)MetP的破 壞，其他分泌因子(如ygaZH)的表達(dá)上調(diào)，以及實(shí)施例中提到的最優(yōu)菌的發(fā)酵過程優(yōu)化、補(bǔ) 料工藝開發(fā)均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種重組大腸桿菌，其特征在于所述重組大腸桿菌構(gòu)建方法為:將大腸桿菌的metJ 基因敲除后，轉(zhuǎn)入metA*基因和yjeH基因，再敲除metl基因，然后敲除IysA基因和/或thrB基 因構(gòu)建而成;所述metA*基因是將SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第881位丙氨酸突變?yōu)楦拾?酸，獲得突變O-高絲氨酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶基因 metA*，所述yjeH基因核苷酸序列為SEQ ID No · 5所示。2. 如權(quán)利要求1所述重組大腸桿菌，其特征在于所述重組大腸桿菌是將大腸桿菌的 metj基因敲除后，轉(zhuǎn)入metA*基因和yjeH基因，再敲除metl基因，然后敲除IysA基因構(gòu)建而 成。3. 如權(quán)利要求1所述重組大腸桿菌，其特征在于所述重組大腸桿菌是將大腸桿菌的 metj基因敲除后，轉(zhuǎn)入metA*基因和yjeH基因，再敲除metl基因，然后敲除thrB基因構(gòu)建而 成。4. 如權(quán)利要求1所述重組大腸桿菌，其特征在于所述重組大腸桿菌是將大腸桿菌的 metj基因敲除后，轉(zhuǎn)入metA*基因和yjeH基因，再敲除metl基因，然后敲除IysA基因和thrB 基因構(gòu)建而成。5. 如權(quán)利要求1-4之一所述重組大腸桿菌，其特征在于所述大腸桿菌為E. coli W3110。6. -種權(quán)利要求1所述重組大腸桿菌在生成L-甲硫氨酸中的應(yīng)用。7. 如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為：將重組大腸桿菌接種到含 50mg/L的Amp的LB培養(yǎng)基中，37 °C、200rpm培養(yǎng)8-12h，將培養(yǎng)液以體積濃度5 %的接種量接 種到含50mg/L的Amp的MS培養(yǎng)基中，添加終濃度為lOOymol/L IPTG，在30±2°C、100~ 500rpm培養(yǎng)發(fā)酵48h，發(fā)酵結(jié)束后，獲得含L-甲硫氨酸的發(fā)酵液，將發(fā)酵液分離純化，獲得L-甲硫氨酸;所述MS培養(yǎng)基終濃度組成為：葡萄糖20g/L、（NH4) 2S〇4 16g/L、KH2P〇4 lg/L、酵母 提取物2g/L、CaC03 10g/L、lml/L微量元素溶液，溶劑為水，pH值自然;其中微量元素溶液組 成為：0.15g/L Na2MoO4 · 2H20、2.5g/L Na3BO3、0.7g/L CoCl2 · 6H20、0.25g/L CuS〇4 · 5H20、 1.6g/L MnCl2 · 4H20、0.3g/L ZnS〇4 · 7H20,溶劑為水；當(dāng)重組大腸桿菌敲除IysA時(shí)，向MS培 養(yǎng)基中添加終濃度0.02g/L的L-賴氨酸；當(dāng)重組大腸桿菌敲除thrB基因時(shí)，向MS培養(yǎng)基中添 加終濃度為〇. 8g/L的L-蘇氨酸；當(dāng)重組大腸桿菌同時(shí)敲除IysA基因和thrB基因時(shí)，向培養(yǎng) 基中添加終濃度0.02g/L的L-賴氨酸和終濃度為0.8g/L的L-蘇氨酸。
【文檔編號(hào)】C12R1/19GK105886449SQ201610232254
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年4月14日
【發(fā)明人】鄭裕國, 柳志強(qiáng), 黃建峰, 沈寅初
【申請(qǐng)人】浙江工業(yè)大學(xué)