專利名稱：單細(xì)胞藻粒度分析微流控芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用庫爾特原理設(shè)計制作的粒度分析儀器，更具體地說是一種用于海洋單細(xì)胞藻粒度分析的微流控芯片。
背景技術(shù)：
微全分析系統(tǒng)(Micro-total analysis system，μ-TAS)概念的提出在分析科學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)生了重大影響，引導(dǎo)化學(xué)分析設(shè)備向著微型化、集成化與便攜化的趨勢發(fā)展。它利用微加工工藝在芯片上制作微閥、微管道、微反應(yīng)器、微流量傳感器、微檢測器等功能單元構(gòu)成微型化學(xué)系統(tǒng)。微流控芯片系統(tǒng)具有高效、低耗、微型化和集成化的特點，適于各類現(xiàn)場分析和實時測定。1995年Mathies和Woolley首次采用微電泳芯片進(jìn)行了DNA測序研究，在有效分離長度3.5cm的通道上，10min內(nèi)測序約150個堿基，準(zhǔn)確率97％。1998年Ramsey等在微流控芯片上集成了細(xì)胞消解、PCR擴(kuò)增和電泳分離等功能的微芯片基因分析系統(tǒng)。
庫爾特粒度分析儀的原理(Coulter Principle)懸浮在電解液中的細(xì)胞或顆粒，隨電解液通過小孔管時，因取代了相同體積的電解液，在恒電流設(shè)計的電路中導(dǎo)致小孔管內(nèi)外兩電極間電阻發(fā)生瞬時變化，而產(chǎn)生了電位脈沖，脈沖信號的大小和次數(shù)與顆粒的大小和數(shù)目成正比。庫爾特原理屬于對顆粒個體三維的測量，因此，不但能準(zhǔn)確測量細(xì)胞或顆粒的粒徑分布，更能作細(xì)胞或粒子絕對數(shù)目和濃度的測量，其所測粒徑更接近真實。庫爾特計數(shù)儀在單細(xì)胞藻、培養(yǎng)細(xì)胞、血球等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用(Ray，2001；Arakawa et al，1997)。
但目前的庫爾特計數(shù)儀價格昂貴，體積較大，不適用于現(xiàn)場分析，微流控芯片的出現(xiàn)為庫爾特技術(shù)的現(xiàn)場應(yīng)用提供了可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種微型、便攜且適于現(xiàn)場分析的對海洋單細(xì)胞藻進(jìn)行計數(shù)和粒徑分布測定的微流控芯片。
本發(fā)明是以標(biāo)準(zhǔn)光刻技術(shù)為基礎(chǔ)，以玻璃為微流控芯片材料，在芯片上構(gòu)建微通道和微儲液池，使樣品的進(jìn)樣、檢測集成在芯片上來完成。微流控芯片包括結(jié)構(gòu)對稱的基片和蓋片，在基片和蓋片上構(gòu)建有包括液流系統(tǒng)和與樣品通道垂直相交的雙“T”型檢測通道。液流系統(tǒng)采用ψ型結(jié)構(gòu)，中間通道為樣品通道，兩側(cè)支通道稱為鞘流通道，鞘流通道的作用是樣品中的藻細(xì)胞以單行排列，樣品通道與鞘流通道尺寸一致，鞘流通道為1/4圓弧狀，樣品通道與鞘流通道端點切線方向相一致，這樣，鞘流與樣品流同向匯合，避免液流匯合產(chǎn)生渦流擾動，保證了液流系統(tǒng)的穩(wěn)定性；樣品通道與鞘流通道的末端分別構(gòu)建有儲液池，樣品通道的另一端還有一廢液池；在芯片上構(gòu)建與進(jìn)樣通道垂直相交的雙“T”型檢測通道，檢測通道設(shè)計成半啞鈴形，相交部分細(xì)而短(橫截面尺寸與樣品通道一致)，外側(cè)寬度大，檢測通道的電阻主要是來自細(xì)通道的貢獻(xiàn)，因而細(xì)胞通過而產(chǎn)生的電阻變化才會明顯，從而提高檢測靈敏度。在檢測通道兩側(cè)安置電極，使用恒電流檢測系統(tǒng)，細(xì)胞通過檢測通道與樣品通道的共用區(qū)域時，會取代與其相等體積的電解液，導(dǎo)致兩電極之間電阻呈現(xiàn)暫時性改變，電位差發(fā)生相應(yīng)改變產(chǎn)生脈沖信號，由脈沖的次數(shù)和強(qiáng)度來計算細(xì)胞數(shù)目和粒徑。
本發(fā)明將庫爾特液流系統(tǒng)和電極集成，體現(xiàn)了微流控芯片系統(tǒng)的微型化和集成化的特點，適于各類現(xiàn)場分析和實時測定。廣泛應(yīng)用于單細(xì)胞藻、培養(yǎng)細(xì)胞、血球等領(lǐng)域。
本發(fā)明的微流控芯片的設(shè)計和制作方法如下所述A.將根據(jù)微流控芯片結(jié)構(gòu)設(shè)計的芯片圖形制成掩膜，圖形區(qū)為透明區(qū)，可透射光，非圖形區(qū)為黑色區(qū)，吸光而不能透射光。
B.將掩膜覆蓋在63mm×63mm×1.5mm的勻膠鉻板(鉻型LRC；鉻厚T145nm膠類正性感光膠；膠厚570nm)上，在紫外線照射下曝光，感光膠發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)。
C.曝光后的鉻板在顯影液中顯影，以除去被曝光的正性感光膠，掩膜上的圖形被復(fù)制到光膠層上。
D.室溫下用鉻膜刻蝕液(硫酸鈰∶高氯酸∶水＝50克∶15毫升∶300毫升)腐蝕裸露的鉻膜，高純水沖洗干凈后，烘干。光膠層上的圖形被轉(zhuǎn)移到了基片上，同時保證非圖形區(qū)的光膠層和鉻膜不被破壞。
E.濕法刻蝕微通道。以0.5M HF/0.5M NH4F為刻蝕劑刻蝕微通道，速率約為10μm/h，得橫截面為梯形的凹微通道。再依次用丙酮和鉻膜刻蝕液除去殘存的光膠層和鉻膜，用高純水沖洗干凈即得干凈透明的基片。
F.在基片的儲液池位置用微型臺鉆處打孔，作為芯片出入口。
G.截取與基片同樣尺寸的勻膠鉻板，依次用丙酮、鉻膜刻蝕液浸泡2分鐘，以除去光膠層和鉻膜，高純水沖洗干凈即得蓋片。
H.將基片與蓋片依次在丙酮、H2O-H2O2-NH4OH(5∶1∶1)溶液、H2SO4∶H2O2(4∶1)溶液和高純水中超聲清洗5-10分鐘，氮氣吹干，然后在超凈環(huán)境中將兩者對齊密封。高溫下鍵合，升溫程序為以40℃/min從室溫升至550℃，時間30分鐘；以20℃/min從550℃升至610℃，時間30分鐘；以20℃/min從610℃升至635℃，時間30分鐘；以10℃/min從635℃升至650℃，時間6小時；然后自然冷卻到室溫。
本發(fā)明在利用庫爾特基本原理設(shè)計制作的微流控芯片上構(gòu)建了實現(xiàn)庫爾特技術(shù)所需的液流系統(tǒng)和檢測通道，實現(xiàn)了庫爾特粒度分析系統(tǒng)的微型化、集成化和簡單化；制造成本低，易于實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)模化生產(chǎn)。


圖1是本發(fā)明的微流控芯片的結(jié)構(gòu)示意圖。
其中，1-樣品入口；2，3-鞘流入口；4，5-電極池；6-廢液池；7-樣品通道；8，9-鞘流通道；10-通道交匯點；11-雙T型檢測通道。
圖2是單細(xì)胞藻粒度分析芯片系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖。
其中，12，13-微型泵；14-恒電流系統(tǒng)；15，16-鞘流；17-樣品。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖并通過具體實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。
實施例1微流控芯片的結(jié)構(gòu)如圖1所示，微流控芯片結(jié)構(gòu)分兩部分液流系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。液流系統(tǒng)采用ψ型結(jié)構(gòu)，中間通道為樣品通道7，兩側(cè)支通道為鞘流通道8和9，鞘流通道的作用是使樣品中的藻細(xì)胞呈單行排列，樣品通道7與鞘流通道8和9尺寸一致，鞘流通道為1/4圓弧狀，鞘流通道8和9在交匯點10的切線方向與樣品通道7方向相一致，這樣，鞘流與樣品流同向匯合，避免液流匯合產(chǎn)生渦流擾動，保證了液流系統(tǒng)的穩(wěn)定性；在芯片上構(gòu)建與樣品通道垂直相交的雙“T”型檢測通道11，檢測通道設(shè)計成半啞鈴形，與樣品通道7相連部分細(xì)而短，外側(cè)寬度大，檢測通道11與樣品通道7的共用通道長度設(shè)計為150-200μm，這樣，檢測通道的電阻主要是來自細(xì)通道的貢獻(xiàn)，因而細(xì)胞通過而產(chǎn)生的電阻變化才會明顯。在檢測通道兩端的電極池4和5處安置電極，使用恒電流檢測系統(tǒng)，細(xì)胞通過檢測通道與樣品通道的共用區(qū)域時，會取代與其相等體積的電解液，導(dǎo)致兩電極之間電阻呈現(xiàn)暫時性改變，電位差發(fā)生相應(yīng)改變產(chǎn)生脈沖信號，由脈沖的次數(shù)和強(qiáng)度來計算細(xì)胞數(shù)目和粒徑。
實施例2微流控芯片的制作1.玻璃基片的制作掩膜膠片上微通道的尺寸設(shè)計流體通道，30μm；檢測通道，30μm，300μm，寬部長5mm，窄部長0.2mm；共用通道長0.35mm。將掩膜膠片置于63mm×63mm×1.5mm的勻膠鉻板上，紫外線曝光180秒(波長365nm)，顯影液中顯影100秒后，100℃下烘干半小時。在室溫下用鉻膜刻蝕液(硫酸鈰∶高氯酸∶水＝50克∶15毫升∶300毫升)腐蝕鉻膜，然后用高純水沖洗干凈，烘干。通過數(shù)碼顯微鏡攝像，測得鉻板上的通道尺寸為樣品通道，40μm；檢測通道，40μm，310μm。用0.5M HF/0.5M NH4F刻蝕劑腐蝕裸露的硼硅玻璃，速率約為10μm/h，刻蝕7小時后，再依次用丙酮、鉻膜刻蝕液除去殘余光膠層和鉻膜，即得基片。用微型臺鉆打孔，鉆頭為1mm的金剛鉆頭，孔的直徑即為儲液池直徑1mm。顯微鏡下測定微通道尺寸樣品通道，上底寬180μm，下底寬50μm，深度70μm；檢測通道，寬部上底寬450μm，下底寬320μm，深度70μm；共用通道長約200μm2.蓋片的制作與基片制作方法相同，構(gòu)造相同，但不打孔。
3.將基片與蓋片依次在丙酮、H2O-H2O2-NH4OH(5∶1∶1)溶液、H2SO4∶H2O2(4∶1)溶液和高純水中超聲清洗5-10分鐘，用氮氣吹干，然后在超凈環(huán)境中將兩者對齊密封，高溫下鍵合。升溫程序為以40℃/min從室溫升至550℃，時間30分鐘；以20℃/min從550℃升至610℃，時間30分鐘；以20℃/min從610℃升至635℃，時間30分鐘；以10℃/min從635℃升至650℃，時間6小時。然后自然冷卻到室溫。經(jīng)顯微鏡下觀測，鍵合后通道無變形，且達(dá)到完全密封。鍵合后的芯片通道橫截面呈橢圓形，樣品通道和檢測通道窄部長軸長約為180μm，窄軸長約為140μm，檢測通道寬部長軸長約450μm，短軸長約140μm；共用通道長約200μm實施例3微流控芯片分析檢測系統(tǒng)如圖2所示，在樣品通道7的進(jìn)口1接進(jìn)樣泵13，兩側(cè)鞘流通道8和9在其入口2和3處接鞘流15，16，在檢測通道11兩端4，5安置電極并接在一恒電流計上，構(gòu)成整個微流控芯片分析檢測系統(tǒng)。樣品和鞘流液通過泵12和13輸送，鞘流液以相同的流速流動，鞘流液與樣品匯合后以層流的形式向前流動，通過調(diào)節(jié)鞘流和樣品流速，使樣品中細(xì)胞呈單行排列，并向前移動通過檢測區(qū)(檢測通道和樣品通道的共用區(qū)域)，在檢測區(qū)域細(xì)胞取代了等體積的電解液，導(dǎo)致兩電極之間電阻呈現(xiàn)暫時性的改變，由于檢測系統(tǒng)是恒電流設(shè)計，故電位差也暫時性的改變產(chǎn)生脈沖信號，根據(jù)脈沖信號的次數(shù)和強(qiáng)度可以對細(xì)胞的數(shù)目和粒徑進(jìn)行統(tǒng)計分析。
權(quán)利要求
1.一種單細(xì)胞藻粒度分析微流控芯片，其特征在于它包括結(jié)構(gòu)對稱的基片和蓋片，在基片和蓋片上構(gòu)建有包括中間樣品通道和兩側(cè)道鞘流通道的ψ型結(jié)構(gòu)的液流系統(tǒng)和與樣品通道垂直相交的雙T型檢測通道。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征在于所述的鞘流通道為1/4圓弧狀，樣品通道與鞘流通道通端點切線方向相一致。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征在于所述的檢測通道設(shè)計成半啞鈴形，與樣品通道相連部分細(xì)而短，外側(cè)寬度大。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征在于它是以玻璃為材料制作的。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種單細(xì)胞藻粒度分析微流控芯片，它包括結(jié)構(gòu)對稱的基片和蓋片，在基片和蓋片上構(gòu)建有包括中間樣品通道和兩側(cè)道鞘流通道的ψ型結(jié)構(gòu)的液流系統(tǒng)和與樣品通道垂直相交的雙T型檢測通道；在檢測通道兩側(cè)安置電極，使用恒電流檢測系統(tǒng)。在細(xì)胞通過檢測通道與樣品通道的共用區(qū)域時，會取代與其相等體積的電解液，導(dǎo)致兩電極之間電阻呈現(xiàn)暫時性改變，電位差發(fā)生相應(yīng)改變產(chǎn)生脈沖信號，由脈沖的次數(shù)和強(qiáng)度來計算細(xì)胞數(shù)目和粒徑。本發(fā)明將庫爾特液流系統(tǒng)和電極集成，體現(xiàn)了微流控芯片系統(tǒng)的微型化和集成化的特點，適于各類現(xiàn)場分析和實時測定。廣泛應(yīng)用于單細(xì)胞藻、培養(yǎng)細(xì)胞、血球等領(lǐng)域。
文檔編號G01N15/10GK1712927SQ20051004385
公開日2005年12月28日 申請日期2005年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月19日
發(fā)明者王修林, 蘇榮國, 韓秀榮 申請人:中國海洋大學(xué)