專利名稱：基于絕緣體上硅結(jié)構(gòu)的連續(xù)流細胞電融合芯片及其加工工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物細胞電融合的裝置。具體地，本發(fā)明涉及提供細胞電融合的芯片，提供 并產(chǎn)生細胞排隊、電致穿孔、融合所需要的電場強度和電場梯度，涉及細胞電融合中細胞的 精確控制、細胞的高效融合，適用于遺傳學(xué)、動植物遠緣雜交育種、發(fā)育生物學(xué)、藥物篩選、 單克隆抗體制備、哺乳動物克隆等領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
生物細胞通過融合可以形成新的細胞，在現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)工程基礎(chǔ)領(lǐng)域有著重要的意義。 細胞融合技術(shù)經(jīng)歷了生物、化學(xué)和物理誘導(dǎo)等幾個發(fā)展階段。到了20世紀(jì)80年代，隨著電 子信息技術(shù)的發(fā)展，細胞電融合技術(shù)得到了迅速發(fā)展，相對于傳統(tǒng)的細胞電融合手段，該方 法具有效率較高，操作簡便、對細胞無毒害，便于觀察，適于儀器應(yīng)用和規(guī)范操作等優(yōu)點， 該技術(shù)近年來也得到了廣泛的應(yīng)用。
生物細胞處于非均勻電場中時，被電場激化形成偶極子，該偶極子在非均勻電場作用力 下發(fā)生運動，即介電電泳(dielectrophoresis)，利用電介質(zhì)電泳可以控制細胞的運動，在細 胞電融合過程中，利用電介質(zhì)電泳現(xiàn)象使細胞排列成串，壓緊相互接觸的細胞，完成細胞電 融合過程所需的排隊和融合后壓緊。
細胞在強電場作用下，會導(dǎo)致細胞膜穿孔，這種效應(yīng)稱為細胞膜電致穿孔效應(yīng) (electroporation)。在細胞電融合過程中利用電致穿孔效應(yīng)，使兩接觸的細胞膜穿孔，細胞 間進行膜內(nèi)物質(zhì)交換，使細胞質(zhì)、膜融合，在一定強度的電場作用下的電穿孔是一種可逆穿 孔，細胞膜會在減小或撤銷電場強度時回復(fù)原狀，致使細胞電融合過程的膜融合。
傳統(tǒng)的細胞電融合儀，它多采用融合槽的方式進行融合，電極間的間距較大，要達到足 夠強度的細胞排隊、融合及壓緊信號，需要很高的外界驅(qū)動電壓，往往高達幾百上千伏，對 系統(tǒng)的電氣安全性要求高，系統(tǒng)的成本也因此而大為提高。
為解決這一問題，促進細胞電融合技術(shù)向集成化、便攜式等方向發(fā)展，根據(jù)經(jīng)典物理方 程￡= %/，可知在外界電壓r恒定的情況下通過縮短電極的間距即J的大小以得到更高的電 場強度E。在細胞電融合的芯片結(jié)構(gòu)的設(shè)計中，相對微電極之間的距離僅為100pm，僅需要 1()G或10i級的外界電壓即可實現(xiàn)細胞融合，大大降低了外圍電路的設(shè)計、制造難度，降低了 系統(tǒng)成本，提高了系統(tǒng)的電氣安全性和細胞電融合后細胞的成活率，可以促進細胞電融合技
術(shù)向集成化、便攜式等方向發(fā)展。同時，傳統(tǒng)的平行板電極在兩電極板間產(chǎn)生的是均勻電場， 不利于獲得較高的電場梯度，故在本發(fā)明中，基于絕緣體上硅結(jié)構(gòu)的連續(xù)流細胞電融合芯片 選用了三種微電極排布方式對稱型、交錯型和電極一平板型。
目前國內(nèi)在基于絕緣體上硅結(jié)構(gòu)的連續(xù)流細胞電融合芯片研究開發(fā)較少，國外在次領(lǐng)域
的專利相對較多。如Pohl在1982年申請的美國專利(4326934)、 Chang在1994年的美國專 利(5304486)等。但上述專利存在集成微電極數(shù)目較少，無法實現(xiàn)高通量融合，另一方面， 微電極產(chǎn)生的電場強度和電場梯度比較弱，在細胞的精確控制方面顯得比較弱。中國專利 200610054121.x是基于芯片概念的細胞融合裝置，但芯片在設(shè)計中對于芯片的抗腐蝕、抗氧 化能力考慮較少，存在易被腐蝕、氧化的缺點，同時，該芯片無法實現(xiàn)樣品的自動進樣和出 樣，不利于融合后細胞的篩選和培養(yǎng)。本發(fā)明能夠較好的解決以上為題。
國內(nèi)外相關(guān)專利如下
200810069511.3， 2008年，重慶大學(xué)；
200710092892.2， 2007年，重慶大學(xué)；
200610054121.x， 2006年，重慶大學(xué)；
CN1482234， 2003年，中國科學(xué)院上海技術(shù)物理研究所，張濤等；
CN86210174， 1995年，遼寧腫瘤研究所，梁偉；
4326934， April 27， 1982， Pohl;
441972， April 10， 1982， Pohl;
4578168， March 25,1986,Hofman;
4695547，September22，1987,HiUard;
4699881,Oct. 13,1987,Matschke et. al;
5007995,Apr. 16,1991 ，Takahizuki.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于絕緣體上硅結(jié)構(gòu)的連續(xù)流細 胞電融合芯片，利用絕緣體上硅(SOI)材料"襯底層一絕緣層一低阻硅層"的特性，形成 微電極陣列芯片，獲得足夠強度的梯度電場，提高細胞排隊、融合能力，改善細胞電融合的 效果，芯片上集成了超過103以上的微電極對，配合流路控制裝置，可以實驗連續(xù)流的細胞
電融合，可以得到高量的融合后細胞，以進行后期的篩選和培養(yǎng)，提高細胞電融合效率，并
且該芯片具備清洗后再次使用的功能，降低成本，提高可用性。 本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種基于絕緣體上硅結(jié)構(gòu)的連續(xù)流細胞電融合芯片，它由外殼、固定于外殼內(nèi)的微電極 陣列芯片、連通外殼內(nèi)外的進出樣導(dǎo)管和封裝在外殼表面的硅玻璃片組成；外殼、導(dǎo)管采用 不銹鋼等材料加工制成，采用整體絕緣工藝進行了絕緣處理。所述微電極陣列芯片采用絕緣 體上硅材料，從下至上依次由硅質(zhì)基底層、二氧化硅絕緣層、低阻硅電極層和二氧化硅保護 膜構(gòu)成，采用微加工技術(shù)在低阻硅電極層上刻蝕凹槽至二氧化硅絕緣層形成微電極陣列結(jié)構(gòu)， 微電極陣列結(jié)構(gòu)與上下的硅玻璃片和二氧化硅絕緣層組成了微通道，所述微通道為直線型， 在芯片上可以集成至少兩條，電極的尺度及電極間的間距可以根據(jù)試驗對象的不同進行調(diào)整。 微通道兩端的進樣口和出樣口與導(dǎo)管相連，可開展細胞的連續(xù)流電融合，陣列化的微電極和 連續(xù)流電融合可達到細胞的大量融合、提高細胞的融合效率的目的。微電極陣列經(jīng)金屬引線 與外殼底部對應(yīng)引腳相連，微電極之間的直線型微通道為工作通道。
所述微電極陣列分布于直線型微通道兩側(cè)，微電極排布方式分為對稱型，即齒狀微電極 呈現(xiàn)水平對稱的排布方式，或者交錯型，即齒狀微電極呈現(xiàn)交錯對稱的排布方式排除，或者 平板一電極型，即一邊梳齒上為齒狀微電極， 一邊梳齒上為平板電極的排隊方式。
考慮到生物細胞的典型尺寸在l~5(Vm，芯片中的微通道深度設(shè)定在50nm，寬度設(shè)定在 50~100,。
芯片采用標(biāo)準(zhǔn)外殼封裝結(jié)構(gòu)，加工完成的絕緣體上硅芯片置于外殼底部，通過黏合劑進 行固定，然后通過鍵合技術(shù)用金絲將芯片電極與外殼底部引腳相連，將導(dǎo)管插入進樣口和出 樣口，最后用硅玻璃片將微電極陣列芯封裝在外殼內(nèi)，形成密閉的微通道。通過采用外殼上 的過孔和管道進行進樣與出樣，保證樣品液的自動化、無菌化操作。
基于絕緣體上硅結(jié)構(gòu)的連續(xù)流細胞電融合芯片采用傳統(tǒng)集成電路(IC)加工工藝和 MEMS加工工藝相結(jié)合的方式，選用絕緣體上硅片作為加工材料，刻蝕出微電極陣列結(jié)構(gòu)， 絕緣體上硅結(jié)構(gòu)中的頂層低阻硅采用了深度推結(jié)工藝，改善了微電極在縱/橫向電壓分布的均 勻性，并濺射硅鋁(Si-Al)形成引線層，提高了芯片的電氣性能，同時，采用等離子增強化 學(xué)氣相淀法(PECVD)工藝實現(xiàn)二氧化硅(Si02)對芯片的整體鈍化，提高了芯片的抗氧化、 抗腐蝕性能，也在一定程度上提高了芯片的生物相容性，提高了細胞的活性，進而間接提高 了細胞融合效率；
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較，其技術(shù)優(yōu)點在如下
1、 它利用絕緣體上硅材料"襯底層一絕緣層一低阻硅層"的結(jié)構(gòu)特性，在低阻硅層使 用MEMS加工工藝刻蝕出微凹槽結(jié)構(gòu)，形成我們所需要的基于絕緣體上硅結(jié)構(gòu)的連續(xù)流細 胞電融合芯片，該芯片由多尺度、多類型的直線型細胞電融合微通道組成，其內(nèi)部包含微電 極陣列，并籍此與上下的硅玻璃片和二氧化硅絕緣層形成微通道；外界電信號借助微通道的 微尺度和排布，可以在其內(nèi)部形成足夠強度的梯度電場，實現(xiàn)細胞電融合過程，提高細胞電 融合效率；該芯片具備清洗后再次使用的功能，降低了成本，提高了可用性。
2、 以MEMS技術(shù)制造微通道，縮短電極間的相互距離，在低電壓驅(qū)動條件下獲得細胞 融合需要的電場強度；低的外載荷條件為實驗操作人員及待融合細胞提供了安全保證；表面 硅玻璃濺合微可視化觀察提供了有效途徑；在進行細胞基于細胞介電電泳效應(yīng)的細胞排隊及 細胞電融合實驗中效率會更高；該芯片節(jié)電、高效，對環(huán)境要求低，應(yīng)用范圍廣。
3、 該芯片可以實現(xiàn)連續(xù)流的細胞電融合，借助陣列化的微電極和連續(xù)流電融合可達到 細胞的大量融合、提高細胞的融合效率的目的。


圖1基于絕緣體上硅結(jié)構(gòu)的連續(xù)流細胞電融合芯片示意圖2基于絕緣體上硅結(jié)構(gòu)的連續(xù)流細胞電融合芯片裝配示意圖3外殼示意圖4微電極陣列芯片示意圖5微電極排布方式示意圖。
具體實施例方式
參見圖1和圖2，本細胞電融合芯片由外殼2、固定于外殼內(nèi)微電極陣列芯片3、連通外 殼內(nèi)外的進出樣導(dǎo)管1和封裝在外殼表面的硅玻璃片4組成。
外殼的結(jié)構(gòu)參見圖3，圖3A是外殼的立體圖。圖3B是外殼的俯視圖，圖3C是外殼的 右視圖，圖3D是外殼的正視圖，外殼2的中心為容納芯片的內(nèi)腔5，底部有與芯片的微電極 陣列對應(yīng)的引腳9，兩側(cè)壁有進樣口 7和出樣口 8，并在外殼2外側(cè)設(shè)置一圓柱體6，方便整 個裝置的移取。
微電極陣列芯片的結(jié)構(gòu)參見圖4A、圖4B和圖4C，所述微電極陣列芯片采用絕緣體上 硅結(jié)構(gòu)材料，從下至上依次由硅質(zhì)基底層14、 二氧化硅絕緣層15、低阻硅電極層16和二氧
化硅保護膜17構(gòu)成，采用微加工技術(shù)在低阻硅電極層16上刻蝕凹槽至二氧化硅絕緣層15 形成微電極陣列12，微電極陣列12與上下的硅玻璃片5和二氧化硅絕緣層15組成了微通道 13，所述微通道13為直線型，在芯片上可以集成至少兩條，電極的尺度及電極間的間距可以 根據(jù)試驗對象的不同進行調(diào)整。微電極陣列經(jīng)金屬引線與外殼底部對應(yīng)引腳9相連，微電極 之間的直線型微通道為工作通道。該芯片上構(gòu)造的直線型微通道有助于細胞懸浮液的流動， 盡可能低的降低細胞在流動過程中的黏附，可通過微通道兩端的進樣口 7和出樣口 8中的進 出樣導(dǎo)管1，開展連續(xù)流的細胞電融合實驗，陣列化的微電極和連續(xù)流電融合可達到細胞的 大量融合、提高細胞的融合效率的目的，可為后期的篩選、培養(yǎng)提供無限量的融合后細胞。 微電極陣列芯片3分別設(shè)置了矩形孔10和11，矩形孔10便于微電極陣列12和引腳9進行 電氣連接，微電極陣列芯片3上的矩形孔11便于經(jīng)進樣口 7插入的進出樣導(dǎo)管1與微通道 13間的無縫連接。
圖5顯示的是微電極陣列和微通道的局部，微電極分布于微電極陣列上，相對微電極陣 列上微電極排布方式分為對稱型(見圖5A)，即齒狀微電極18呈現(xiàn)水平對稱的排布方式， 或者平板一電極型(見圖5B)，即一邊梳齒上為齒狀微電極18， 一邊梳齒上為平板電極的排 隊方式，或者交錯型(見圖5C)，即齒狀微電極18呈現(xiàn)交錯對稱的排布方式排布。
如圖l、圖3、圖4、圖5所示，外部流體控制裝置將含有待融合細胞的緩沖液經(jīng)進樣口 7中的進出樣導(dǎo)管1引到微通道13中，考慮到細胞的典型尺寸在l-50pm，微電極的深度為 50pm，寬度為50-100pm依次遞增，以適應(yīng)不同的尺寸的細胞進行融合，進樣的速度、進樣 量由外部裝置控制，進樣口 7和出樣口 8的直徑為1000薩，進出樣導(dǎo)管1的尺寸為內(nèi)徑 800pm，外徑1000pm，以充分保證細胞能夠順利的進入通道內(nèi)部；待細胞進入微通道13后， 由微電極陣列12上的微電極施加外界電刺激信號(外界電刺激信號由引腳9經(jīng)金屬引線引 入，分別為交流正弦信號和直流脈沖信號)，細胞在交流正弦信號作用下，附著在電極上， 在直流脈沖信號作用下發(fā)生細胞電融合；完成融和后的細胞在芯片中靜置5-10min后，在外 界推動力下經(jīng)出樣孔8中的進出樣導(dǎo)管1流出，由外部裝置收集進行后期培養(yǎng)等工作。
圖4中，采用絕緣體上硅結(jié)構(gòu)材料制作的微電極陣列芯片的硅質(zhì)基底層14尺寸為 1.2cmx2.4cm，厚度控制在500nm，為芯片提供足夠輕度的支撐；二氧化硅絕緣層15尺寸為 1.2cmx2.4cm，厚度控制在lOpm,保證芯片不怕高強度的靜電擊穿，保障芯片的電氣穩(wěn)定性； 低阻硅電極層16尺寸為1.2cmx2.4cm，厚度控制在50pm，即融合通道的深度，低阻硅內(nèi)應(yīng) 力很小、機械性能好，低電阻率改善芯片電氣性能，提高融合效率；在低阻硅電極層16由等
離子增強化學(xué)氣相沉淀法(PECVD)工藝實現(xiàn)二氧化硅保護膜17，提高芯片的抗氧化能力、
生物相容性。
上述基于絕緣體上硅結(jié)構(gòu)的連續(xù)流細胞電融合芯片的加工工藝為
(1) 選取頂層硅有50pm厚的絕緣體上硅結(jié)構(gòu)材料；
(2) 隔離擴善，完成頂層低阻硅深度推結(jié)；
(3) 頂層低阻硅氧化，氧化層厚度為550 600nrn;
(4) 光刻二氧化硅；
(5) 濺射硅鋁Si-Al形成引線層，弓l線層厚度為2i0.2pm;
(6) 光刻引線；
(7) 合金；
(8) 等離子增強化學(xué)氣相沉淀PECVD工藝實現(xiàn)二氧化硅絕緣鈍化，二氧化硅鈍化 層厚度為1.5±0.2pm;
(9) 光刻；
(10) 干法腐蝕二氧化硅；
(11) 干法腐蝕硅，深度為50pun，直至絕緣層，以讓各交叉梳狀電極電器結(jié)構(gòu)上互 不相連，并形成微通道；
(12) 干法去膠；
加工完成的微電極陣列芯片置于外殼底部，通過黏合劑進行固定，然后通過鍵合技術(shù)用 金絲將芯片上各微電極陣列與外殼底部對應(yīng)引腳相連，將導(dǎo)管插入進樣口和出樣口，最后用 硅玻璃片將微電極陣列芯封裝在外殼內(nèi)，形成密閉的微通道。
權(quán)利要求
1.一種基于絕緣體上硅結(jié)構(gòu)的連續(xù)流細胞電融合芯片，其特征在于它由外殼、固定于外殼內(nèi)的微電極陣列芯片、連通外殼內(nèi)外的進出樣導(dǎo)管和封裝在外殼表面的硅玻璃片組成；所述微電極陣列芯片采用絕緣體上硅材料，從下至上依次由硅質(zhì)基底層、二氧化硅絕緣層、低阻硅電極層和二氧化硅保護膜構(gòu)成，采用微加工技術(shù)在低阻硅電極層上刻蝕凹槽至二氧化硅絕緣層形成微電極陣列結(jié)構(gòu)，微電極陣列結(jié)構(gòu)與上下的硅玻璃片和二氧化硅絕緣層組成了微通道，所述微通道為直線型，在芯片上集成至少兩條，微通道兩端的進樣口和出樣口與導(dǎo)管相連，開展細胞的連續(xù)流電融合，微電極陣列結(jié)構(gòu)經(jīng)引線與外殼底部對應(yīng)引腳相連，微電極之間的直線型微通道為工作通道。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于絕緣體上硅結(jié)構(gòu)的連續(xù)流細胞電融合芯片，其特征在于所 述微電極陣列結(jié)構(gòu)的微電極排布方式分為對稱型，即齒狀微電極呈現(xiàn)水平對稱的排布方 式；或者交錯型，即齒狀微電極呈現(xiàn)交錯對稱的排布方式排布，或者平板一電極型，即 一邊梳齒上為齒狀微電極， 一邊梳齒上為平板電極的排隊方式。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于絕緣體上硅結(jié)構(gòu)的連續(xù)流細胞電融合芯片，其特征在于 所述細胞電融合芯片的微通道深度設(shè)定在50pm。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于絕緣體上硅結(jié)構(gòu)的連續(xù)流細胞電融合芯片，其特征在于齒 狀微電極長度為20nm,寬度為2(Him，相對微電極之間的間距設(shè)定在50 10(Him，直線型 微通道一側(cè)的相鄰齒狀微電極間距設(shè)定在20 100Mm。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于絕緣體上硅結(jié)構(gòu)的連續(xù)流細胞電融合芯片，其特征在于 所述微電極陣列引線為金絲，通過鍵合使微電極陣列與外殼底部對應(yīng)引腳相連。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于絕緣體上硅結(jié)構(gòu)的連續(xù)流細胞電融合芯片，其特征在于 所述芯片的外殼、導(dǎo)管采用不銹鋼加工制成，表面絕緣處理。
7. 權(quán)利要求1或2所述的基于絕緣體上硅結(jié)構(gòu)的連續(xù)流細胞電融合芯片的加工工藝，其特征在于(1)加工微電極陣列芯片所述微電極陣列芯片采用傳統(tǒng)集成電路IC加工工藝和 MEMS加工工藝相結(jié)合的方式，選用絕緣體上硅硅片作為加工材料，加工步驟如下A、 選取頂層硅有50^im厚的絕緣體上硅結(jié)構(gòu)材料；B、 隔離擴善，完成頂層低阻硅深度推結(jié)；C、 頂層低阻硅氧化，氧化層厚度為550 600nrn; D、 光刻二氧化硅；E、 濺射硅鋁Si-Al形成引線層，弓l線層厚度為2士0.2nm;F、 光刻引線；G、 合金；H、 等離子增強化學(xué)氣相沉淀PECVD工藝實現(xiàn)二氧化硅絕緣鈍化，二氧化硅鈍化層 厚度為L5士0.2^im;I、 光刻；J、干法腐蝕二氧化硅；K、干法腐蝕硅，深度為50pm，直至絕緣層，以讓各交叉梳狀電極電器結(jié)構(gòu)上互不 相連，并形成微通道； L、干法去膠；(2)將加工完成的微電極陣列芯片置于外殼底部，通過黏合劑進行固定，然后通過鍵 合技術(shù)用金絲將芯片上各微電極陣列與外殼底部對應(yīng)引腳相連，將導(dǎo)管插入進樣口和出 樣口，最后用硅玻璃片將微電極陣列芯封裝在外殼內(nèi)，形成密閉的微通道。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種基于絕緣體上硅結(jié)構(gòu)的連續(xù)流細胞電融合芯片及其加工工藝，它由外殼、固定于外殼內(nèi)的微電極陣列芯片、連通外殼內(nèi)外的進出樣導(dǎo)管和封裝在外殼表面的硅玻璃片組成；所述微電極陣列芯片從下至上依次由硅質(zhì)基底層、二氧化硅絕緣層、低阻硅電極層和二氧化硅保護膜構(gòu)成，采用微加工技術(shù)在絕緣體上硅材料的低阻硅電極層上刻蝕凹槽至二氧化硅絕緣層形成微電極結(jié)構(gòu)，外界電信號借助微通道的微尺度和排布，可在其內(nèi)部形成足夠強度的梯度電場，提高細胞電融合效率。同時，該芯片上構(gòu)造的直線型微通道有助于細胞懸浮液的流動，盡可能低的降低細胞在流動過程中的黏附，開展連續(xù)流的細胞電融合實驗，可近似于提供無限量的融合后細胞。
文檔編號C12M1/42GK101368155SQ20081007033
公開日2009年2月18日 申請日期2008年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月19日
發(fā)明者侯文生, 斌 夏, 濤 徐, 毅 曹, 軍 楊, 靜 楊, 羅洪艷, 寧 胡, 蓉 許, 鄭小林 申請人:重慶大學(xué)