一種利用重組大腸桿菌高效生產(chǎn)角蛋白酶的發(fā)酵方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用重組大腸桿菌高效生產(chǎn)角蛋白酶的發(fā)酵方法，屬于發(fā)酵工程 領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 角蛋白酶（Keratinase)為一種可以特異性降解角蛋白的酶類，由真菌、放線菌和 細(xì)菌等多種微生物產(chǎn)生。角蛋白酶在食品、醫(yī)藥、飼料、精化和制革等工業(yè)中廣泛應(yīng)用，具有 嫩化肉類、生產(chǎn)高級(jí)營養(yǎng)品、免疫制劑和飼料添加劑以及美容、軟化皮革等作用，并可導(dǎo)致 瘋牛病和人類克雅氏癥的阮蛋白（Prion)的降解。
[0003] 目前已經(jīng)報(bào)道的角蛋白酶基因主要來自國外的一株地衣芽胞桿菌的kerA基因。 雖然角蛋白酶有著巨大的應(yīng)用和研究價(jià)值，但是從野生菌發(fā)酵制備角蛋白酶產(chǎn)量低，活性 不穩(wěn)定，大大降低了角蛋白酶的開發(fā)和運(yùn)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明將來自嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia)BBEll_l的角 蛋白酶進(jìn)行分子改造，獲得一種新的高活性的角蛋白酶并對其基因序列在大腸桿菌中高效 分泌表達(dá)，然后通過一系列的培養(yǎng)優(yōu)化，確定其在3L發(fā)酵罐中的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵培 養(yǎng)策略，獲得角蛋白酶高產(chǎn)。這對角蛋白酶的規(guī)模化生產(chǎn)及推廣具有深遠(yuǎn)的技術(shù)指導(dǎo)意義。
[0005] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種高活性角蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0. 4 所示。
[0006] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述角蛋白酶的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供表達(dá)權(quán)利要求1所述角蛋白酶的基因工程菌或細(xì)胞 系。
[0008] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述基因工程菌以E.coli BL21(DE3)為宿主、 pET22b(+)為表達(dá)載體，表達(dá)SEQIDN0.4所示的角蛋白酶。
[0009] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述角蛋白酶基因連接在pET22b(+)的Ncol和Xhol 位點(diǎn)之間。
[0010] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述基因工程大腸桿菌的構(gòu)建方法，具體方案如 下：
[0011] (1)根據(jù)來自嗜麥芽窄食單胞菌（S.maltophilia)BBEll-l的一種角蛋白酶的多 次分子改造獲得的一種活性較高突變體的基因，設(shè)計(jì)引物克隆獲得，或者通過化學(xué)合成獲 得基因；氨基酸序列如SEQ ID N0. 4所示；
[0012] (2)將該基因連入pET22b(+)質(zhì)粒，雙酶切位點(diǎn)為Ncol和Xhol，得到重組表達(dá)載 體；
[0013] (3)將該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得具有高效分泌角蛋白 酶的重組大腸桿菌。
[0014] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種高效生產(chǎn)角蛋白酶的方法。
[0015] 所述方法是以表達(dá)SEQ ID N0. 4所示的角蛋白酶的基因工程菌為生產(chǎn)菌株，在發(fā) 酵罐上采用溶氧偶聯(lián)的補(bǔ)料方式獲得高密度菌體并高效誘導(dǎo)產(chǎn)角蛋白酶。
[0016] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述基因工程菌以E.coli BL21(DE3)為宿主、 pET22b(+)為表達(dá)載體，表達(dá)氨基酸序列為SEQIDN0.4所示的角蛋白酶。
[0017] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法是將基因工程菌活化后接種至含有氨芐青 霉素的發(fā)酵罐基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，通過溶氧值與補(bǔ)料偶聯(lián)的流加策略，于37°C培養(yǎng)至0D_ = 30,然后降溫至20°C培養(yǎng)并加入最終濃度0. 2mM的誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)，發(fā)酵48h時(shí)離心獲得 上清酶液，即為粗酶液。
[0018] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵罐基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有g(shù)lycerol 8g/L、 (NH4)2HP04 5g/L、K2HP04 3g/L、NaH2P04 · 12H20 7g/L、sodium citrate 3g/L、MgS04 1. 5g/ L、2mL 微量元素，pH 7. 2 ;微量元素，按 g/L 計(jì)，含有：FeS04 · 7H20 10 ;ZnS04 · 7H20 5. 25 ; CuS04 · 5H20 3 ；MnS04 · 4H20 0. 5 ；Na2B407 · 10H20 0. 23 ；CaCl2 2 ； (NH4)6M〇7024 0. 1 ；
[0019] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述溶氧值與補(bǔ)料偶聯(lián)是指補(bǔ)加流加培養(yǎng)基并控制 溶氧值不大于30且不小于10。
[0020] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述補(bǔ)料是流加培養(yǎng)基中含有甘油200g/L、酵母粉 5g/L、MgS04 10g/L。
[0021] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法在發(fā)酵罐的流加培養(yǎng)過程中，控制發(fā)酵液 pH 為 7. 0-7. 2。
[0022] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵是在3L發(fā)酵罐上進(jìn)行，3L發(fā)酵罐的發(fā)酵條 件：初始培養(yǎng)溫度37°C，接種量2%，攪拌速度400-800rpm，初始裝液量1L，通氣量lvvm。
[0023] 本發(fā)明還要求保護(hù)所述角蛋白酶和所述基因工程菌在食品、飼料、化工、制革或者 制備藥物方面的應(yīng)用，尤其是在制備日化洗滌產(chǎn)品、在皮革領(lǐng)域或者在飼料消化中的應(yīng)用。
[0024] 本發(fā)明的有益效果：
[0025] 本發(fā)明構(gòu)建了一株可以高效分泌高活性角蛋白酶的重組大腸桿菌，并實(shí)現(xiàn)其在搖 瓶或者發(fā)酵罐中生產(chǎn)制備角蛋白酶。本發(fā)明的重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)的角蛋白酶酶活可達(dá) 4500U/mL(發(fā)酵時(shí)間48h)。本發(fā)明的角蛋白酶制劑，在洗滌、紡織、飼料消化、醫(yī)藥等領(lǐng)域具 有很好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0026] 圖1 :原始角蛋白酶重組大腸桿菌和本發(fā)明角蛋白酶重組菌的搖瓶發(fā)酵對比。
[0027] 圖2 :大腸桿菌的恒速碳源補(bǔ)料法發(fā)酵生產(chǎn)角蛋白酶；
[0028] 圖3 :大腸桿菌的與D0值偶聯(lián)的變速補(bǔ)料法產(chǎn)角蛋白酶。
【具體實(shí)施方式】 [0029] 培養(yǎng)基：
[0030] (1)種子培養(yǎng)基（g/L):酵母粉5,蛋白胨10, NaCl 10,瓊脂20 (固體培養(yǎng)基）， 121°C滅菌15min，氨芐青霉素終濃度100yg/mL。
[0031] (2)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：glycerol 8g/L，（NH4)2HP04 5g/L，K2HP04 3g/L， NaH2P04· 12H20 7g/L，sodium citrate 3g/L，MgS04 1.5g/L，2mL 微量元素，氨節(jié)青霉素終 濃度 100 μ g/mL，pH 7. 2 ;微量元素（g/L) :FeS04 · 7H20 10 ;ZnS04 · 7H20 5. 25 ;CuS04 · 5H20 3 ;MnS04 · 4H20 0· 5 ;Na2B407 · 10H20 0· 23 ;CaCl2 2 ; (NH4)6Mo7024 0· 1。
[0032] (3)流加培養(yǎng)基是：甘油200g/L，酵母粉5g/L，MgS04 lOg/L ;
[0033] 角蛋白酶酶活測定方法：
[0034] (1)原理：角蛋白酶水解角蛋白底物，釋放出酪氨酸，通過酪氨酸與福林酚顯色， 在660nm下測定吸光度值。吸光值的大小直接與酶活力的高低成正比。
[0035] ⑵測定步驟：0. lmL經(jīng)適當(dāng)稀釋的酶液，加入0. lmL的1 % (w/v)可溶性角蛋白 底物（使用前和〇. lmol/L的pH9. 0的Gly-NaOH緩沖液混合），在50°C反應(yīng)20min，每個(gè)反 應(yīng)樣品中加入〇. 2mLTCA反應(yīng)終止蛋白沉淀劑，搖勻后10, 000r/min離心5min，取0. 2mL上 清液加入lmL的4% (w/v)Na2C03，再加入0. 2mL上海生工公司購買的福林酸試劑（預(yù)先稀 釋3倍）在50°C下反應(yīng)15分鐘。使用0. 5cm的石英比色杯測定清液在660nm處的吸光值。 空白對照是在加入底物之前已經(jīng)加入同等體積的TCA終止酶活，其他步驟相同。酶活定義 為每毫升酶液每分鐘釋放出多少微克酪氨酸。
[0036] 實(shí)施例1高效分泌角蛋白酶能力的重組大腸桿菌的構(gòu)建
[0037] (1)根據(jù)本實(shí)驗(yàn)多次分子改造獲得的一種高活性角蛋白酶突變體的基因序列模 版SEQ ID N0. 1，或通過化學(xué)合成得到模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性5min 后進(jìn)入一下循環(huán)：98°C變性10s，55°C退火10s，72°C延伸7min 50s，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸 lmin50s，然后再降溫到12°C得到最終反應(yīng)液。使用的DNA擴(kuò)增酶為TaKaRa公司的Primer STAR，使用配方參照產(chǎn)品說明書。
[0038] ⑵將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物和pET22b⑴質(zhì)粒用Ncol和Xhol內(nèi)切酶處理，得到粘性 末端的DNA序列，再使用DNA連接酶在16°C下連接過夜。
[0039] (3)將連接液直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含100mg/