一株海洋擬雙孢藻及其應用和培養(yǎng)方法
【技術領域】
[0001]發(fā)明屬于生物能源領域，涉及一種海洋擬雙孢藻及其應用，更具體地，本發(fā)明涉及一株新的海洋擬雙孢藻藻株，其油脂含量高，可用于制備生物柴油、飼料或食用油。
【背景技術】
[0002]由于地球上的化石能源儲量正日益減少，石油資源很有可能會在短時間內便迅速枯竭?；茉吹奶N藏量并不是無窮無盡的，易于開采和利用的化石能源儲量已經所剩無幾，剩余儲量因為開發(fā)難度越來越大，從而失去繼續(xù)開采的價值。在世界能源消費以石油為主導的情況下，如果能源消費結構仍不變化，那么就會發(fā)生新一代的能源危機。煤炭資源雖比石油資源儲存量要大，但也不是取之不盡用之不竭的。目前除了煤炭之外，能夠大規(guī)模利用開發(fā)的能源還是很少。雖然太陽能的資源是取之不竭源源不斷的，但因其開發(fā)利用所耗成本高昂，所以在短時間內仍不可能迅速發(fā)展得到廣泛應用。
[0003]因此人類必須及時找到一種可以代替非再生礦物能源的新能源，從而將注意力轉移到新的能源結構上，盡早探索、研究開發(fā)利用新能源資源，這樣才能讓人類的生活在安定和諧的情況下持續(xù)發(fā)展下去，而生物柴油正好可以將此問題解決。像生物柴油這種可再生的碳中性能源，有利于環(huán)境和經濟的可持續(xù)發(fā)展。目前的研究也表明了微藻是能夠完全替代化石柴油的唯一生物柴油。生物柴油和化石燃料本質上都來源于光合作用產物。綠色植物進行光合作用，將水、二氧化碳和其他無機物依靠光能合成各種有機物并釋放出氧氣，動物和微生物才能生長繁殖。各種生物的油脂都是從植物合成的有機物轉化來的。任何形式的來自動物、植物和微生物的脂肪酸都能用作生物柴油的原料。因此，油脂含量高的藻種才是制備生物柴油的最重要原料。
[0004]利用微藻加工制備生物柴油的關鍵，一是提高原始藻種的油脂含量，二是通過優(yōu)化培養(yǎng)盡可能提高微藻細胞的油脂含量。在單細胞微藻的培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基成分、溫度、光照強度、pH、培養(yǎng)方式、通氣量、鹽度等均會影響微藻的生長以及其脂肪酸的含量與組成。溫度、光強能影響微藻的光合作用和呼吸作用，從而對其生長及體內生化成分產生影響。微藻具有生長速率快、收獲時期短、光合利用率高等特點，利用微藻作為生物柴油原材料有很高的應用前景。高油脂含量、高生長速率的藻株是該環(huán)節(jié)的關鍵步驟。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術問題是:第一是提供一種海洋擬雙孢藻新種；第二是提供海洋擬雙孢藻在生物柴油生產中的應用；第三是在于該新種存在種內的內含子存在/缺失多樣性，可以作為研究內含子進化的模式生物；第四在于提供上述擬雙孢藻的培養(yǎng)方法。
[0006]為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案是:
一種海洋擬雙孢藻，從黃海海水中分離得到的，分類命名為海洋擬雙孢藻Amphikrikosmarinus，于2014年10月22日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏登記號為CGMCC N0.9814。所述擬雙孢藻的采集方法為浮游植物脫網；分離方法采用微吸管吸取、逐級稀釋分離及平板涂布法。
[0007]培養(yǎng)方法，其具體操作步驟如下:在海水F/2培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)微藻，初始接種密度為IX 15個.mL'置于光暗比為14h: 1h,光照強度為llOOlux，溫度為25°C，相對濕度為70% -80%的人工氣候箱中培養(yǎng)1-3周，離心海洋擬雙孢藻藻液。收獲擬雙孢藻。
[0008]優(yōu)選的，在相對濕度為70% -80%的人工氣候箱中培養(yǎng)2周。
[0009]上述的F/2培養(yǎng)基中每IL海水中含有以下物質:NaN03:75毫克；NaH2P04.H2O:5毫克；Na2Si03.9H20:20 毫克；Na2EDTA:4.36 毫克；FeCl3.6H20:3.16 毫克；CuSO4.5H20:0.01 毫克；ZnSO4.7H20:0.023 毫克；CoCL2.6H20:0.012 毫克；MnCL.4H20:0.18 毫克;Na2M0O4.2H20:0.07毫克；維生素B1:0.1微克；維生素B12:0.5微克；生物素:0.5微克。
[0010]所述的海洋擬雙孢藻在作為研究內含子進化的模式生物上的應用。
[0011]本發(fā)明的有益效果:
與其他作為生物柴油原料的藻種相比，本發(fā)明的海洋擬雙孢藻具有很高的油脂含量及生長速率，可以有效降低生物柴油的生產成本。
【附圖說明】
[0012]下面結合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細的說明。
[0013]圖1是本發(fā)明的海洋擬雙孢藻電鏡照片及Bodipy染色照片。
[0014]圖2是本發(fā)明的海洋擬雙孢藻的進化樹。
【具體實施方式】
[0015]實施例1
一種海洋擬雙孢藻，從黃海海水中分離得到的，分類命名為海洋擬雙孢藻Amphikrikosmarinus，于2014年10月22日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏登記號為CGMCC N0.9814。所述擬雙孢藻的采集方法為浮游植物脫網；分離方法采用微吸管吸取、逐級稀釋分離及平板涂布法。
[0016]培養(yǎng)方法，其具體操作步驟如下:在海水F/2培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)微藻，初始接種密度為IX 15個.mL'置于光暗比為14h: 1h,光照強度為llOOlux，溫度為25°C，相對濕度為70% ~80%的人工氣候箱中培養(yǎng)2周，離心海洋擬雙孢藻藻液。收獲擬雙孢藻。
[0017]上述的F/2培養(yǎng)基中每IL海水中含有以下物質:NaN03:75毫克；NaH2P04.H2O:5毫克；Na2Si03.9H20:20 毫克；Na2EDTA:4.36 毫克；FeCl3.6H20:3.16 毫克；CuSO4.5H20:
0.01 毫克；ZnSO4.7H20:0.023 毫克；CoCL2.6H20:0.012 毫克；MnCL.4H20:0.18 毫克;Na2M0O4.2H20:0.07毫克；維生素B1:0.1微克；維生素B12:0.5微克；生物素:0.5微克。
[0018]總脂測定方法:將離心收集的藻泥置于真空冷凍干燥機進行冷凍干燥，直至徹底干燥成藻粉。用電子天平稱取約40毫克干燥好的藻粉，小心加入到干凈的徹底烘干的密封性好的螺口玻璃試管(1mL)中，并記錄下藻粉的質量叫。向螺口管中小心加入2mL氯仿、ImL甲醇。劇烈震蕩lOmin，避免液體從螺口管中濺出。離心4000g，lOmin。吸取上清至新的干凈玻璃管中。重復②，③。并將上清合并到同一個玻璃管中。向裝有上清的玻璃管中加入1/5體積的NaCl溶液(0.9%),劇烈震蕩lOmin，室溫靜置30min以促進分層。用ImL注射器徹底地吸取最下面的氯仿層于新的空玻璃管中(提前稱重，記為m2)。將玻璃管置于50°C水浴鍋中烘干，待氯仿揮發(fā)之后再放入電熱恒溫鼓風干燥箱中干燥。最后稱取玻璃管的重量,記為m3。計算總脂重量?？傊?%) = (m3- m2)/ Iii1。
[0019]恒溫光照箱中進行靜置培養(yǎng)后(未通二氧化碳)，該藻的生物量可達到0.8g/L。通過重量法對進入平臺期的微藻油脂含量按照上述方法進行測定，結果表明該藻的油脂含量占到干重的50%以上。在未添加任何促油脂合成物質及未進行脅迫處理的條件下，生物量、油脂含量達到如此水平是異常罕見的。
[0020]對本實施例中的海洋擬雙孢藻進行電鏡和Bodipy染色，結果見圖1。圖1可以看出，胞內多含有1-2個油脂滴，且體積異常龐大，甚至能占到整個細胞的80%以上；充分說明該藻種細胞內油脂含量豐富。
[0021]選取卵囊藻科物種序列，使用Mega4.0軟件，采用鄰接法構建進化樹。具體結果見圖2。DH32是海洋擬雙孢藻的編號,從進化樹上可以看出該藻與sp.聚為一支，表明該藻屬于擬雙孢藻屬。
【主權項】
1.一株海洋擬雙孢藻，分類命名為海洋擬雙孢藻Amphikrikos marinus,于2014年10月22日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏登記號為CGMCCN0.9814。
2.權利要求1所述的海洋擬雙孢藻在制備生物柴油，飼料或食用油上的應用。
3.權利要求1所述的海洋擬雙孢藻在作為研究內含子進化的模式生物上的應用。
4.一種海洋擬雙孢藻的培養(yǎng)方法，其特征在于，操作步驟如下:在海水F/2培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)微藻，初始接種密度為IXlO5個.mL ―1，置于光暗比為14h: 10h，光照強度為llOOlux，溫度為25°C，相對濕度為70% -80%的人工氣候箱中培養(yǎng)1_3周，離心海洋擬雙孢藻藻液，收獲海洋擬雙孢藻。
5.根據權利要求4所述的海洋擬雙孢藻的培養(yǎng)方法，其特征在于，在相對濕度為70%~80%的人工氣候箱中培養(yǎng)2周。
6.根據權利要求4所述的海洋擬雙孢藻的培養(yǎng)方法,其特征在于，F/2培養(yǎng)基中每IL海水中含有以下物質:NaN03:75毫克；NaH2P04.H2O:5毫克；Na2Si03.9H20:20毫克；Na2EDTA:4.36 毫克；FeCl3.6H20:3.16 毫克；CuSO4.5H20:0.01 毫克；ZnSO4.7H20:0.023毫克；CoCL2.6H20:0.012 毫克；MnCL.4H20:0.18 毫克；Na2M0O4.2H20:0.07 毫克；維生素BI:0.1微克；維生素B12:0.5微克；生物素:0.5微克。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株海洋擬雙孢藻及其應用和培養(yǎng)方法，從黃海海水中分離得到的，分類命名為海洋擬雙孢藻Amphikrikos？marinus，于2014年10月22日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏登記號為CGMCC？No.？9814。所述擬雙孢藻的采集方法為浮游植物脫網；分離方法采用微吸管吸取、逐級稀釋分離及平板涂布法。本發(fā)明的有益效果：與其他作為生物柴油原料的藻種相比，本發(fā)明的海洋擬雙孢藻具有很高的油脂含量及生長速率，可以有效降低生物柴油的生產成本。CGMCCNo.98142014.10.22
【IPC分類】C12R1-89, C12N1-12, C12P7-64
【公開號】CN104560720
【申請?zhí)枴緾N201410759402
【發(fā)明人】韓吉昌, 張琳, 王松, 潘克厚
【申請人】中國海洋大學
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年12月12日