專利名稱：：從重組大腸桿菌XM-LU制備內(nèi)切-β-1,3-1,4-葡聚糖酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種細菌培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝，尤其是涉及一種重組大腸桿菌XM-LU生長與內(nèi)切-P-l，3-l，4-葡聚糖酶合成的發(fā)酵培養(yǎng)基及流加發(fā)酵工藝。技術(shù)背景P-葡聚糖是一類廣泛存在于高等植物和真菌細胞壁中的多糖，是自然合成的多糖中含量最多的。如纖維素即為P-l,4-葡聚糖。很長一段時間有關(guān)p-葡聚糖酶的研究一直停留在對纖維素酶的研究階段。20世紀60年代，首次出現(xiàn)源于絲狀真菌的可降解非纖維素P-葡聚糖的P-葡聚糖酶，有關(guān)非纖維素酶系P-葡聚糖酶的研究才真正開始(PitsonS.M.,SeviourR丄，McDougallB.M..Noncellulolyticfongal(5-glucanase:Theirphysiologyandregulation.EnzymeMicrob.Technol.，1993，15:178-191.)。(3-葡聚糖酶指可以使p-葡聚糖降解為小分子糖的酶，系酶系家族中的水解酶類，按照其作用方式可分為內(nèi)切、外切和葡萄糖苷酶，主要包括內(nèi)-P-l,3-葡聚糖酶(E.C.3.2丄39);內(nèi)-p-l,4-葡聚糖酶(E.C.3.2丄4);內(nèi)p-l，3-l,4-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.73);外-卩-l,3-葡聚糖酶(E.C.3.2丄58);外-卩-l,4-葡聚糖酶(E.C.3.2丄74)以及少數(shù)內(nèi)-|3-1，6-葡聚糖酶(E.C.3.2丄75)和內(nèi)-p-l,2-葡聚糖酶(E.C.3,2丄71)。內(nèi)切型|3-葡聚糖酶主要以隨機的方式將|3-葡聚糖降解成數(shù)段短鏈，外切酶則是從非還原末端開始作用，將(3-葡聚糖切成一個個的葡萄糖，(3-葡聚糖的完全降解一般都是兩類酶協(xié)同作用的結(jié)果(PitsonS.M.，SeviourR丄&McDougallB.M..NoncellulolyticfungalP-glucanase:Theirphysiologyandregulation[J].EnzymeMicrob.Technol.，1993,15:178-191.)。(3-葡聚糖是谷物的重要抗營養(yǎng)因子，在飼料中添加p-葡聚糖酶，特別是內(nèi)切-(3-葡聚糖酶，可迅速降低谷物中(3-葡聚糖的粘度，大大提高飼料的生物轉(zhuǎn)化率。1961年，Moscatelli等人首次發(fā)現(xiàn)了內(nèi)切-|3-1，3-:1,4-葡聚糖酶(E.C.3.2丄73)，此酶只能水解卩-1,3和p-l，4混合鍵連接的葡聚糖，對單一含有p-l,3或(3-1,4糖苷鍵的葡聚糖不起作用。由于大麥等谷類作物中都含有大量混合的(J-l,3和p-l,4糖苷鍵，因此內(nèi)切-[3-l,3-l，4-葡聚糖酶是麥類飼料中主要應(yīng)用的一類P-葡聚糖酶，該酶在作為飼料添加劑改善谷類營養(yǎng)價值和啤酒風(fēng)味方面發(fā)揮著重要的作用。1975年，美國首先正式使用P-葡聚糖酶加入飼料大麥來消除抗營養(yǎng)因子，取得良好效果，隨后酶作為飼料添加劑的研究和應(yīng)用得以推廣。隨著畜禽業(yè)的不斷發(fā)展，以應(yīng)用p-葡聚糖酶作為一種新型飼料添加劑已日益為人們所重視，而尋找p-葡聚糖酶的高產(chǎn)菌株也成為科學(xué)工作者關(guān)注的焦點。20世紀80年代初，國外p-葡聚糖酶制劑產(chǎn)品逐漸進入國內(nèi)市場。我國于20世紀80年代將該酶的生產(chǎn)及研究列入"六五"和"七五"攻關(guān)項目的子專題，在獲得工業(yè)化生產(chǎn)菌后，又列入國家"火炬計劃"，并于20世紀90年代開始生產(chǎn)和推廣應(yīng)用。20世紀末P-葡聚糖酶大規(guī)模應(yīng)用于啤酒工業(yè)，效益顯著。然而，目前國內(nèi)對P-葡聚糖酶的研究仍多停留在實驗室階段，實際生產(chǎn)廠家屈指可數(shù)，并且這些廠家大都以木霉、黑曲霉、枯草芽孢桿菌和絲狀真菌為出發(fā)菌株，不僅菌體生長慢、產(chǎn)量低，而且以固體發(fā)酵為主，后處理工藝粗糙，導(dǎo)致酶的穩(wěn)定性差，損失率高，生產(chǎn)成本和使用成本相應(yīng)提高。因此目前國內(nèi)對P-葡聚糖酶的需求仍主要通過進口滿足，來源窄、價格高。可見，有必要選育新的P-葡聚糖酶高產(chǎn)菌株、改善菌株培養(yǎng)條件與發(fā)酵工藝以提高酶產(chǎn)量，使徹底改變我國P-葡聚糖酶主要依靠進口的局面成為可能。液體深層培養(yǎng)由于操作簡單，發(fā)酵周期短，后處理容易，在P-葡聚糖酶的生產(chǎn)中被普遍采用。許多研究者對液體發(fā)酵P-葡聚糖酶的培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化。賀小賢和姜緒林(賀小賢，姜緒沐黑曲霉p-葡聚糖酶產(chǎn)酶培養(yǎng)基的研究.食品工業(yè)科技，2003,24(12):21-23.)在應(yīng)用黑曲霉(A/^g/〃Mw/gw)生產(chǎn)內(nèi)切-P-l,4-葡聚糖酶時，對產(chǎn)酶培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，最終確定大麥粉為最佳碳源，酵母粉和硫酸銨為最適氮源；最適濃度分別為大麥粉3%，酵母粉2%，硫酸銨0.2%。以此培養(yǎng)基進行發(fā)酵產(chǎn)酶，(3-葡聚糖酶活達到78U，mL—1。研究還發(fā)現(xiàn)，添加卩-葡聚糖和吐溫80對(3-葡聚糖酶的產(chǎn)生有一定的促進作用。鄭毅等(鄭毅，陳接鋒，馬石金，等.黑曲霉FS25產(chǎn)P-葡聚糖酶發(fā)酵特性的研究.微生物學(xué)通報,，2001,28(4):47-50.)在研究黑曲霉FS25搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)P-l，3-l，4-葡聚糖酶時，對碳源、氮源、培養(yǎng)基初始pH、溫度、搖瓶裝液量、接種量及培養(yǎng)時間進行了優(yōu)化，確定最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成及產(chǎn)酶條件為大麥粉6g/L、玉米漿2g/L、(NH4)2SO40.4g/L、培養(yǎng)基初始pH5.0、培養(yǎng)溫度32°C、250mL三角瓶裝液量50mL、接種量3%(Wv)、培養(yǎng)時間30h;在此條件下發(fā)酵P-葡聚糖酶活達80.1U.mL"。Beshay等(BeshayUsama，El-EnshasyHesham,IsmailI.M.K.P國隱glucanaseproductionfromgeneticallymodifiedrecombinant五sc/zer/c/z/aco//.,effectofgrowthsubstrateanddevelopmentofaculturemediuminshakeflasksandstirredtankbioreactor.ProcessBiochem.,2003，39:307-313.)分別采用搖瓶和發(fā)酵罐培養(yǎng)重組BL21，用于生產(chǎn)來源于芽孢桿菌的雜合P-l,3-葡聚糖酶。通過搖瓶培養(yǎng)，確定酶合成的最佳碳源為乳糖，濃度7g七"；最佳氮源為酵母粉，濃度24g七"；NaCl濃度為5g七—、在此條件下?lián)u瓶發(fā)酵最高酶活達512U-mL'1。采用3升發(fā)酵罐進行分批培養(yǎng)，通氣量1.0L/(Lmin)，攪拌轉(zhuǎn)速800r/min，接種量10%(v/v)，pH7.0，培養(yǎng)15h后，酶活達到526U'rnU1。郝秋娟(郝秋娟，陳穎，李永仙等.溫度對淀粉液化芽孢桿菌5582產(chǎn)e-葡聚糖酶的影響，中國釀造，2007,3:1-4)為進一步提高淀粉液化芽孢桿菌(5ad//^flm_y/o/;Xade")BS5582產(chǎn)e-葡聚糖酶的水平，在5L發(fā)酵罐上，采用分階段控溫液體發(fā)酵工藝，通氣量1.0L/(L，min)，攪拌轉(zhuǎn)速500r/min，初始發(fā)酵溫度36。C，培養(yǎng)27h(穩(wěn)定期)后，降溫至32'C至發(fā)酵終了，e-葡聚糖酶酶活達到182.52U/mL，比恒溫發(fā)酵提高了28%。此外，林宇野(林宇野.絲狀真菌產(chǎn)生P-葡聚糖酶的研究I.GCN平板的建立及產(chǎn)酶菌株的選育.福建師范大學(xué)學(xué)報，1995,11(3):94-101.)，孫玉英等(孫玉英，王瑞明，關(guān)鳳梅，等.局限曲霉產(chǎn)P-葡聚糖酶發(fā)酵特性的研究[J].釀酒科技,2003,118(4):36-37)，石家驥和崔福綿(石家驥，崔福綿.產(chǎn)卩-葡聚糖酶菌種T199的選育及發(fā)酵條件.微生物學(xué)報，2001，41(6):750-752.)，Hong和Meng(HongT.Y.&MengM.Biochemicalcharacterizationandantifongalactivityofanendo-P-1,3-glucanaseof尸aem'6""7/wssp.isolatedfromgardenoil.Appl.Microbiol.Biotechnol.,2003,61:472-478.)，Burtseva(BurtsevaYu.V.，VeriginaN.S.,SovaV*V"etal.0-GlycosylhydrolasesofmarinefilamentousfUngi:P國l,3隱glucanasesof7h'c/w^廳做z-evzWfife.Appl.Biochem.Microbiol"2003,39(5):475-481.)以及Wase(WaseD.A丄,VaidA.K.&McDermottC.Increaseinendo-l,4-|3-D-glucanasetitresproducedby爿，"gz7/w51/謂/gatothroughapplicationofsimplestatisticalmethods.EnzymeMicrob.Technol.,1985，7:134-138.)等都對間歇發(fā)酵生產(chǎn)P-葡聚糖酶進行了研究。然而間歇發(fā)酵過程也有明顯的局限性首先，要達到比較高的培養(yǎng)密度或較高產(chǎn)物量，就必須加入較高濃度的營養(yǎng)物質(zhì)，但高濃度的營養(yǎng)物又會對微生物的生長產(chǎn)生抑制；其次，營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗與副產(chǎn)物的積累同樣限制細胞的持續(xù)生長和蛋白表達。而液體流加發(fā)酵則可以在一定程度上改善間歇發(fā)酵的弊端，如可通過流加底物使發(fā)酵體系中始終維持很低的基質(zhì)濃度，這樣不僅能解除底物抑制，而且通過維持底物濃度在一定的水平保證菌株的持續(xù)生長和產(chǎn)物的連續(xù)合成。流加發(fā)酵技術(shù)雖然已經(jīng)成功用于維生素、氨基酸以及各種酶的生產(chǎn)，但在p-葡聚糖酶的發(fā)酵生產(chǎn)中卻鮮有報道。隨著生物技術(shù)的高速發(fā)展，(3-葡聚糖酶的研究取得極大進展，在各應(yīng)用領(lǐng)域的重要性已充分顯現(xiàn)，如何得到活性高且應(yīng)用效果好的p-葡聚糖酶已成為亟待解決的問題。利用克隆重組技術(shù)構(gòu)建高通量表達(3-葡聚糖酶的菌株，并進行產(chǎn)酶條件的研究，具有重要的現(xiàn)實意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對p-葡聚糖酶的生產(chǎn)中存在的問題，提供一種具有較高活性，適于工業(yè)化生產(chǎn)的從重組大腸桿菌XM-LU制備內(nèi)切-p-l，3-l，4-葡聚糖酶的方法。本發(fā)明所述的重組大腸桿菌XM-LU是大腸埃希氏菌(&c&n'cWaco/z')，已于2007年11月5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏中心登記入冊編號為CGMCCNo.2246。本發(fā)明的具體操作步驟如下1)液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成甘油812g.L—、玉米漿915g'L—、NaNO3610g'L—、NaCl10g'L—、KH2P042.4g-L—、K2HP0412.5g'L—、卡那霉素0.05g.L_1，其余為水；2)流加發(fā)酵工藝液體發(fā)酵條件為通氣量0.81.5L/(L'min)，攪拌速率350450r/min，發(fā)酵溫度37°C，自第1016h起開始勻速持續(xù)流加甘油原液820h。以812g，L—1甘油為碳源時能合成具有較高活性的內(nèi)切+1，3-1,4-葡聚糖酶。按質(zhì)量比，將玉米漿和硝酸鈉以3:2復(fù)配作為液體發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源時能合成具有較高活性的內(nèi)切+1，3-1,4-葡聚糖酶。流加發(fā)酵工藝的發(fā)酵罐可采用10L發(fā)酵罐，液體發(fā)酵培養(yǎng)基最好為6L。通氣量最好為1L/(L*min)，攪拌速率最好為400r/min，流加甘油原液的速率可為1.042.00mL/min。本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基和液體發(fā)酵工藝能有效提高重組大腸桿菌XM-LU(大腸埃希氏菌E^/m'c^"co/Z)的生物量和內(nèi)切-P-l，3-l,4-葡聚糖酶活性，適合于重組基因高效穩(wěn)定地表達。用本發(fā)明所述的培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝進行發(fā)酵，重組大腸桿菌XM-LU菌體濃度可達3.84g/L，內(nèi)切-P-l,3-l,4-葡聚糖酶活性達到679.29U/mL，這是目前報道的內(nèi)切-&1,3-1，4-葡聚糖酶的最高產(chǎn)量。本發(fā)明用于發(fā)酵基因工程產(chǎn)物P-葡聚糖酶，能有效提高產(chǎn)品產(chǎn)量，大大降低成本。圖1為本發(fā)明實施例恒速流加甘油發(fā)酵過程菌體生長與p-葡聚糖酶合成曲線。在圖1中，橫坐標為培養(yǎng)時間(h)，左縱坐標為甘油濃度(g/L)，右縱坐標為胞外(5-葡聚糖酶活力(U/mL)和細胞干重(g/L)。^一胞外p-葡聚糖酶活力；B—甘油濃度；參一細胞干重；；一甘油開始流加。具體實施方式以下實施例將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的說明，以便為更好地理解本發(fā)明提供依據(jù)。實施例1:分別選取不同的碳源，考察不同濃度的碳源對菌體生長和P-葡聚糖酶合成的影響。間歇培養(yǎng)條件通氣量1L/(Lmin)，攪拌速率400r/min，發(fā)酵溫度37'C。培養(yǎng)基中其他組分酵母粉24g.L—、NaCllOg.L—人KH2P042.4g-L—、K2HP0412.5g.L一1，卡那霉素0.05g七—1，其余為水。結(jié)果如表l所示。結(jié)果表明，以蔗糖和葡萄糖為碳源時，酶活力均較低，并且隨著添加濃度的增加進一步降低。而以小麥粉為碳源時產(chǎn)酶效果最好，大麥粉和甘油次之。但由于小麥粉中絕大部分成分不溶于水，發(fā)酵結(jié)束后很難將細胞從其中分離出來，因此會對菌體和酶的后處理過程造成一定的影響。表l碳源對菌體生長及產(chǎn)酶的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例2:分別以甘油(10g丄—4和小麥粉(50g七—1)為碳源，在實施例l所述間歇培養(yǎng)條件下，考察不同氮源對細胞生長和(3-葡聚糖酶合成的影響。培養(yǎng)基中除碳氮源以外的其他組分NaC110g.L一1、KH2P042.4g'L_1、K2HP0412.5g'L—、卡那霉素0.05g'L—、其余為水。結(jié)果如表2所示。表2氮源對菌體生長及產(chǎn)酶的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>結(jié)果表明，以無機氮為唯一氮源時生物量很低，因而限制了酶的合成；而以酵母粉和玉米漿為有機氮源與甘油復(fù)配時，酶活性有顯著提高。實施例3:以甘油(10g七—"為碳源，如實施例1所述間歇培養(yǎng)條件，考察有機和無機氮源復(fù)配對細胞生長和P-葡聚糖酶合成的影響。培養(yǎng)基中除碳氮源以外的其他成分如實施例2。結(jié)果如表3所示。表3有機、無機氮組合對菌體生長及產(chǎn)酶的影響氮源種類添加量(％)生物量(g'L—"(3-葡聚糖酶活力(U'mL一1)酵母粉、NaN03酵母粉、NH4N03酵母粉、(NH4)2S04酵母粉、尿素玉米漿、NaN03玉米漿、NH4N03玉米漿、(NH4)2S04玉米漿、尿素2.40、1.201.00102.201.20、0.720.86297.712.40、1.202.8580.271.20、0.340.98195.092.40、1.22.74114.001.20、0.561.22150.052.40、1.202.3347.091.20、0.2550.77109.112.40、1.203.84306.511.2、0.722.57286.542.40、1.203.68166.001.20、0.341.68110.522.40、1.203.10168.171.20、0.562.05141.472.40、1.204.30120.761.20、0.2553.34131.35由表3可見，酵母粉和玉米漿與無機氮源復(fù)配都能促進酶的合成，尤其是酵母粉和NaN03(1.20:0.72)復(fù)配時，酶活達到近300U/mL，玉米漿與NaN03(2.4:1.2)復(fù)配時，酶活達306.51U/mL。但玉米漿對菌體生長的刺激作用更加明顯，在各種不同的復(fù)配濃度下，生物量普遍高于酵母粉和無機氮源的復(fù)配效果。考慮到生物量和培養(yǎng)基的制作成本，選擇玉米漿和NaN03復(fù)配作為P-葡聚糖酶合成培養(yǎng)基的氮源。實施例4:以甘油10g.L—!、NaN0310g.L—、NaCl10g.L—、KH2P042.4g七—、K2HP0412.5g七—M乍為發(fā)酵培養(yǎng)基成分，如實施例1所述間歇培養(yǎng)條件，考察不同玉米漿濃度對菌體生長和產(chǎn)酶的影響。結(jié)果如表4所示。表4玉米漿濃度對菌體生長和產(chǎn)酶的影響玉米漿(g丄一1)生物量(g七一1)P-葡聚糖酶活力(U'mIT183.95430.7163.78482.01593.283.22498.2466.8可見，玉米漿最佳濃度為15g/L，此時P-葡聚糖酶活力達到498.2U'mIT1，細胞密度達3.28g/L。實施例5:采用如實施例4所述發(fā)酵條件，考察玉米漿和硝酸鈉不同配比對菌體生長和產(chǎn)酶的影響。其區(qū)別在于發(fā)酵培養(yǎng)基中玉米漿9g七—、NaN036g丄一1。實施例6:采用如實施例4所述發(fā)酵條件，考察玉米漿和硝酸鈉不同配比對菌體生長和產(chǎn)酶的影響。其區(qū)別在于發(fā)酵培養(yǎng)基中玉米漿12g七—、NaN038g七一1。實施例7:采用如實施例4所述發(fā)酵條件，考察甘油濃度對菌體生長和產(chǎn)酶的影響。其區(qū)別在于甘油濃度8g七—、玉米漿12g'L—、NaN038g七一1。實施例8:采用如實施例4所述發(fā)酵條件，考察甘油濃度對菌體生長和產(chǎn)酶的影響。其區(qū)別在于甘油濃度12g.L-、玉米漿15g-L-、畫0310g.L-'。實施例9:在上述優(yōu)化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，進行(3-葡聚糖酶的流加發(fā)酵。在10L發(fā)酵罐上，培養(yǎng)自第12h起，持續(xù)勻速流加甘油8h，流加速率為1.04mL/min。結(jié)果如圖1所示。由圖1可見，在上述流加發(fā)酵條件下，細胞干重由間歇發(fā)酵的3.28g/L增加到3.84g/L，(3-葡聚糖酶活性由間歇發(fā)酵的498.2U/mL提高到679.29U/mL，表明流加甘油對于細胞生長和產(chǎn)酶都有較大幅度的提高，流加效果顯著。實施例10:采用實施例9所述發(fā)酵條件，進行P-葡聚糖酶的流加發(fā)酵。其區(qū)別在于，培養(yǎng)自第10h起，持續(xù)勻速流加甘油8h，流加速率為2mL/min。實施例lh釆用實施例9所述發(fā)酵條件，進行P-葡聚糖酶的流加發(fā)酵。其區(qū)別在于，培養(yǎng)自第16h起，持續(xù)勻速流加甘油20h，流加速率為2mL/min。權(quán)利要求1.從重組大腸桿菌XM-LU制備內(nèi)切-β-1，3-1，4-葡聚糖酶的方法，其特征在于所述的重組大腸桿菌XM-LU是大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)，已于2007年11月5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號為CGMCCNo.2246，具體操作步驟如下1)液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成甘油8～12g·L-1、玉米漿9～15g·L-1、NaNO36～10g·L-1、NaCl10g·L-1、KH2PO42.4g·L-1、K2HPO412.5g·L-1，卡那霉素0.05g·L-1，其余為水；2)流加發(fā)酵工藝液體發(fā)酵條件為通氣量0.8～1.5L/L·min，攪拌速率350～450r/min，發(fā)酵溫度37℃，自第10～16h起開始勻速持續(xù)流加甘油原液8～20h。2.如權(quán)利要求l所述的從重組大腸桿菌XM-LU制備內(nèi)切-p-l，3-l,4-葡聚糖酶的方法，其特征在于按質(zhì)量比，玉米漿硝酸鈉為3:2。3.如權(quán)利要求l所述的從重組大腸桿菌XM-LU制備內(nèi)切-p-l,3-l,4-葡聚糖酶的方法，其特征在于液體發(fā)酵培養(yǎng)基為6L。4.如權(quán)利要求l所述的從重組大腸桿菌XM-LU制備內(nèi)切-P-l，3-l,4-葡聚糖酶的方法，其特征在于發(fā)酵的發(fā)酵罐為10L發(fā)酵罐。5.如權(quán)利要求l所述的從重組大腸桿菌XM-LU制備內(nèi)切-P-l,3-l,4-葡聚糖酶的方法，其特征在于通氣量為1L/Lmin。6.如權(quán)利要求l所述的從重組大腸桿菌XM-LU制備內(nèi)切-p-l，3-l，4-葡聚糖酶的方法，其特征在于攪拌速率為400r/min。7.如權(quán)利要求l所述的從重組大腸桿菌XM-LU制備內(nèi)切-p-l,3-l,4-葡聚糖酶的方法，其特征在于流加甘油原液的速率為1.042.00mL/min。全文摘要從重組大腸桿菌XM-LU制備內(nèi)切-β-1，3-1，4-葡聚糖酶的方法，涉及一種細菌培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝。提供一種具有較高活性，適于工業(yè)化生產(chǎn)的從重組大腸桿菌XM-LU制備內(nèi)切-β-1，3-1，4-葡聚糖酶的方法。重組大腸桿菌XM-LU是大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)，發(fā)酵培養(yǎng)基甘油8～12g·L^-1、玉米漿9～15g·L^-1、NaNO₃6～10g·L^-1、NaCl10g·L^-1、KH₂PO₄2.4g·L^-1、K₂HPO₄12.5g·L^-1，卡那霉素0.05g·L^-1，余為水；液體發(fā)酵條件為通氣量0.8～1.5L/(L·min)，自第10～16h起持續(xù)流加甘油原液8～20h。文檔編號C12R1/19GK101235366SQ20081007068公開日2008年8月6日申請日期2008年2月29日優(yōu)先權(quán)日2008年2月29日發(fā)明者寧何,盧英華,敬科舉,李清彪,王明軒,程志敬,旭鄧申請人:廈門大學(xué)